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摘 要：以芹菜叶为原料，采用烫漂护色及热风干燥工艺，以叶绿素保存量及感官评定值为考察指标，研究不同烫漂温度、烫漂时间、干燥温度对脱水芹菜叶品质的影响，确定芹菜叶热风干制最佳干制条件。结果表明：芹菜叶在95℃恒温水浴锅中烫漂60s，并在50℃的恒温干燥箱中干制成成品的品质最佳。
关键词：芹菜叶；干制；护色；叶绿素
1引言
五味子为常用滋补性中药，其味酸、甘，性温和，且有收敛固涩、益气生津与补肾宁心等功能。五味子在中医临床中应用广泛，而且也多用于保健食品的配方中，真正做到药食同源的一味中药。通过对其化学成分和药理活性研究发现，五味子中的木脂素类化合物为其有效成分之一，主要有五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙等。市场上有关五味子的植物提取物、中药和保健食品的产品，名目繁多，质量参差不齐。目前该类产品的质量控制多采用薄层法或高效液相色谱法测定其中部分成分的含量，大多数方法只测定其中1～2个成分的含量【1-2】。为了更好的评价和控制产品的质量，我们建立了同时测定含五味子保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种主要成分的含量测定方法，并取得了满意的效果。
五味子醇甲、五味子甲素和乙素为重要的护肝降酶有效成分。本实验建立了高效液相色谱法同时测定五味子中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的含量，并对检测结果进行不确定度评定，分析了误差来源，确定了测定结果的置信区间。
2材料和方法
仪器：Agilent1200高效液相色谱仪四元泵，自动进样器，MWD检测器，ChemSation工作站；电子分析天平：1712mp8型，德国赛多利斯公司；KQ-500TDE型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。五味子醇甲，批号：110857-200507；五味子甲素，批号：110764-200408；五味子乙素，批号110765-200508，对照品购自中国药品生物制品检验所；五味子：购于市场，实验室自制成紫红色粉末；甲醇，分析纯，北京化工厂；水为纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；甲醇，色谱纯，美国迪马公司。
实验操作及条件
对照品溶液的制备 用分度值0.1mg天平精密称取五味子醇甲对照品0.0012g，甲素0.0026g，乙素0.0018g置于25ml容量瓶中，加甲醇放置超声波中使其溶解，放置室温，加甲醇至刻度制成工作液。
供试液制备和测定 取五味子粉末2g左右，放入25ml容量瓶中，加甲醇置于超声波中超声30min，放置室温后用甲醇定容，摇匀，即得。
色谱条件：Agilent XDB-C18柱（250mm×4.6mm，5um），流动相：甲醇：水=70：30，流速1.0ml/min，柱温：26℃，检测波长：254nm.在选定的条件下，五味子醇甲、甲素、乙素和样品中其他组分都能达到很好的分离。
实验条件：实验室温度为（20±5）℃；容量瓶、吸管等玻璃量器符合JJG196-1990检定规程【3】B级器具标准；称量采用分度值为0.1mg天平，符合JJG98-1990非自动天平检定规程要求；检测仪器（Agilent1200）符合JJG705-1990高效液相色谱仪检定规程要求【4】。
三种提取物对胶质瘤细胞的增殖影响
取对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞，用含10% FBS/小牛血清的RPMI1640/DMEM培养液培养的肿瘤细胞，以1.5×104/孔接种于96孔板，37℃5%CO2的培养箱中培养24h，之后加入不同浓度的五味子醇甲，甲素和乙素、阳性对照，阴性对照组只加培养液，每组均设3个复孔，继续培养48h后，加入5mg/ml20μl的MTT， 37℃5%CO2的培养箱中继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入150μl的DMSO，用酶标仪震荡2-3min，测其吸光度（OD值），检测波长为490nm。计算各组样品3个复孔的平均值，计算细胞生长抑制率。重复三次，通过与阴性对照组比较，根据公式 ， 【5，6】计算其相对增值率、50%抑制率。（T是实验组各时间段吸光度值，T0是零时间点吸光度值，C是阳性对照组吸光度值，不加药组各时间点吸光度；C0为空白组吸光度值，不加细胞和药物，仅有培养基）。
3结果
标准曲线制备 用1ml单线移液管精密吸取五味子三种提取物的对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5ml，分别置于自动进样瓶中，进行测定峰面积，用最小二乘法对峰面积A与五味子标液浓度C（mg/ml）进行线性拟合，得到醇甲A=14684C-6.422，相关系数r=0.9997；甲素A=12435C-11.851，相关系数r=0.9997；乙素A=11364C-7.033， 相关系数r=0.9998。
样品的测定 把待测样品的溶液过0.22um的尼龙滤膜，上机测定。测定样品的峰面积，结果见表1
表1 五味子的测定结果（n=6）
图1.色谱图（A）标准品；（B）样品1；（C）样品2；（D）样品3
4不确定度评定
五味子中醇甲、甲素、乙素含量测定的数学计算的公式为：
R为样品中五味子中醇甲、甲素、乙素含量，%；C标为对照品浓度，mg/ml；V定为样品的定容体积，ml；A样为样品的峰面积，mAu；A标为对照品的峰面积，mAu；m为样品重量，g；
五味子醇甲、甲素、乙素的含量的不确定度来源主要有以下几个方面：①样品称量引入的不确定度；②样品定容体积引入的不确定度；③样品处理过程产生的不确定度；④样品峰面积测量引入的不确定度；⑤重复测量引入的不确定度；⑥标准曲线的非线性引入的不确定度
称量引入的不确定度[u（m）]
分析天平的误差限为0.1mg，按矩形分布（ ），则其带来的不确定度分量为： ；称量变动性引入的不确定度：按《化学分析中不确定度的评估指南》【7】得到，称重采用差量法，应计2次不确定度，所以天平称量引入的不确定度为： ；称量样品m=2.0737g，则称量引入的相对标准不确定度为： 定容引入的不确定度[u（V）]
体积容器带来的不确定度包括以下4个来源： 25mLA级容量瓶的允许误差为±0.03mL[4]，按矩形分布
（ ），则其校准引入的不确定度为： ；其充满10次，得出标准偏差为0.02ml，这可直接作为不确定度，即：u2（V容25）=0.02ml。
温度引入的不确定度：设温度变化范围为±5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4mL.℃-1，则25ml容量瓶的体积变化分别为： 在置信水平为0.95时，包含因子K=1.96，则温度变化引入的不确定度为：
人员读数引起的不确定度分量：实际使用体积容器允许有1%的读数误差 则由25 mL容量瓶引入的相对标准不确定度：
样品处理过程产生的不确定度[u（rep）]
重复性测量的不确定度属A类评定。实验依照GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法：理化部分总则》[8]规定，根据批号随机取样。重复测量10次即n=10，由贝塞
尔公式求得标准偏差： 重复性的不确定度为： ；
峰面积测量的不确定度[u（AS）]
该不确定度属A类评定，6次测量醇甲，甲素和乙素峰面积的平均值分别为8636.983225，2305.61224和4861.201718。由于测量次数较少，根据《测量不确定度评定与表示》[9]中，采用极差法进行评定，其中n=6，C=2.53。
根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1%，
则峰面积的相对不确定度分量：
液相色谱仪测定用微量进样器进样不确定度1%，则相对不确定度分量：
仪器数据处理系统引入的不确定度：
由此，得到样品峰面积测量的不确定度评定：
重复性测量引入的不确定度[u（rep）]
五味子含量的重复性测量结果见表1，由贝塞尔公
式求得标准偏差：
重复性的不确定度为： ，
标准曲线的非线性引入的不确定度[u（line）]
精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5mL的7个五味子标准溶液，每个浓度测量两次。根据测量数据用最小二乘法拟出标准工作曲线方程：醇甲A=14684C-6.422，相关系数r=0.9997；甲素A=12435C-11.851，相关系数r=0.9997；乙素A=11364C-7.033，相关系数r=0.9998。计算标准曲线方程的标准偏差，即残差的标准偏差。仪器吸光度测量值和根据线性方程计算的吸光度值列于表2。
表2 标准曲线的残差计算结果
标准曲线的剩余标准差和由标准曲线拟合带来的不确定度分别为：
和
式中：SR：标准曲线的剩余标准差（残差标准差）； b：斜率；p：待测样品的重复测定次数；n：标准曲线的点数；C：待测样品浓度的平均值；C0：标准曲线各点浓度的平均值；C0j：各标准液浓度值；
由标准曲线带来的相对不确定度：
醇甲：
甲素：
乙素：
合成标准不确定度、扩展不确定度和结果表述
以上各不确定度分量互不相关，则合成相对不确定度为：
合成不确定度：
取包含因子K=2，则扩展不确定度：
五味子含量的结果表述为：
体外抗肿瘤实验
实验使用MTT法测定五味子提取物醇甲，甲素和乙素对肿瘤细胞的抑制率，实验中选择了五个浓度进行其抗肿瘤抑制试验，见图2，结果显示：不同剂量的受测化合物对肿瘤细胞呈现出不同程度的抑制率，且其抑制作用随着浓度的增高而逐渐增强，而且作用的时间越长，对肿瘤细胞的抑制作用也越强，作用48h的抑制作用要优于24h。在相同浓度时其对肿瘤细胞抑制作用强弱：乙素≥醇甲≥甲素。50%抑制率见表3。
图2：五味子提取物C对胶质瘤U251细胞增殖的影响，
A为24h，B为48h （x±s n=3）
表3 五味子提取物 GI50值
5讨论
从不确定度的整个评定过程中可以看出，高效液相色谱法测定五味子含量的不确定度主要来源于样品峰面积测量的不确定度，因此控制液相系统的精密度来降低不确定度分量，降低该分量对降低该方法测量不确定度效果最明显。该方法的建立对于五味子质量的评定提供了有效的实验方法和手段。
对五味子三种提取物进行初步抗肿瘤实验，通过计算肿瘤细胞的相对增值率、50%抑制率，并以其为指标分析其在体外抗肿瘤活性；实验结果表明：三种提取物在实验中均显示出了较强的抗肿瘤活性，且乙素的抗肿瘤活性优于其他提取物，并具有较好的剂量依赖性，剂量越高，其抗肿瘤作用越好，作用时间越长，其抑制作用也越强，具体的抗肿瘤机制还有待进一步研究。
本实验中仅对五味子提取物醇甲，甲素和乙素进行了初步的体外抗肿瘤活性实验，还未进行其他方面药理活性的验证（如：抗氧化、抗炎、抗菌等）及动物体内代谢实验、安全性评价实验，其应用于临床还有很长一段路要走，希望不久的将来，五味子提取物可以应用于临床，成为抗肿瘤的有效药品或者用于其他疾病的治疗，为人类造福！
参考文献
[1]Lee TH， Jung CH， Lee DH. Neuroprotective effects of Schisandrin B against transient focal cerebral ischemia in Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 2012. 50（12）： 4239-45.
[2]Zheng S， Aves SJ， Laraia L， Galloway WR， Pike KG， Wu W， Spring DR. A concise total synthesis of deoxy schizandrin and exploration of its antiproliferative effects and those of structurally related derivatives. Chemistry. 2012. 18（11）： 3193-8.
[3] JJG 196-2006. 中华人民共和国国家计量检定规程 常用玻璃量器. 【S】.2006：6-9
[4]赵 敏 JJG705-1990 实验室液相色谱仪检定规程， JJG98-1990.非自动的天平检定规程【S】.1990：7-8
[5]中国实验室国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评估指南【M】. 2002
[6]Liu Z， Zhang B， Liu K， Ding Z， Hu X. Schisandrin B attenuates cancer invasion and metastasis via inhibiting epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 2012；7（7）： e40480.
[7] Panossian A. Wikman G. "Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.： an overview of Russian research and uses in medicine. Journal of Ethnopharmacology. 2008. 118（2）：183-212.
[8]国家质量监督检验检疫总局. GB/T 5009.1 — 2003 食品卫生检验方法理化部分总则[S]. 北京： 中国标准出版社， 2006.
[9] 国家质量技术监督局计量司测量不确定度评定与表示指南. 【S】.北京： 中国计量出版社2005JJG
关键词：芹菜叶；干制；护色；叶绿素
1引言
五味子为常用滋补性中药，其味酸、甘，性温和，且有收敛固涩、益气生津与补肾宁心等功能。五味子在中医临床中应用广泛，而且也多用于保健食品的配方中，真正做到药食同源的一味中药。通过对其化学成分和药理活性研究发现，五味子中的木脂素类化合物为其有效成分之一，主要有五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙等。市场上有关五味子的植物提取物、中药和保健食品的产品，名目繁多，质量参差不齐。目前该类产品的质量控制多采用薄层法或高效液相色谱法测定其中部分成分的含量，大多数方法只测定其中1～2个成分的含量【1-2】。为了更好的评价和控制产品的质量，我们建立了同时测定含五味子保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种主要成分的含量测定方法，并取得了满意的效果。
五味子醇甲、五味子甲素和乙素为重要的护肝降酶有效成分。本实验建立了高效液相色谱法同时测定五味子中五味子醇甲、五味子甲素和乙素的含量，并对检测结果进行不确定度评定，分析了误差来源，确定了测定结果的置信区间。
2材料和方法
仪器：Agilent1200高效液相色谱仪四元泵，自动进样器，MWD检测器，ChemSation工作站；电子分析天平：1712mp8型，德国赛多利斯公司；KQ-500TDE型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。五味子醇甲，批号：110857-200507；五味子甲素，批号：110764-200408；五味子乙素，批号110765-200508，对照品购自中国药品生物制品检验所；五味子：购于市场，实验室自制成紫红色粉末；甲醇，分析纯，北京化工厂；水为纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；甲醇，色谱纯，美国迪马公司。
实验操作及条件
对照品溶液的制备 用分度值0.1mg天平精密称取五味子醇甲对照品0.0012g，甲素0.0026g，乙素0.0018g置于25ml容量瓶中，加甲醇放置超声波中使其溶解，放置室温，加甲醇至刻度制成工作液。
供试液制备和测定 取五味子粉末2g左右，放入25ml容量瓶中，加甲醇置于超声波中超声30min，放置室温后用甲醇定容，摇匀，即得。
色谱条件：Agilent XDB-C18柱（250mm×4.6mm，5um），流动相：甲醇：水=70：30，流速1.0ml/min，柱温：26℃，检测波长：254nm.在选定的条件下，五味子醇甲、甲素、乙素和样品中其他组分都能达到很好的分离。
实验条件：实验室温度为（20±5）℃；容量瓶、吸管等玻璃量器符合JJG196-1990检定规程【3】B级器具标准；称量采用分度值为0.1mg天平，符合JJG98-1990非自动天平检定规程要求；检测仪器（Agilent1200）符合JJG705-1990高效液相色谱仪检定规程要求【4】。
三种提取物对胶质瘤细胞的增殖影响
取对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞，用含10% FBS/小牛血清的RPMI1640/DMEM培养液培养的肿瘤细胞，以1.5×104/孔接种于96孔板，37℃5%CO2的培养箱中培养24h，之后加入不同浓度的五味子醇甲，甲素和乙素、阳性对照，阴性对照组只加培养液，每组均设3个复孔，继续培养48h后，加入5mg/ml20μl的MTT， 37℃5%CO2的培养箱中继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入150μl的DMSO，用酶标仪震荡2-3min，测其吸光度（OD值），检测波长为490nm。计算各组样品3个复孔的平均值，计算细胞生长抑制率。重复三次，通过与阴性对照组比较，根据公式 ， 【5，6】计算其相对增值率、50%抑制率。（T是实验组各时间段吸光度值，T0是零时间点吸光度值，C是阳性对照组吸光度值，不加药组各时间点吸光度；C0为空白组吸光度值，不加细胞和药物，仅有培养基）。
3结果
标准曲线制备 用1ml单线移液管精密吸取五味子三种提取物的对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5ml，分别置于自动进样瓶中，进行测定峰面积，用最小二乘法对峰面积A与五味子标液浓度C（mg/ml）进行线性拟合，得到醇甲A=14684C-6.422，相关系数r=0.9997；甲素A=12435C-11.851，相关系数r=0.9997；乙素A=11364C-7.033， 相关系数r=0.9998。
样品的测定 把待测样品的溶液过0.22um的尼龙滤膜，上机测定。测定样品的峰面积，结果见表1
表1 五味子的测定结果（n=6）
图1.色谱图（A）标准品；（B）样品1；（C）样品2；（D）样品3
4不确定度评定
五味子中醇甲、甲素、乙素含量测定的数学计算的公式为：
R为样品中五味子中醇甲、甲素、乙素含量，%；C标为对照品浓度，mg/ml；V定为样品的定容体积，ml；A样为样品的峰面积，mAu；A标为对照品的峰面积，mAu；m为样品重量，g；
五味子醇甲、甲素、乙素的含量的不确定度来源主要有以下几个方面：①样品称量引入的不确定度；②样品定容体积引入的不确定度；③样品处理过程产生的不确定度；④样品峰面积测量引入的不确定度；⑤重复测量引入的不确定度；⑥标准曲线的非线性引入的不确定度
称量引入的不确定度[u（m）]
分析天平的误差限为0.1mg，按矩形分布（ ），则其带来的不确定度分量为： ；称量变动性引入的不确定度：按《化学分析中不确定度的评估指南》【7】得到，称重采用差量法，应计2次不确定度，所以天平称量引入的不确定度为： ；称量样品m=2.0737g，则称量引入的相对标准不确定度为： 定容引入的不确定度[u（V）]
体积容器带来的不确定度包括以下4个来源： 25mLA级容量瓶的允许误差为±0.03mL[4]，按矩形分布
（ ），则其校准引入的不确定度为： ；其充满10次，得出标准偏差为0.02ml，这可直接作为不确定度，即：u2（V容25）=0.02ml。
温度引入的不确定度：设温度变化范围为±5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4mL.℃-1，则25ml容量瓶的体积变化分别为： 在置信水平为0.95时，包含因子K=1.96，则温度变化引入的不确定度为：
人员读数引起的不确定度分量：实际使用体积容器允许有1%的读数误差 则由25 mL容量瓶引入的相对标准不确定度：
样品处理过程产生的不确定度[u（rep）]
重复性测量的不确定度属A类评定。实验依照GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法：理化部分总则》[8]规定，根据批号随机取样。重复测量10次即n=10，由贝塞
尔公式求得标准偏差： 重复性的不确定度为： ；
峰面积测量的不确定度[u（AS）]
该不确定度属A类评定，6次测量醇甲，甲素和乙素峰面积的平均值分别为8636.983225，2305.61224和4861.201718。由于测量次数较少，根据《测量不确定度评定与表示》[9]中，采用极差法进行评定，其中n=6，C=2.53。
根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1%，
则峰面积的相对不确定度分量：
液相色谱仪测定用微量进样器进样不确定度1%，则相对不确定度分量：
仪器数据处理系统引入的不确定度：
由此，得到样品峰面积测量的不确定度评定：
重复性测量引入的不确定度[u（rep）]
五味子含量的重复性测量结果见表1，由贝塞尔公
式求得标准偏差：
重复性的不确定度为： ，
标准曲线的非线性引入的不确定度[u（line）]
精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5mL的7个五味子标准溶液，每个浓度测量两次。根据测量数据用最小二乘法拟出标准工作曲线方程：醇甲A=14684C-6.422，相关系数r=0.9997；甲素A=12435C-11.851，相关系数r=0.9997；乙素A=11364C-7.033，相关系数r=0.9998。计算标准曲线方程的标准偏差，即残差的标准偏差。仪器吸光度测量值和根据线性方程计算的吸光度值列于表2。
表2 标准曲线的残差计算结果
标准曲线的剩余标准差和由标准曲线拟合带来的不确定度分别为：
和
式中：SR：标准曲线的剩余标准差（残差标准差）； b：斜率；p：待测样品的重复测定次数；n：标准曲线的点数；C：待测样品浓度的平均值；C0：标准曲线各点浓度的平均值；C0j：各标准液浓度值；
由标准曲线带来的相对不确定度：
醇甲：
甲素：
乙素：
合成标准不确定度、扩展不确定度和结果表述
以上各不确定度分量互不相关，则合成相对不确定度为：
合成不确定度：
取包含因子K=2，则扩展不确定度：
五味子含量的结果表述为：
体外抗肿瘤实验
实验使用MTT法测定五味子提取物醇甲，甲素和乙素对肿瘤细胞的抑制率，实验中选择了五个浓度进行其抗肿瘤抑制试验，见图2，结果显示：不同剂量的受测化合物对肿瘤细胞呈现出不同程度的抑制率，且其抑制作用随着浓度的增高而逐渐增强，而且作用的时间越长，对肿瘤细胞的抑制作用也越强，作用48h的抑制作用要优于24h。在相同浓度时其对肿瘤细胞抑制作用强弱：乙素≥醇甲≥甲素。50%抑制率见表3。
图2：五味子提取物C对胶质瘤U251细胞增殖的影响，
A为24h，B为48h （x±s n=3）
表3 五味子提取物 GI50值
5讨论
从不确定度的整个评定过程中可以看出，高效液相色谱法测定五味子含量的不确定度主要来源于样品峰面积测量的不确定度，因此控制液相系统的精密度来降低不确定度分量，降低该分量对降低该方法测量不确定度效果最明显。该方法的建立对于五味子质量的评定提供了有效的实验方法和手段。
对五味子三种提取物进行初步抗肿瘤实验，通过计算肿瘤细胞的相对增值率、50%抑制率，并以其为指标分析其在体外抗肿瘤活性；实验结果表明：三种提取物在实验中均显示出了较强的抗肿瘤活性，且乙素的抗肿瘤活性优于其他提取物，并具有较好的剂量依赖性，剂量越高，其抗肿瘤作用越好，作用时间越长，其抑制作用也越强，具体的抗肿瘤机制还有待进一步研究。
本实验中仅对五味子提取物醇甲，甲素和乙素进行了初步的体外抗肿瘤活性实验，还未进行其他方面药理活性的验证（如：抗氧化、抗炎、抗菌等）及动物体内代谢实验、安全性评价实验，其应用于临床还有很长一段路要走，希望不久的将来，五味子提取物可以应用于临床，成为抗肿瘤的有效药品或者用于其他疾病的治疗，为人类造福！
参考文献
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[9] 国家质量技术监督局计量司测量不确定度评定与表示指南. 【S】.北京： 中国计量出版社2005JJG