论文部分内容阅读
【摘要】目的:为了了解紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞黑皮质素受体-1（MC1R）的影响。方法:采用MTT法测定UVR照射后黑素细胞增殖情况，以NaOH溶解法测定黑素含量和检测UVR照射后黑素细胞MC1R基因mRNA表达。结果:UVA照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,高剂量时无明显变化，黑素含量在低剂量时升高,达到一定剂量后将保持稳定；UVB照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低，黑素含量在低剂量时增加,在高剂量时保持稳定；UVA和URB照射后黑素细胞MC1R基因mRNA的表达均明显高于对照组。结论:不同剂量和不同类型紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞的数量、黑素含量及MC1R表达均可产生正性作用。
【关键词】黑皮质素受体； MC1R；紫外线；黑素细胞
【中图分类号】S821【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0018-02
紫外线（UV）按波长分为长波紫外线（UVA）,中波紫外线（UVB）和短波紫外线。短波紫外线在到达地球之前几乎全部被大气层吸收,故而对人类皮肤而言,最有影响力的是中长波紫外线。紫外线对人皮肤的影响,包括光老化，光损伤，色素沉着反应，导致皮肤肿瘤等，其中紫外线对人黑素细胞及黑素合成有着极复杂重要的影响。
人类皮肤色素形成具有半孟德尔遗传模式，有多基因特性，由主要基因和修饰基因共同作用。色素形成是外界环境影响下的各种基因同步化相互作用产生的一大性状［1］。众多基因中，能影响人黑素细胞功能的有黑皮质素受体，P基因，TYRP 及SILV基因家族成员等,其中MC1R表达于人黑素细胞，MC1R和α-MSH及ACTH有亲近性（α-促黑素细胞激素和ACTH均促进黑素形成使皮肤着色），一旦黑皮质素肽结合MC1R，就会刺激黑素的形成。［2］ MC1R是决定人类皮肤颜色的主要基因之一，已被成功克隆，其位点在16q24.3。
为研究体外培养人黑素细胞对紫外线照射后黑素细胞MC1R的作用，我们采用体外培养人黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，以NaOH溶解法测定黑素含量和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞MC1R基因mRNA表达,具体内容如下：
1 材料和方法
1.1 主要试剂及材料：试剂：黑素细胞培养液（美国Cascade公司）；TritonX-100（Sigma公司）。RNA提取试剂盒及 mRNA 纯化试剂盒（Promega 公司）、RT-PCR 试剂盒（TakaRa公司）。RT-PCR引物由 Takara 公司合成：5’CATGGCTGTGCAGGGATCTCAGA-GAAGACTTCTGGGC,3’（NcoI site）, 5’TTGGTTGAATTCCCAGGAGCATGTCAGCAC3’（EcoR I site）。
1.2 正常人黑素细胞培养及传代［3］: 取3-20岁人包皮环切标本，生理盐水反复冲洗，去除皮下组织，切成3mm×5mm小条，DispaseⅡ酶4℃消化15hr后，仔细分离表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，终止消化后吹打成单细胞悬液，筛网过滤后离心，以5×106/ml接种于含黑色素细胞培养液的培养瓶中。置入CO2孵箱中37℃培养，24小时后首次换液以去除未贴壁细胞，然后按情况进行换液。原代接近融合时，胰酶消化传代，实验选用2-4代细胞。
1.3 MTT法测定黑素细胞增殖: 用四甲基偶氮唑兰比色（MTT）法。将第三代成熟黑素细胞计数接种于35mm培养皿,待细胞生长至融合80%时,弃上清培养液,胰酶消化后，调整细胞浓度为5X104/ml接种于于96孔培养板,常规孵育,细胞贴壁后12小时弃上清，→分别加含药血清培养液200uL/孔,血清浓度10%,分别予不同剂量UVB和UVA照射后,以空白组作对照,设6个重复孔；→ 观察72h分别加MTT 20ul/孔,继续孵育4h后弃上清，加二甲基亚砜200uL/孔,振荡10min,置酶标仪上测定吸光度值，激发波长为570nm处，参考波长为630nm,测OD值。计算MC增长率（%）（A各浓度/A正常-1）X100%。
1.4 以NaOH溶解法测定黑素含量:将第三代成熟黑素细胞计数接种于35mm培养皿,待细胞生长至融合80%时,弃上清培养液,每皿加PBS1ml,分别予不同剂量的UVB和UVA照射后迅速弃去PBS,每皿加含有添加物的M-254完全培养基1ml,置于37℃孵箱中孵育48小时。以0.1%Trixton如上述对各培养皿细胞彻底消化,以毛刷将细胞从培养皿上刮除干净,并分别收集到15ml离心管中,胎牛血清中和后,离心后弃去上清液,以PBS冲洗2遍,加入1M的NaOH定至1ml后用力振荡10分钟。将以上溶液充分混匀,加入至96孔板中,每孔100ul,在室温下于450nm酶标仪上比色,记录OD值并进行统计学分析。统计学分析采用SPSS11.5软件进行。
1.5 MC1R基因的mRNA表达检测（UVR照射后）：半定量 RT—PCR法检测:将第三代成熟黑素细胞计数、接种于35mm培养皿置于37℃孵箱，待细胞生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UVA照射（限定剂量根据MTT法测得的对于黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），后胰酶消化细胞，用Trizol裂解细胞，提取总RNA，按 Promega 公司 RNA 提取试剂盒说明书操作。每 5-10×106个细胞加 1ml trizol 试剂，室温混匀作用 5 分钟，每 1ml trizol 加 0.2ml 氯仿，盖上盖子剧烈摇动 15秒，室温作用 3分钟后4℃10,000×g 离心 15分钟，离心后分离混合物呈现出最低层为红色，上层为无色液体，RNA 绝大部分保存在该液相中。把液相移到一个新管中，添加 0.5ml 异丙醇，室温作用 10 分钟 4℃10,000×g 离心 10 分钟，RNA 沉淀于管底。移去上面液体，用 1ml 75%乙醇洗涤 RNA，用涡矩振荡器混匀，4℃7000×g离心 5 分钟。小心吸去乙醇，干燥 RNA 10 分鐘，用 500μl 无 Rnase 水溶解 RNA，置 60℃10 分钟溶解 RNA。按 Promega 公司 mRNA 纯化试剂盒说明书操作。半定量RT—PCR法检测雌激素受体基因的mRNA表达，结果以与看家基因GAPDH的灰度比值表示。统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件行t检验及确切概率计算法检验。
2 结果
2.1 形态学结果：培养的人黑素细胞为树突状细胞,较多树突,胞体内见黑素颗粒,细胞增殖良好,连接成网。细胞铺满培养瓶后进行传代,约7～10 d 传一代 （图1，2）
图1 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
图2 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
2.2 MTT法测定不同剂量UVB照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数1×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
MTT法测定不同剂量UVA照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数0.75×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.3 NaOH溶解法测定不同剂量UVA照射后黑素含量的变化
（细胞数5.4×105/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
NaOH溶解法测定不同剂量UVB照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数5.4×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.6 MC1R基因mRNA的表达：照射组的MC1R基因mRNA的表达也明显高于对照组（0.69±0.011vs 0.25±0.010,p0.001）。
3 讨论
不同人种皮肤颜色差异是人类最为显著的特性之一,差异由遗传学控制，反映人类遗传学特性。人类皮肤色素形成具有半孟德尔遗传模式，多基因特性，由主要基因和其他的修饰基因共同作用形成。色素形又是外界环境影响下的各基因同步化相互作用的一大性状,明确这些可变异基因和各种环境一度是极大的挑战。MC1R被认为是决定人类皮肤颜色的主要基因之一，而紫外线对于人类皮肤的影响,包括光老化，光损伤，造成色素沉着反应，导致皮肤肿瘤等。紫外线对人类黑素细胞及黑素合成有着复杂的影响。［4］ ［5］
为了研究体外培养人黑素细胞对于紫外线照射后黑素细胞MC1R的作用影响，我们采用体外培养人黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，然后分别采用MTT法测定照射前后的细胞数量变化; 以NaOH溶解法测定黑素含量和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞MC1R的表达。结果发现:UVA照射后，黑素含量在较低照射剂量时便有较对照组升高的趋势，仅在照射剂量为200mj/cm2时,照射组与对照组相比有显著的统计学差异;UVB照射后，在照射剂量为10-20mj/cm2时照射组与对照组相比有显著的统计学差异，结果与目前相关文献数据基本吻合。,目前大多数学者认为UVB的这种促进黑素生成的作用是与其生存环境中的角质形成细胞密切相关的，今后研究重点将围绕共培养模式下的细胞间相互作用。另外，UVA和UVB照射后黑素細胞MC1R基因mRNA的表达也明显高于对照组，提示雌激素受体的表达确实与不同剂量与类型的紫外线照射作用明显相关。
总之，我们利用体外培养黑素细胞的方法，探讨UVA和UVB对于人类黑素细胞黑素含量及MC1R受体表达等方面的影响，明确了UVA和UVB对于黑素细胞合成黑素的能力的有效浓度及MC1R在紫外线作用下高表达是与黑素细胞合成黑素能力相一致的。通过本实验，我们进一步加深认识人类皮肤颜色的遗传学特性，今后将继续研究影响皮肤颜色表型基因位点多态现象的水平，效应及其相互作用等内容。对于MC1R研究，重点依然是是确定其哪一等位基因起显著意义，更多的联系其有价值的表型特征，进一步扩大皮肤颜色遗传学领域的研究价值。
参考文献
［1］ John PR, MakovaK, Li WH, et al.Ramsay M. DNA polymorphism and selection at the melanocortin-1 receptor gene in normally pigmented southern African individuals ［J］.Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. 1994:299-306
［2］ 袁磊，张余光。黑素皮质激素受体-1结构和功能［J］.中国美容医学。2009，1，18（1）：120-122
［3］ 张宪旗,郑 敏,牟宽厚等。8一甲氧沙林对黑素细胞内游离钙浓度及细胞骨架蛋白形成的影响［J］.浙江大学学报（医学版），2009，38（4）：348-350
［4］ Fargnoli MC，Pike K，Pfeiffer RM,et a1.MC1R variants increase risk of melanomas harboring BRAF mutations［J］.J Invest Dermatol，2008，128（10）：2485—2490
［5］ Rogers AR, Iltis D, Wooding S. Genetic variation at the MC1R locus and the time since loss of human body hair.［J］.Curr. Anthropol. 2004. 45:105-7
【关键词】黑皮质素受体； MC1R；紫外线；黑素细胞
【中图分类号】S821【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0018-02
紫外线（UV）按波长分为长波紫外线（UVA）,中波紫外线（UVB）和短波紫外线。短波紫外线在到达地球之前几乎全部被大气层吸收,故而对人类皮肤而言,最有影响力的是中长波紫外线。紫外线对人皮肤的影响,包括光老化，光损伤，色素沉着反应，导致皮肤肿瘤等，其中紫外线对人黑素细胞及黑素合成有着极复杂重要的影响。
人类皮肤色素形成具有半孟德尔遗传模式，有多基因特性，由主要基因和修饰基因共同作用。色素形成是外界环境影响下的各种基因同步化相互作用产生的一大性状［1］。众多基因中，能影响人黑素细胞功能的有黑皮质素受体，P基因，TYRP 及SILV基因家族成员等,其中MC1R表达于人黑素细胞，MC1R和α-MSH及ACTH有亲近性（α-促黑素细胞激素和ACTH均促进黑素形成使皮肤着色），一旦黑皮质素肽结合MC1R，就会刺激黑素的形成。［2］ MC1R是决定人类皮肤颜色的主要基因之一，已被成功克隆，其位点在16q24.3。
为研究体外培养人黑素细胞对紫外线照射后黑素细胞MC1R的作用，我们采用体外培养人黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，以NaOH溶解法测定黑素含量和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞MC1R基因mRNA表达,具体内容如下：
1 材料和方法
1.1 主要试剂及材料：试剂：黑素细胞培养液（美国Cascade公司）；TritonX-100（Sigma公司）。RNA提取试剂盒及 mRNA 纯化试剂盒（Promega 公司）、RT-PCR 试剂盒（TakaRa公司）。RT-PCR引物由 Takara 公司合成：5’CATGGCTGTGCAGGGATCTCAGA-GAAGACTTCTGGGC,3’（NcoI site）, 5’TTGGTTGAATTCCCAGGAGCATGTCAGCAC3’（EcoR I site）。
1.2 正常人黑素细胞培养及传代［3］: 取3-20岁人包皮环切标本，生理盐水反复冲洗，去除皮下组织，切成3mm×5mm小条，DispaseⅡ酶4℃消化15hr后，仔细分离表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，终止消化后吹打成单细胞悬液，筛网过滤后离心，以5×106/ml接种于含黑色素细胞培养液的培养瓶中。置入CO2孵箱中37℃培养，24小时后首次换液以去除未贴壁细胞，然后按情况进行换液。原代接近融合时，胰酶消化传代，实验选用2-4代细胞。
1.3 MTT法测定黑素细胞增殖: 用四甲基偶氮唑兰比色（MTT）法。将第三代成熟黑素细胞计数接种于35mm培养皿,待细胞生长至融合80%时,弃上清培养液,胰酶消化后，调整细胞浓度为5X104/ml接种于于96孔培养板,常规孵育,细胞贴壁后12小时弃上清，→分别加含药血清培养液200uL/孔,血清浓度10%,分别予不同剂量UVB和UVA照射后,以空白组作对照,设6个重复孔；→ 观察72h分别加MTT 20ul/孔,继续孵育4h后弃上清，加二甲基亚砜200uL/孔,振荡10min,置酶标仪上测定吸光度值，激发波长为570nm处，参考波长为630nm,测OD值。计算MC增长率（%）（A各浓度/A正常-1）X100%。
1.4 以NaOH溶解法测定黑素含量:将第三代成熟黑素细胞计数接种于35mm培养皿,待细胞生长至融合80%时,弃上清培养液,每皿加PBS1ml,分别予不同剂量的UVB和UVA照射后迅速弃去PBS,每皿加含有添加物的M-254完全培养基1ml,置于37℃孵箱中孵育48小时。以0.1%Trixton如上述对各培养皿细胞彻底消化,以毛刷将细胞从培养皿上刮除干净,并分别收集到15ml离心管中,胎牛血清中和后,离心后弃去上清液,以PBS冲洗2遍,加入1M的NaOH定至1ml后用力振荡10分钟。将以上溶液充分混匀,加入至96孔板中,每孔100ul,在室温下于450nm酶标仪上比色,记录OD值并进行统计学分析。统计学分析采用SPSS11.5软件进行。
1.5 MC1R基因的mRNA表达检测（UVR照射后）：半定量 RT—PCR法检测:将第三代成熟黑素细胞计数、接种于35mm培养皿置于37℃孵箱，待细胞生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UVA照射（限定剂量根据MTT法测得的对于黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），后胰酶消化细胞，用Trizol裂解细胞，提取总RNA，按 Promega 公司 RNA 提取试剂盒说明书操作。每 5-10×106个细胞加 1ml trizol 试剂，室温混匀作用 5 分钟，每 1ml trizol 加 0.2ml 氯仿，盖上盖子剧烈摇动 15秒，室温作用 3分钟后4℃10,000×g 离心 15分钟，离心后分离混合物呈现出最低层为红色，上层为无色液体，RNA 绝大部分保存在该液相中。把液相移到一个新管中，添加 0.5ml 异丙醇，室温作用 10 分钟 4℃10,000×g 离心 10 分钟，RNA 沉淀于管底。移去上面液体，用 1ml 75%乙醇洗涤 RNA，用涡矩振荡器混匀，4℃7000×g离心 5 分钟。小心吸去乙醇，干燥 RNA 10 分鐘，用 500μl 无 Rnase 水溶解 RNA，置 60℃10 分钟溶解 RNA。按 Promega 公司 mRNA 纯化试剂盒说明书操作。半定量RT—PCR法检测雌激素受体基因的mRNA表达，结果以与看家基因GAPDH的灰度比值表示。统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件行t检验及确切概率计算法检验。
2 结果
2.1 形态学结果：培养的人黑素细胞为树突状细胞,较多树突,胞体内见黑素颗粒,细胞增殖良好,连接成网。细胞铺满培养瓶后进行传代,约7～10 d 传一代 （图1，2）
图1 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
图2 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
2.2 MTT法测定不同剂量UVB照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数1×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
MTT法测定不同剂量UVA照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数0.75×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.3 NaOH溶解法测定不同剂量UVA照射后黑素含量的变化
（细胞数5.4×105/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
NaOH溶解法测定不同剂量UVB照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数5.4×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.6 MC1R基因mRNA的表达：照射组的MC1R基因mRNA的表达也明显高于对照组（0.69±0.011vs 0.25±0.010,p0.001）。
3 讨论
不同人种皮肤颜色差异是人类最为显著的特性之一,差异由遗传学控制，反映人类遗传学特性。人类皮肤色素形成具有半孟德尔遗传模式，多基因特性，由主要基因和其他的修饰基因共同作用形成。色素形又是外界环境影响下的各基因同步化相互作用的一大性状,明确这些可变异基因和各种环境一度是极大的挑战。MC1R被认为是决定人类皮肤颜色的主要基因之一，而紫外线对于人类皮肤的影响,包括光老化，光损伤，造成色素沉着反应，导致皮肤肿瘤等。紫外线对人类黑素细胞及黑素合成有着复杂的影响。［4］ ［5］
为了研究体外培养人黑素细胞对于紫外线照射后黑素细胞MC1R的作用影响，我们采用体外培养人黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，然后分别采用MTT法测定照射前后的细胞数量变化; 以NaOH溶解法测定黑素含量和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞MC1R的表达。结果发现:UVA照射后，黑素含量在较低照射剂量时便有较对照组升高的趋势，仅在照射剂量为200mj/cm2时,照射组与对照组相比有显著的统计学差异;UVB照射后，在照射剂量为10-20mj/cm2时照射组与对照组相比有显著的统计学差异，结果与目前相关文献数据基本吻合。,目前大多数学者认为UVB的这种促进黑素生成的作用是与其生存环境中的角质形成细胞密切相关的，今后研究重点将围绕共培养模式下的细胞间相互作用。另外，UVA和UVB照射后黑素細胞MC1R基因mRNA的表达也明显高于对照组，提示雌激素受体的表达确实与不同剂量与类型的紫外线照射作用明显相关。
总之，我们利用体外培养黑素细胞的方法，探讨UVA和UVB对于人类黑素细胞黑素含量及MC1R受体表达等方面的影响，明确了UVA和UVB对于黑素细胞合成黑素的能力的有效浓度及MC1R在紫外线作用下高表达是与黑素细胞合成黑素能力相一致的。通过本实验，我们进一步加深认识人类皮肤颜色的遗传学特性，今后将继续研究影响皮肤颜色表型基因位点多态现象的水平，效应及其相互作用等内容。对于MC1R研究，重点依然是是确定其哪一等位基因起显著意义，更多的联系其有价值的表型特征，进一步扩大皮肤颜色遗传学领域的研究价值。
参考文献
［1］ John PR, MakovaK, Li WH, et al.Ramsay M. DNA polymorphism and selection at the melanocortin-1 receptor gene in normally pigmented southern African individuals ［J］.Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. 1994:299-306
［2］ 袁磊，张余光。黑素皮质激素受体-1结构和功能［J］.中国美容医学。2009，1，18（1）：120-122
［3］ 张宪旗,郑 敏,牟宽厚等。8一甲氧沙林对黑素细胞内游离钙浓度及细胞骨架蛋白形成的影响［J］.浙江大学学报（医学版），2009，38（4）：348-350
［4］ Fargnoli MC，Pike K，Pfeiffer RM,et a1.MC1R variants increase risk of melanomas harboring BRAF mutations［J］.J Invest Dermatol，2008，128（10）：2485—2490
［5］ Rogers AR, Iltis D, Wooding S. Genetic variation at the MC1R locus and the time since loss of human body hair.［J］.Curr. Anthropol. 2004. 45:105-7