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[摘要]目的：了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响。方法：以骨髓基质干细胞(ma¨ow stromal cell s，MsCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，实验分为A组：组织工程骨用添加冻存保护剂的保存液保存；B组：组织工程骨用不添加冻存保护剂的保存液保存；c组：组织工程骨未行低温保存；D组：单纯Mscs培养。A组和B组的组织工程骨于一196℃的液氮中冻存3个月，3个月后复温冻存的组织工程骨。用倒置相差显微镜和扫描电镜观察Mscs的粘附和分布情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、流式细胞仪分析细胞周期。结果：Mscs在材料表面和孔隙内均可粘附和分布，粘附于材料的细胞活力大小依次为：c组>A组>B组 (P<0．01，pA组>B组(P [关键词]组织工程；骨髓基质干细胞；脱蛋白骨；生物活性
[中图分类号]R318．08 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)02—0147－04
目前，国内外骨库对于异体骨和异种骨的保存积累了丰富的经验，但对于组织工程骨的保存却是一个空白点。相对于异体骨和异种骨的保存，组织工程骨的保存需要更为严格的标准。如何使保存后的组织工程骨具有较好的生物活性，需要进行相关研究。
1材料和方法
1．1部分脱蛋白骨支架材料的制备：取脑死亡患者捐献尸体骨的干骺端，修整为1．5cm×0．5cm×0．3cm大小。材料一侧为皮质骨，另一侧保留部分松质骨，共24块。生理盐水反复冲洗，一70℃深低温冰箱冷冻后，经脱脂、脱细胞和部分脱蛋白处理，冷冻干燥机冻干。材料用双层血浆袋密封包装，环氧乙烷消毒，4℃冰箱冷藏保存。
1．2组织工程骨的制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r／min离心lOmin，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106／ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％C02饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含l×10-8mol／L地塞米松、50mg／L维生素C和l×10-2mol／L B-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡l天后弃残液，每个支架材料以1×106／m1密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％C02饱和湿度培养7天。
1．3实验分组和组织工程骨的低温保存：实验分为A组：组织工程骨用添加冻存剂的保存液保存；B组：组织工程骨用不添加冻存剂的保存液保存；C组：组织工程骨未行低温保存；D组：单纯MSCs培养。以含15％胎牛血清DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为一二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、羟乙基淀粉和蔗糖，按照一定的比例合理搭配。具体降温步骤如下：将组织工程骨分装入含不同保存液的冻存管内，室温下放置10～15min，然后置于4℃ 20min，以－1℃／min降温至－20℃，保存30min，再以－1℃／min降温至80℃，隔夜后直接放入液氮中保存。3个月后取出冻存管，快速置于37℃水浴1～2min，直至保存液完全融化。
1．4倒置相差显微镜和扫描电镜观察：用倒置相差显微镜观察细胞与材料的粘附，细胞在材料孔隙内的分布。各组取组织工程骨1块，PBS漂洗三遍，戊二醛固定，酒精梯度脱水，标本经干燥和喷金处理后，用扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附和分布。
1．5 MTT法检测细胞活力：各组取组织工程骨6块，于培养板中加入5mg／ml的MTT，反应4h后弃液，加入DMSO，振荡lOmin，用酶标仪(美国PerkinElmer公司)选择波长490nm读取光密度值(0D值)，分析细胞活力。
1．6 ALP活性检测：各组取组织工程骨6块，消化并收集细胞。采用对硝基苯磷酸法，用紫外／荧光／可见光高效分析仪(美国Perkin Elmer公司)测定ALP活性，了解细胞产生的ALP活性。
1．7流式细胞仪检测：各组取组织工程骨6块，消化收集细胞并计数，PI染液染色，用流式细胞仪(美国Coulter公司)检测细胞周期和DNA含量，计算DNA指数(DI值)。
1．8统计学方法：实验结果以x±s表示，采用SPSS10．0软件包对组间计量资料行方差分析和q检验，P
2结果
2.1倒置相差显微镜观察结果：各组细胞在材料表面和孔隙内均可粘附和分布，细胞与材料紧密粘附，聚集成团，相互连接成网状(图1a～c)。其中，A组和C组材料孔隙内分布大量细胞，B组材料孔隙内分布少量细胞。观察结果提示，A组和c组组织工程骨的生物活性优于B组。
2．2扫描电镜观察结果：各组细胞在材料表面均可粘附，呈梭形或多角形，相邻细胞间有突起相互连接，细胞周围有网状胶原附着。其中，A组和C组材料表面粘附大量细胞，并有较多胶原连接；B组材料表面粘附细胞较少，胶原连接很少(图2a～c)。 观察结果提示，A组和C组组织工程骨的生物活性优于B组。
2．3 MSCs活力检测：粘附于材料的细胞活力分别为：A组0．5336±0．0122，B组0．3872±0．0052，C组0．6239±O．0047，D组0．7026±0．01973，细胞活力大小依次为C组>A组>B组，各组问差异均有统计学意义(P 2．4 MSCs ALP活性检测：粘附于材料细胞的ALP活性分别为：A组为(0．756±0．029)u／L，B组为(0．423±0．046)U／L，C组为(O．837±0．015)U／L，D组为(1．001±0．097)u／L，细胞的ALP活性依次为C组>A组>B组，各组间差异均有统计学意义(Jp<0．01)。
2．5流式细胞仪检测细胞周期：每块材料粘附细胞数分别为：A组(2．35~0．21)×105,B组(1．26~0．39)×105，C组(3．25±O．18)×IOs，D组(5．38±0．19)×105，每块材料粘附细胞数的多少依次为c组>A 组>B组(P<0．01)。各组细胞周期未见明显变化，无异倍体细胞，见表l。
3讨论
低温冻存是保存活体组织的重要方法，冷冻损伤是活体组织细胞最主要的副反应。损伤机制主要是冻融时冰晶对细胞的机械性和渗透性损伤，表现在以下两个方面：①慢速冷冻过程中，细胞外液水分不断结晶造成游离水分减少，导致细胞内外渗透压不等，使得大量水分由细胞内向细胞外渗出，逐渐导致细胞内渗透压升高，造成“溶质性损伤”；②快速冷冻过程中，细胞内水分尚未转移到细胞外，而细胞内外同时结冰，细胞内冰晶机械性破坏细胞器和细胞核而导致细胞损伤，造成“细胞内冰晶损伤”。目前认为生物组织的冷冻损伤主要是“溶质性损伤”所产生的渗透压、电解质含量和pH值的改变作用于细胞膜脂质造成的细胞膜渗漏，在复温过程中，细胞膜渗漏使大量水分进入细胞内导致细胞水肿而死亡，称为渗透性休克。此外，复温过程中如复温速率较慢，则会再次形成冰晶加重细胞损伤。有研究表明氧自由基也是导致冻融细胞损伤的原因之一，在冷冻前应用氧自由基保护剂可减轻冷冻损伤。由于冷冻速率越快引起细胞内冰晶形成越多，而速率过慢又可导致“溶质性损伤”。因此，低温保存需要选择造成损伤最轻的降温速率。复温速率对低温保存后细胞活力的恢复也有很大影响，严格说复温过程是降温过程的逆函数。如果没有足够快的复温速率，细胞内再次形成冰晶的概率很高。为了减轻冷冻损伤，选择适宜的降温和复温速率是低温保存的一个关键环节。分阶段降温比匀速降温对细胞活力和功能影响小，因此本实验采用分阶段降温措施，降温速度1～1．5℃／min，3个月后快速复温，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。
冻存保护剂是减少冷冻损伤的另一个重要方法，其保护机制可能是防冻剂与水分子形成氢键，使最低共熔点降低，从而减轻或避免了冷冻复温过程中冰晶对细胞的损伤。由于各种冻存保护剂的作用机制不同，单一保护剂很难达到效果理想的冷冻保护要求，目前常采用多种冻存剂组成的混合保护剂。本实验采用含15％胎牛血清的DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖，3种成分按照一定浓度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和渗透性强等特点，有助于细胞克服低温保存过程中细胞内外渗透压剧烈变化引起的损伤，是目前最常采用的冻存保护剂。其作用机制是：DMSO在细胞冷冻前渗透到细胞内，可降低培养液冰点并防止游离蛋白质聚集，提高细胞膜对水的通透性。水分在冻结前渗透出细胞外形成冰晶，从而减少细胞内冰晶形成，提高细胞复苏后存活率；冷冻前渗透到细胞内的DMSO在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞结构过度脱水皱缩。羟乙基淀粉通过竞争结合水的氢原子，使冰晶生成速度减慢，减弱水的固化过程，可以降低细胞外溶质浓度过高造成的细胞损害。低分子不可渗透物质蔗糖能在降温时向细胞外转运细胞内溶质，而复温时则作用相反，从而减轻细胞渗透性损伤。虽然冻存保护剂具有保护作用，但也有一定毒性，其毒性机制可能是：通过细胞膜引起的渗透性损伤、与蛋白质和脂膜结合导致其变性的化学性损伤，毒性损伤与温度和冻存剂的含量有关。目前对于混合性冻存剂的研究主要是寻找对相应组织和细胞具有保护效果最佳、毒性最小、不同种类和不同含量冻存剂的组合。本实验采用DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖混合物为组织工程骨的冻存保护剂，结果添加冻存剂组与不添加冻存剂组相比较，细胞周期未见明显变化，无异倍体细胞出现，复温后的组织工程骨生物活性得到了极大程度的改善，但与未行低温保存的新鲜组织工程骨相比较，其生物活性尚有一定的距离。因此，保存组织工程骨所应用的降温复温程序和速率、冻存剂含量和配方的选择如何才能做到最佳，并且方法简便、经济和实用，这些均有待于进一步研究。
编辑／张惠娟
(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)
[中图分类号]R318．08 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)02—0147－04
目前，国内外骨库对于异体骨和异种骨的保存积累了丰富的经验，但对于组织工程骨的保存却是一个空白点。相对于异体骨和异种骨的保存，组织工程骨的保存需要更为严格的标准。如何使保存后的组织工程骨具有较好的生物活性，需要进行相关研究。
1材料和方法
1．1部分脱蛋白骨支架材料的制备：取脑死亡患者捐献尸体骨的干骺端，修整为1．5cm×0．5cm×0．3cm大小。材料一侧为皮质骨，另一侧保留部分松质骨，共24块。生理盐水反复冲洗，一70℃深低温冰箱冷冻后，经脱脂、脱细胞和部分脱蛋白处理，冷冻干燥机冻干。材料用双层血浆袋密封包装，环氧乙烷消毒，4℃冰箱冷藏保存。
1．2组织工程骨的制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r／min离心lOmin，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106／ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％C02饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含l×10-8mol／L地塞米松、50mg／L维生素C和l×10-2mol／L B-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡l天后弃残液，每个支架材料以1×106／m1密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％C02饱和湿度培养7天。
1．3实验分组和组织工程骨的低温保存：实验分为A组：组织工程骨用添加冻存剂的保存液保存；B组：组织工程骨用不添加冻存剂的保存液保存；C组：组织工程骨未行低温保存；D组：单纯MSCs培养。以含15％胎牛血清DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为一二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、羟乙基淀粉和蔗糖，按照一定的比例合理搭配。具体降温步骤如下：将组织工程骨分装入含不同保存液的冻存管内，室温下放置10～15min，然后置于4℃ 20min，以－1℃／min降温至－20℃，保存30min，再以－1℃／min降温至80℃，隔夜后直接放入液氮中保存。3个月后取出冻存管，快速置于37℃水浴1～2min，直至保存液完全融化。
1．4倒置相差显微镜和扫描电镜观察：用倒置相差显微镜观察细胞与材料的粘附，细胞在材料孔隙内的分布。各组取组织工程骨1块，PBS漂洗三遍，戊二醛固定，酒精梯度脱水，标本经干燥和喷金处理后，用扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附和分布。
1．5 MTT法检测细胞活力：各组取组织工程骨6块，于培养板中加入5mg／ml的MTT，反应4h后弃液，加入DMSO，振荡lOmin，用酶标仪(美国PerkinElmer公司)选择波长490nm读取光密度值(0D值)，分析细胞活力。
1．6 ALP活性检测：各组取组织工程骨6块，消化并收集细胞。采用对硝基苯磷酸法，用紫外／荧光／可见光高效分析仪(美国Perkin Elmer公司)测定ALP活性，了解细胞产生的ALP活性。
1．7流式细胞仪检测：各组取组织工程骨6块，消化收集细胞并计数，PI染液染色，用流式细胞仪(美国Coulter公司)检测细胞周期和DNA含量，计算DNA指数(DI值)。
1．8统计学方法：实验结果以x±s表示，采用SPSS10．0软件包对组间计量资料行方差分析和q检验，P
2结果
2.1倒置相差显微镜观察结果：各组细胞在材料表面和孔隙内均可粘附和分布，细胞与材料紧密粘附，聚集成团，相互连接成网状(图1a～c)。其中，A组和C组材料孔隙内分布大量细胞，B组材料孔隙内分布少量细胞。观察结果提示，A组和c组组织工程骨的生物活性优于B组。
2．2扫描电镜观察结果：各组细胞在材料表面均可粘附，呈梭形或多角形，相邻细胞间有突起相互连接，细胞周围有网状胶原附着。其中，A组和C组材料表面粘附大量细胞，并有较多胶原连接；B组材料表面粘附细胞较少，胶原连接很少(图2a～c)。 观察结果提示，A组和C组组织工程骨的生物活性优于B组。
2．3 MSCs活力检测：粘附于材料的细胞活力分别为：A组0．5336±0．0122，B组0．3872±0．0052，C组0．6239±O．0047，D组0．7026±0．01973，细胞活力大小依次为C组>A组>B组，各组问差异均有统计学意义(P
2．5流式细胞仪检测细胞周期：每块材料粘附细胞数分别为：A组(2．35~0．21)×105,B组(1．26~0．39)×105，C组(3．25±O．18)×IOs，D组(5．38±0．19)×105，每块材料粘附细胞数的多少依次为c组>A 组>B组(P<0．01)。各组细胞周期未见明显变化，无异倍体细胞，见表l。
3讨论
低温冻存是保存活体组织的重要方法，冷冻损伤是活体组织细胞最主要的副反应。损伤机制主要是冻融时冰晶对细胞的机械性和渗透性损伤，表现在以下两个方面：①慢速冷冻过程中，细胞外液水分不断结晶造成游离水分减少，导致细胞内外渗透压不等，使得大量水分由细胞内向细胞外渗出，逐渐导致细胞内渗透压升高，造成“溶质性损伤”；②快速冷冻过程中，细胞内水分尚未转移到细胞外，而细胞内外同时结冰，细胞内冰晶机械性破坏细胞器和细胞核而导致细胞损伤，造成“细胞内冰晶损伤”。目前认为生物组织的冷冻损伤主要是“溶质性损伤”所产生的渗透压、电解质含量和pH值的改变作用于细胞膜脂质造成的细胞膜渗漏，在复温过程中，细胞膜渗漏使大量水分进入细胞内导致细胞水肿而死亡，称为渗透性休克。此外，复温过程中如复温速率较慢，则会再次形成冰晶加重细胞损伤。有研究表明氧自由基也是导致冻融细胞损伤的原因之一，在冷冻前应用氧自由基保护剂可减轻冷冻损伤。由于冷冻速率越快引起细胞内冰晶形成越多，而速率过慢又可导致“溶质性损伤”。因此，低温保存需要选择造成损伤最轻的降温速率。复温速率对低温保存后细胞活力的恢复也有很大影响，严格说复温过程是降温过程的逆函数。如果没有足够快的复温速率，细胞内再次形成冰晶的概率很高。为了减轻冷冻损伤，选择适宜的降温和复温速率是低温保存的一个关键环节。分阶段降温比匀速降温对细胞活力和功能影响小，因此本实验采用分阶段降温措施，降温速度1～1．5℃／min，3个月后快速复温，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。
冻存保护剂是减少冷冻损伤的另一个重要方法，其保护机制可能是防冻剂与水分子形成氢键，使最低共熔点降低，从而减轻或避免了冷冻复温过程中冰晶对细胞的损伤。由于各种冻存保护剂的作用机制不同，单一保护剂很难达到效果理想的冷冻保护要求，目前常采用多种冻存剂组成的混合保护剂。本实验采用含15％胎牛血清的DMEM培养液为基本保存液，冻存保护剂的基本成分为DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖，3种成分按照一定浓度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和渗透性强等特点，有助于细胞克服低温保存过程中细胞内外渗透压剧烈变化引起的损伤，是目前最常采用的冻存保护剂。其作用机制是：DMSO在细胞冷冻前渗透到细胞内，可降低培养液冰点并防止游离蛋白质聚集，提高细胞膜对水的通透性。水分在冻结前渗透出细胞外形成冰晶，从而减少细胞内冰晶形成，提高细胞复苏后存活率；冷冻前渗透到细胞内的DMSO在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞结构过度脱水皱缩。羟乙基淀粉通过竞争结合水的氢原子，使冰晶生成速度减慢，减弱水的固化过程，可以降低细胞外溶质浓度过高造成的细胞损害。低分子不可渗透物质蔗糖能在降温时向细胞外转运细胞内溶质，而复温时则作用相反，从而减轻细胞渗透性损伤。虽然冻存保护剂具有保护作用，但也有一定毒性，其毒性机制可能是：通过细胞膜引起的渗透性损伤、与蛋白质和脂膜结合导致其变性的化学性损伤，毒性损伤与温度和冻存剂的含量有关。目前对于混合性冻存剂的研究主要是寻找对相应组织和细胞具有保护效果最佳、毒性最小、不同种类和不同含量冻存剂的组合。本实验采用DMSO、羟乙基淀粉和蔗糖混合物为组织工程骨的冻存保护剂，结果添加冻存剂组与不添加冻存剂组相比较，细胞周期未见明显变化，无异倍体细胞出现，复温后的组织工程骨生物活性得到了极大程度的改善，但与未行低温保存的新鲜组织工程骨相比较，其生物活性尚有一定的距离。因此，保存组织工程骨所应用的降温复温程序和速率、冻存剂含量和配方的选择如何才能做到最佳，并且方法简便、经济和实用，这些均有待于进一步研究。
编辑／张惠娟
(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)