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【摘 要】微型浮游生物是海洋生态系统中最基本的组成部分。近年来，海洋微型浮游生物群落在海洋生态系统中的地位和作用越来越得到人们的关注，这与微型浮游生物观测技术的发展以及它们在海洋生态系统中的应用有着密切的关系。流式细胞影像系统（Flow CAM）是近年来发展起来的浮游生物生态学研究方法，通过结合流式细胞术和显微镜技术，能够实现浮游生物的自动分类，提高微型浮游生物样品的分析效率。
【关键词】微型浮游生物;Flow CAM;自动分类
1海洋微型浮游生物的研究进程
近年来，由于海洋显微观测技术的发展，使得生物学家能够观察到越来越小的海洋微型浮游生物，进而对它们的分类、生理生态学、种群增长率、营养行为以及在微食物环中的作用研究越来越多。
目前国际上通常所说的海洋微型浮游生物包括微型真核自养生物、微型真核异养生物、微型原核自养生物和微型原核异养生物等单细胞生物以及浮游病毒等多个类群。近年来的研究表明，海洋微型浮游生物在海洋生态系统中的作用尤其是生产力中的作用越来越重要，在海洋生态系统中的生物地球化学循环和能量代谢中发挥着越来越重要的作用。
定量检测微型浮游生物的种群动态变化，不仅有利于研究其种间营养关系，更有助于探索其在海洋生态系统中所起的重要作用。传统显微计数方法虽然可以通过形态特征观察不同类型的微生物来分别计数，但費时费力，人为误差较大。流式细胞摄像系统（Flow CAM）的应用，使得这些问题迎刃而解。
2海洋微型浮游生物观测技术的发展
（1）显微镜计数法
显微镜法是最传统的细胞计数方法。通常用网具采集样品并用固定剂固定后带回实验室，在显微镜下计数。其优点是计数结果准确，可以从物种水平对形态多样性和不规则的浮游生物进行鉴定。但耗时耗力，对操作人员的专业知识及能力要求比较严格，计数结果的人工主观性误差比较大。
（2）浮游生物光学计数器计数法
浮游生物光学计数器（OPC）简便快捷、计数效率高，并且能通过遮挡相同数量光线的球的直径来表示颗粒物的大小，因而得到广泛使用。浮游生物激光计数器（LOPC）在OPC的基础上进行了技术上的改进，将最小粒径扩展到100μm，在海洋生态系统研究中应用比较广泛。
（3）流式细胞仪计数法
流式细胞仪的出现实现了快速、大批量的分析，但不能得到浮游生物直观图像。对于粒径小于50μm和大于100μm的颗粒难于操作，且数据重复性低，难以用于现场监测。
（4）图像拍摄技术分析法
最早的流体成像系统是利用感光胶片和计算机等控制图像和闪存来实现的。随着计算机和图像获取技术的发展，系统逐渐向包含图像、分析和颗粒技术的方向发展。浮游生物视频记录器（VPR）的出现使海洋颗粒物的现场检测成为可能。
（5）流式细胞摄像系统（Flow CAM）分析法
流式细胞摄像系统（Flow CAM）综合了显微镜技术和流式细胞术技术。实现了浮游生物的快速检测与自动分类，减少了人工操作，解决了大规模尺度研究下数据获得相对滞后的问题。在快速检测的同时得到浮游生物的直观形态学图像，测定颗粒粒径范围扩展到了3-3000μm。既能在实验室内进行样品分析，又可以在野外进行连续24小时实时监测，分析样品的数量和速度得到提升。
3流式细胞摄像系统（Flow CAM）的工作原理和流程
流式细胞摄像系统（Flow CAM）包括主机和计算机工作平台两部分，由三个子系统构成：流控系统、光学系统和电学系统。流控系统是蠕动抽水泵将待分析的样品导入流通池，通过调节蠕动抽水泵的速度调节样品经过流通池的速度，流通池根据浮游颗粒物的大小分为不同的规格，用以得到颗粒物的清晰图像。光学系统包括闪频LED光源、荧光探测器和其他一些光学部件。电学系统主要是控制整个设备的运转、获取图像信号以及数据处理等。
Flow CAM的基本工作流程包括：（1）物镜及对应流通池的安装;（2）扫描样品，获得图像及相应的颗粒物信息;（3）建立浮游生物图像数据库;（4）利用Visual Spreadsheet软件对已经分析的样品进行自动识别和分类，获得不同浮游生物类群的丰度。
4流式细胞摄像系统（Flow CAM）在微型浮游生物分类鉴定工作中的应用
流式细胞摄像系统（Flow CAM）是近年来发展起来的一种先进的检测仪器，主要用于快速检测海洋、湖泊、河流等各种水体中的有机和无机悬浮体。Flow CAM在国外海洋研究中的应用较多，在我国只有个别学者利用Flow CAM检测海洋浮游植物物种并建立图谱库。目前我国运用流式细胞摄像系统建立图谱库，来对海洋微型以及超微型浮游生物群落多样性的研究以及它们在海洋生态系统中的研究鲜有报道。入海口和近海海湾是我国赤潮的高发区，而且是重要的渔业生产基地，微型浮游生物种群的变动间接影响着渔业资源的兴衰和分布，部分赤潮种的爆发将会对渔业生产产生不可估量的危害，微型浮游生物种群多样性的变化可以指示海域环境的改变情况，对入海口和近海海湾海域微型浮游生物主要类群建立多参数图谱库，不仅可以实现对沿海海域的微型浮游生物实现实时监控，从而通过种群的变动判断被检测海域环境的变化，而且对于渔业养殖海域赤潮种的快速检测与预警，以及近海渔业资源的分布具有一定的指导意义。
5流式细胞摄像系统（Flow CAM）应用于海洋微型浮游生物分类工作中的局限性和展望
流式细胞摄像系统（Flow CAM）在国外已经获得广泛应用，但在技术上仍存在一些不足，目前应用于海洋浮游生物鉴定和分类工作方面仍存在很大的瓶颈。首先系统对参数的设计还不够全面，尤其是多细胞不规则形态的类群，不能有效的展现所有类群细胞生物的形态特征，如何将多细胞群体分割成单一细胞，直接给出单个细胞的相关参数是需要解决的问题。其次，自动分类仍然需要人工操作的辅助，目前只达到了半自动分类，后续的鉴别工作还需要人工去完成，对时间的节约不是那么的显著。再次，对细胞生理方面的特征信息的获取还有待开发。相信随着图像分析技术的不断完善，流式细胞摄像系统（Flow CAM）在技术方面会不断的优化和完善，在海洋生态系统的研究也会越来越广泛。
参考文献：
[1]陈敏艺，袁洁，陈月琴，屈良鹄.（2005）. 海洋超微型浮游植物遗传多样性的分子系统学研究进展. 自然科学进展，9，1032-1041.
[2]陈纪新，黄邦钦，李少菁.（2006）. 海洋微型浮游植物分子生态学研究进展. 厦门大学学报（自然科学版），2，32-39.
[3]刘昕，张俊彬，黄良民。流式细胞仪在海洋生物学研究中的应用[J]。海洋科学，2007，31（1）：92-96.
基金项目：
国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金资助项目（1602）。
（作者单位：1.国家海洋局海口海洋环境监测中心站;2.国家海洋局南海规划与环境研究院）
【关键词】微型浮游生物;Flow CAM;自动分类
1海洋微型浮游生物的研究进程
近年来，由于海洋显微观测技术的发展，使得生物学家能够观察到越来越小的海洋微型浮游生物，进而对它们的分类、生理生态学、种群增长率、营养行为以及在微食物环中的作用研究越来越多。
目前国际上通常所说的海洋微型浮游生物包括微型真核自养生物、微型真核异养生物、微型原核自养生物和微型原核异养生物等单细胞生物以及浮游病毒等多个类群。近年来的研究表明，海洋微型浮游生物在海洋生态系统中的作用尤其是生产力中的作用越来越重要，在海洋生态系统中的生物地球化学循环和能量代谢中发挥着越来越重要的作用。
定量检测微型浮游生物的种群动态变化，不仅有利于研究其种间营养关系，更有助于探索其在海洋生态系统中所起的重要作用。传统显微计数方法虽然可以通过形态特征观察不同类型的微生物来分别计数，但費时费力，人为误差较大。流式细胞摄像系统（Flow CAM）的应用，使得这些问题迎刃而解。
2海洋微型浮游生物观测技术的发展
（1）显微镜计数法
显微镜法是最传统的细胞计数方法。通常用网具采集样品并用固定剂固定后带回实验室，在显微镜下计数。其优点是计数结果准确，可以从物种水平对形态多样性和不规则的浮游生物进行鉴定。但耗时耗力，对操作人员的专业知识及能力要求比较严格，计数结果的人工主观性误差比较大。
（2）浮游生物光学计数器计数法
浮游生物光学计数器（OPC）简便快捷、计数效率高，并且能通过遮挡相同数量光线的球的直径来表示颗粒物的大小，因而得到广泛使用。浮游生物激光计数器（LOPC）在OPC的基础上进行了技术上的改进，将最小粒径扩展到100μm，在海洋生态系统研究中应用比较广泛。
（3）流式细胞仪计数法
流式细胞仪的出现实现了快速、大批量的分析，但不能得到浮游生物直观图像。对于粒径小于50μm和大于100μm的颗粒难于操作，且数据重复性低，难以用于现场监测。
（4）图像拍摄技术分析法
最早的流体成像系统是利用感光胶片和计算机等控制图像和闪存来实现的。随着计算机和图像获取技术的发展，系统逐渐向包含图像、分析和颗粒技术的方向发展。浮游生物视频记录器（VPR）的出现使海洋颗粒物的现场检测成为可能。
（5）流式细胞摄像系统（Flow CAM）分析法
流式细胞摄像系统（Flow CAM）综合了显微镜技术和流式细胞术技术。实现了浮游生物的快速检测与自动分类，减少了人工操作，解决了大规模尺度研究下数据获得相对滞后的问题。在快速检测的同时得到浮游生物的直观形态学图像，测定颗粒粒径范围扩展到了3-3000μm。既能在实验室内进行样品分析，又可以在野外进行连续24小时实时监测，分析样品的数量和速度得到提升。
3流式细胞摄像系统（Flow CAM）的工作原理和流程
流式细胞摄像系统（Flow CAM）包括主机和计算机工作平台两部分，由三个子系统构成：流控系统、光学系统和电学系统。流控系统是蠕动抽水泵将待分析的样品导入流通池，通过调节蠕动抽水泵的速度调节样品经过流通池的速度，流通池根据浮游颗粒物的大小分为不同的规格，用以得到颗粒物的清晰图像。光学系统包括闪频LED光源、荧光探测器和其他一些光学部件。电学系统主要是控制整个设备的运转、获取图像信号以及数据处理等。
Flow CAM的基本工作流程包括：（1）物镜及对应流通池的安装;（2）扫描样品，获得图像及相应的颗粒物信息;（3）建立浮游生物图像数据库;（4）利用Visual Spreadsheet软件对已经分析的样品进行自动识别和分类，获得不同浮游生物类群的丰度。
4流式细胞摄像系统（Flow CAM）在微型浮游生物分类鉴定工作中的应用
流式细胞摄像系统（Flow CAM）是近年来发展起来的一种先进的检测仪器，主要用于快速检测海洋、湖泊、河流等各种水体中的有机和无机悬浮体。Flow CAM在国外海洋研究中的应用较多，在我国只有个别学者利用Flow CAM检测海洋浮游植物物种并建立图谱库。目前我国运用流式细胞摄像系统建立图谱库，来对海洋微型以及超微型浮游生物群落多样性的研究以及它们在海洋生态系统中的研究鲜有报道。入海口和近海海湾是我国赤潮的高发区，而且是重要的渔业生产基地，微型浮游生物种群的变动间接影响着渔业资源的兴衰和分布，部分赤潮种的爆发将会对渔业生产产生不可估量的危害，微型浮游生物种群多样性的变化可以指示海域环境的改变情况，对入海口和近海海湾海域微型浮游生物主要类群建立多参数图谱库，不仅可以实现对沿海海域的微型浮游生物实现实时监控，从而通过种群的变动判断被检测海域环境的变化，而且对于渔业养殖海域赤潮种的快速检测与预警，以及近海渔业资源的分布具有一定的指导意义。
5流式细胞摄像系统（Flow CAM）应用于海洋微型浮游生物分类工作中的局限性和展望
流式细胞摄像系统（Flow CAM）在国外已经获得广泛应用，但在技术上仍存在一些不足，目前应用于海洋浮游生物鉴定和分类工作方面仍存在很大的瓶颈。首先系统对参数的设计还不够全面，尤其是多细胞不规则形态的类群，不能有效的展现所有类群细胞生物的形态特征，如何将多细胞群体分割成单一细胞，直接给出单个细胞的相关参数是需要解决的问题。其次，自动分类仍然需要人工操作的辅助，目前只达到了半自动分类，后续的鉴别工作还需要人工去完成，对时间的节约不是那么的显著。再次，对细胞生理方面的特征信息的获取还有待开发。相信随着图像分析技术的不断完善，流式细胞摄像系统（Flow CAM）在技术方面会不断的优化和完善，在海洋生态系统的研究也会越来越广泛。
参考文献：
[1]陈敏艺，袁洁，陈月琴，屈良鹄.（2005）. 海洋超微型浮游植物遗传多样性的分子系统学研究进展. 自然科学进展，9，1032-1041.
[2]陈纪新，黄邦钦，李少菁.（2006）. 海洋微型浮游植物分子生态学研究进展. 厦门大学学报（自然科学版），2，32-39.
[3]刘昕，张俊彬，黄良民。流式细胞仪在海洋生物学研究中的应用[J]。海洋科学，2007，31（1）：92-96.
基金项目：
国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金资助项目（1602）。
（作者单位：1.国家海洋局海口海洋环境监测中心站;2.国家海洋局南海规划与环境研究院）