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摘要： 桑蚕丝纤维脱胶是其被深度开发与利用的重要前提，文章通过研究不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维，探讨长时间沸煮取代化学助剂辅助桑蚕丝纤维脱胶的可行性。结果显示：清水沸煮2 h即可完成桑蚕丝纤维的脱胶，而随着清水煮沸时间的增加，桑蚕丝纤维表现出从丝胶溶失逐渐转向丝素中原纤分离的过程，且清水沸煮时间越长，原纤的分离越严重;而XRD、FTIR和热分析的结果表明，桑蚕丝纤维在清水中煮沸对其结晶结构及二级结构组分的影响不大;但SDS-PAGE测试结果表明，清水煮沸时间越长，桑蚕丝纤维的再溶分子量却逐渐减小。
关键词： 桑蚕丝纤维;清水沸煮;桑蚕丝纤维脱胶;桑蚕丝纤维分纤;桑蚕丝纤维溶解
中图分类号： TS143.2
文献标志码： A
文章编号： 10017003（2021）08001107
引用页码： 081103
DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.08.003（篇序）
The splitting behavior and structural properties of mulberry silk fiber boiled by water
PENG Zeye1， LIN Haitao1， HUANG Jiwei1，2， CHEN Jing1， NING Wan’e1
（1.College of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China;2.College of Textile and Clothing Engineering， Soochow University， Suzhou 215123， China）
Abstract： The degumming of mulberry silk fiber is an essential prerequisite for its depth exploitation and utilization. Through the study of boiling mulberry silk in clean water for different time， this paper investigates the feasibility of assisting the degumming of mulberry silk by replacing chemical addictive with long-time boiling. The results showed that the mulberry silk could be degummed by boiling in clean water for 2 h. With the boiling time prolonged， the process from sericin dissolution of mulberry silk to fibril separation was observed， and the longer boiling time in water， the severer the fibril separation of silk fibroin fiber. The results of XRD， FTIR and thermal analysis showed that boiling of mulberry silk in clean water had slight influence on the crystallization structure and secondary structure components， while SDS-PAGE test results indicated that with the boiling time in water prolonged， the resolubilized molecular weight of mulberry silk was gradually reduced.
Key words： mulberry silk fiber; silk boiled by water; degumming of silk; splitting of silk fiber; dissolution of silk fiber
收稿日期： 20210226;
修回日期： 20210707
基金項目： 国家自然科学基金项目（51763001，51963002）;广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA281280）;柳州市科技计划项目（2019DH10602）
作者简介： 彭泽冶（1996），男，硕士研究生，研究方向为蚕丝纤维工程及其再生材料。通信作者：黄继伟，副教授，huangjiwei@gxust.edu.cn。
桑蚕丝纤维作为一种天然蛋白质纤维，已被广泛应用于纺织、生物医学工程、食药品及精细化学品等领域[1-2]。而桑蚕丝纤维脱胶几乎是所有领域应用的前提或加工制备的首道工序，其中化学助剂辅助的高温水沸煮是目前最普遍的桑蚕丝纤维脱胶工艺，然而，通常的化学助剂对桑蚕丝纤维的作用较为剧烈，用量或用时掌握不当极易造成桑蚕丝纤维结构的严重破坏[3]。此外，在一些不适宜添加化学助剂的应用场合，化学助剂的添加需要更为复杂的检验过程[4]。另一方面，桑蚕丝原纤是认识蚕丝纤维层级构造结构的基础，从桑蚕丝纤维中分离出原纤是研究桑蚕丝纤维层级构造结构的重要手段。王建南等[5]利用CaCl2溶液使桑蚕丝纤维分纤，丁欢[6]以超声波辅助CaCl2溶液使桑蚕丝纤维分纤，陈宇岳等[7]则对经分纤后的桑蚕丝纤维进行锡盐填埋处理以获得增重蚕丝的效果，而张锋[8]、刘志[9]、吴惠英等[10]分别以甲酸为溶剂溶解出了桑蚕丝纤维中的纳米原纤组分，并以其为原液进行了再生材料的制备，获得了具有优异力学性能的静电/湿法纺丝纤维。然而，这些使桑蚕丝纤维分纤的方法借助了化学助剂，对桑蚕丝纤维的结构造成了不同程度的破坏。综上所述，本文试图通过清水沸煮桑蚕丝纤维，研究不同时间清水沸煮对桑蚕丝纤维结构的影响，并观察清水沸煮桑蚕丝纤维使其分纤的过程，以探讨在不使用任何化学助剂的情况下，长时间沸煮桑蚕丝纤维进行脱胶和实现分纤的可行性。 1 实 验
1.1 材 料
桑蚕茧（广西融安县金鼎制丝有限责任公司），氯化钙、乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），Acr-Bis（30%，29︰1）、SDS十二烷基硫酸钠溶液（10%）、APS溶液（10%）、G250考馬斯蛋白快速染色液、SDS-PAGE蛋白加样缓冲液（5×）、Maker（相对分子质量11～180 kDa）等SDS-PAGE电泳试剂（福州飞净生物科技有限公司），截留量8～14 kDa透析袋（美国联合碳化物公司）。
1.2 仪 器
高精度电子天平（奥豪斯仪器有限公司），DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（常州市金坛区金城富威试验仪器厂），Discovery TGA 55热重分析仪（美国TA仪器公司），Nicolet 5700型智能傅里叶红外光谱仪（美国热电Nicolet公司），X’Pert-Pro型全自动X射线衍射仪（荷兰PANalytical公司），Phenom Pro X台式扫描电镜（复纳科学仪器有限公司），Bio-Rad电泳仪（美国伯乐公司）。
1.3 方 法
1.3.1 桑蚕丝纤维的沸煮方法
1）用剪刀将桑蚕茧剪开，去除其内的蛹及其蜕皮，获得白净的茧壳，再用手缓慢撕扯茧壳至蓬松状，备用。
2）用电子天平在同环境下同时精确称量之前准备好的蓬松桑蚕丝纤维共9份，每份10 g（记为G1），其中2份用于回潮率测定（记为W1），另外7份用于清水沸煮实验。
3）将每份桑蚕丝纤维装入尼龙网袋，分别置于盛有1 500 mL煮沸水（温度100 ℃）的不锈钢锅进行沸煮，在此过程中，每隔10 min补充一次100 ℃的水，使不锈钢锅中始终维持有1 500 mL水。上述7份桑蚕丝纤维中，其中5份用于表征测试，沸煮时间分别为1、2、3、5 h和10 h，另外2份用于回潮率测定（记为W2），沸煮时间为5 h。
4）经沸煮后的桑蚕丝纤维用清水反复清洗5次，晾干后称重（记为G2）。
5）关于失重率的计算公式如下：
L/%=G1/（1+W1）-G2/（1+W2）G1/（1+W1）（1）
1.3.2 扫描电镜观察
将桑蚕丝纤维样品贴于黏有导电胶的样品台上，喷金30 s，然后采用Phenom Pro X台式扫描电镜对样品进行形貌观察，测试电压10.0 kV。
1.3.3 X射线衍射测试
用剪刀将桑蚕丝纤维样品剪成粉末状，采用X’Pert-Pro型全自动X射线衍射仪进行测试。其中，X射线光源为CuK α射线，电压40 kV，电流25 mA，扫描速度10°/min，扫描范围5°～50°。
1.3.4 红外光谱测试
用剪刀将桑蚕丝纤维样品剪成粉末状，取适量加入KBr粉末中，充分搅拌研磨后制成压片，采用Nicolet 5700智能傅里叶红外光谱仪（FTIR）对其进行测试，范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描64次取平均值。
1.3.5 热重测试
采用Discovery TGA 55热重分析仪对剪成粉末的桑蚕丝纤维进行热失重分析，温度50～500 ℃，升温速率10 ℃/min，测试环境为氮气气氛，氮气流量50 mL/min。
1.3.6 SDS-PAGE测试
1）对于经不同时间沸煮的桑蚕丝纤维，分别取1 g，采用CaCl2-EtOH-H2O溶剂体系对其溶解，其中浴比为1︰50，温度80 ℃，时间2 h;得到的桑蚕丝纤维溶解原液经透析去盐得到纯丝素水溶液;丝素水溶液经聚乙二醇溶液浓缩，其中聚乙二醇相对分子质量20 000，质量分数40%，浓缩时间5 h;将得到的浓缩丝素水溶液经离心机离心，去除不溶物，所得上清液保存于4 ℃冰箱备用。
2）关于所制备丝素溶液质量分数的测算：取干燥载玻片称重（记为W0），用吸管取少许丝素溶液滴入干燥载玻片上测重（记为W1），将载有丝素溶液的载玻片置于60 ℃烘箱中烘干（时间6 h），取出载玻片称重（记为W2）。按照下式计算丝素溶液的质量分数，最终质量分数由上述步骤重复5次求平均值而得。
S/%=W2-W0W1-W0×100（2）
3）制备10 mL 15%分离胶：取dd H2O 2.5 mL，30%丙烯酰胺混合液5.0 mL，1.5M Tris-HCl（pH 8.8）2.5 mL，10%SDS溶液0.1 mL，10%过硫酸铵溶液0.1 mL，0.1 mL TEMED 0004 mL，加入20 mL干净烧杯中均匀混合;用移液枪缓慢注入准备好的玻璃夹板中，并留出一定空间注浓缩胶，分离胶注入完毕后用dd H2O将未注满的玻璃夹板注满，等待凝胶。
4）制备2 mL 5%浓缩胶：取dd H2O 1.4 mL，30%丙烯酰胺混合液0.33 mL，1.0M Tris-HCl（pH 6.8）0.25 mL，10%SDS溶液0.02 mL，10%过硫酸铵溶液0.02 mL，0.1 mL TEMED 0002 mL，加入10 mL干净烧杯中均匀混合;将分离胶上的封水层倒出并用吸水纸将残余的水分吸干，用移液枪将5%的浓缩胶注入，灌满后缓慢插入梳子，等待浓缩胶凝固。
5）将丝素溶液质量分数调节到1%，取80 μL样品蛋白溶液置于EP管内，加入20 μL上样缓冲液，混合均匀后煮沸5～10 min。
6）取出梳子，用dd H2O清洗加样孔并用吸水纸将残余水分吸干，将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20 μL各样品及5 μL Maker标准蛋白。
7）样品在浓缩胶电泳时电压调节为60 V，待溴酚蓝条带即将进入分离胶时调节电压为120 V，当溴酚蓝条带电泳到凝胶底部即将跑出时停止电泳。 8）取出凝胶置于10倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中染色1 h，染色完毕后取出加入20倍体积的脱色液中脱色，直至条带清晰。
2 结果与分析
2.1 失重率分析
表1为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的失重率。
由表1可知，隨着沸煮的时间增加，桑蚕丝纤维的失重率逐渐增加。通常桑蚕丝纤维的丝胶含量为22～25%[11]，而本文中桑蚕丝纤维在清水中沸煮1 h，失重率已达22.71%，说明此时桑蚕丝纤维的脱胶已基本完成;接着清水沸煮2 h和
3 h时，桑蚕丝纤维的失重率略有增加，分析认为此时仍为丝胶的溶失，但溶失量十分微弱，可以认为清水沸煮2 h时，丝胶已经完全除尽;随后，清水沸煮5 h和10 h，桑蚕丝纤维的失重率又显著的增加。从图1可以看出，桑蚕丝纤维表面存在较为严重的分纤现象，说明丝胶完全脱去后桑蚕丝纤维中原纤结构间连接带在沸水中遭到破坏，出现了原纤脱落和分离，进而造成失重率的增加。
2.2 形貌变化
图1为桑蚕丝纤维经不同时间清水沸煮前后的SEM图。其中，图1（a）为未经清水沸煮的桑蚕丝纤维，可以清楚地辨析出丝胶包覆丝素的皮心结构;图1（b）为清水沸煮1 h的桑蚕丝纤维，可以看出桑蚕丝纤维外围的丝胶已基本除尽，但仍有少许的丝胶颗粒;图1（c）为清水沸煮2 h的桑蚕丝纤维，可以看出桑蚕丝纤维表面的丝胶颗粒已经完全去除，桑蚕丝纤维表面的纵向沟壑清晰可辨;图1（d）为清水沸煮3 h的桑蚕丝纤维，可以看出已有大块丝端显露于桑蚕丝纤维表面，但这种现象并不普遍;图1（e）为清水沸煮5 h的桑蚕丝纤维，可以看出丝端显露的越来越清晰，且出现了更加微细的原纤状丝端;图1（f）为清水沸煮10 h的桑蚕丝纤维，可以看出丝端不止是显露于桑蚕丝纤维表面，甚至已经开始出现大规模的脱落和溃散。因此，可以认为随着煮沸时间的增加，桑蚕丝纤维出现越来越明显的分纤行为。
图2为桑蚕丝纤维在清水中沸煮10 h后不同放大倍数的SEM图。由图2可知，桑蚕丝纤维经清水沸煮10 h后，从桑蚕丝纤维基体中显露的原纤是普遍存在的，且尺寸较小的原纤紧贴着桑蚕丝纤维基体，而大尺寸原纤则伸出基体。由此可以猜测，在清水沸煮中，一些小尺寸的原纤已溶于水中，留在桑蚕丝纤维基体上的只剩下较大尺寸尚未分解掉的原纤，而那些紧贴在桑蚕丝纤维基体上的小尺寸原纤因有桑蚕丝纤维基体的牵扯尚留在桑蚕丝纤维上。
2.3 结晶结构分析
图3为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的XRD测试结果。
由图3可以看出，经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的结晶结构并没有出现显著的变化，在9.2°、20.7°和24.7°附近存在较强的衍射峰，而在40.8°和44.6°附近存在微弱的衍射峰，其中9.2°、20.7°和40.8°处的衍射峰属于Silk Ⅱ结晶结构，而24.7°和44.6°处的衍射峰属于Silk Ⅰ结晶结构[12]。由图3（b）～（f）可以看出，经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的XRD图谱可在9.6°、18.1°、20.7°、24.3°、29.0°、38.4°、41.4°和45.3°附近分出衍射峰，其中分峰9.6°、20.7°、24.3°、41.4°和45.3°与原XRD图谱基本对应，而新分峰18.1°、29.0°和38.4°均隶属属于Silk Ⅰ结晶结构。进一步地，根据拟合分峰面积计算桑蚕丝纤维的结晶度，计算方法见下式，计算结果如表2所示。
Xc/%=1-SaS×100（3）
式中：Sa为无定形拟合峰的面积，S为所有拟合峰的面积之和。
由表2可以看出，随着沸煮时间的增加，桑蚕丝纤维的结晶度不仅没有下降，反而存在上升的趋势。分析认为，桑蚕丝纤维在长时间清水沸煮过程中存在无定形区溃散脱落，而结晶区的脱落相对较小。结合式（3）可知，两者因素的综合使得桑蚕丝纤维的相对结晶度提高。
2.4 红外光谱分析
图4为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的FTIR测试结果。
由图4可以看出，经不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的红外光谱相似，没有峰位偏移。在1 655 cm-1和615 cm-1处的吸收峰分别归属于酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅴ带，属于α螺旋结构;在1 514、1 229、698 cm-1处出现的吸收峰值分别属于酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带和酰胺Ⅴ带，属于β折叠结构。为了进一步探究丝素蛋白分子构象的变化，针对酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）进行分峰拟合[13]，各样品的二级结构含量变化结果如表3所示。
由表3可以看出，随着煮沸时间的增加桑蚕丝纤维的α螺旋结构、β转角结构和无规卷曲结构含量逐渐减小，β折叠结构含量逐渐增加。这一结果与XRD分析结果一致，分析认为与桑蚕丝纤维的结晶区稳定性较高导致其在煮沸过程中损失较少有关。
2.5 热性能分析
图5为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的热分析结果。
由图5可以看出，不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的热性能差异不大，均呈现出3阶段变化趋势。第一阶段位于50～250 ℃，质量损失约为3%～6%，主要为桑蚕丝纤维中所含水分的散失[14];第二阶段位于250～360 ℃，质量损失趋势急剧下降，主要来源于桑蚕丝纤维的热分解，质量损失约为50%，质量损失最大速率出现在320℃左右;第三阶段位于360～500 ℃，因为此时桑蚕丝纤维降解接近完毕，热分解速率下降，随着温度的增加桑蚕丝纤维质量变化不大。桑蚕丝纤维的热性能与其结晶结构相关，结晶区的分子排列紧密，分子间作用力强，使其具备比非结晶区更好的热稳定性[15]，故通常丝蛋白材料的结晶度越大其热稳定性越好。而上述热分析结果表明，不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维对其热性能没有影响，这进一步验证了清水沸煮对桑蚕丝纤维的结晶结构没有显著影响。 2.6 分子量分析
图6为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的SDS-PAGE图，其中a～e分别为清水沸煮1、2、3、5、10 h，M为相对分子质量11～180 kDa的Maker标准蛋白。
由图6可知，经不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的SDS-PAGE的结果存在差异。通常认为蚕丝蛋白由相对分子量为390 kDa的重链和相对分子量为25 kDa的轻链组成，两者通过二硫键的形式连接在一起[16]，其中重链贯穿丝素蛋白结晶区和非结晶区，而轻链存在于丝素蛋白的非结晶区;结晶区分子排列紧密、分子间作用力强，结晶区分子排列疏松、分子间空隙较大，水、离子等容易进入，所以丝素的劣化一般先从非结晶区开始[16-17]。图6中样品a、b在相对分子量为25 kDa处有条带出现，而样品c、d、e在相对分子量为25 kDa没有出现条带，这说明随着清水沸煮时间的增加，桑蚕丝纤维的再溶相对分子质量降低。分析认为，虽然清水沸煮未破坏桑蚕丝纤维的结晶结构，但对无定形区中的分子链存在影响，从而导致分子链的断裂。
3 结 论
通过清水沸煮桑蚕丝纤维，研究了不同时间清水沸煮对桑蚕丝纤维结构的影响，并观察其在不同清水沸煮时间中的分纤过程，借助XRD、FTIR、热分析和SDS-PAGE技术对桑蚕丝纤维的结晶结构、二级结构含量、热学性能及相对分子质量进行了表征和分析，得到如下主要结论。
1）桑蚕丝纤维在清水中煮沸1 h后纤维表面残留少量丝胶;在清水中煮沸2 h后蚕丝基本上完成脱胶;在清水中煮沸3 h后桑蚕丝纤维出现分纤现象;在清水中煮沸5 h后纤维出现大量的分纤;在清水中煮沸10 h后桑蚕丝纤维分纤程度更大，普遍出现大原纤分解成微小原纤现象。
2）桑蚕丝纤维在清水中的煮沸时间长短对其结晶结构及二级结构组成影响不大。
3）桑蚕丝纤维在清水中煮沸2 h内分子量的变化不大，煮沸时间在3 h时丝素蛋白的分子量出现明显的减少;并且随着煮沸时间的增加丝素蛋白的分子量越来越小。
上述结果表明，采用长时间清水沸煮桑蚕丝纤维可实现脱尽丝胶的目的，而延长清水沸煮时间还可以在不借助任何化学助剂的前提下实现桑蚕丝纤维原纤的分离，为认识和研究桑蚕丝纤维的层级构造结构提供了新的手段。
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Key words： mulberry silk fiber; silk boiled by water; degumming of silk; splitting of silk fiber; dissolution of silk fiber
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桑蚕丝纤维作为一种天然蛋白质纤维，已被广泛应用于纺织、生物医学工程、食药品及精细化学品等领域[1-2]。而桑蚕丝纤维脱胶几乎是所有领域应用的前提或加工制备的首道工序，其中化学助剂辅助的高温水沸煮是目前最普遍的桑蚕丝纤维脱胶工艺，然而，通常的化学助剂对桑蚕丝纤维的作用较为剧烈，用量或用时掌握不当极易造成桑蚕丝纤维结构的严重破坏[3]。此外，在一些不适宜添加化学助剂的应用场合，化学助剂的添加需要更为复杂的检验过程[4]。另一方面，桑蚕丝原纤是认识蚕丝纤维层级构造结构的基础，从桑蚕丝纤维中分离出原纤是研究桑蚕丝纤维层级构造结构的重要手段。王建南等[5]利用CaCl2溶液使桑蚕丝纤维分纤，丁欢[6]以超声波辅助CaCl2溶液使桑蚕丝纤维分纤，陈宇岳等[7]则对经分纤后的桑蚕丝纤维进行锡盐填埋处理以获得增重蚕丝的效果，而张锋[8]、刘志[9]、吴惠英等[10]分别以甲酸为溶剂溶解出了桑蚕丝纤维中的纳米原纤组分，并以其为原液进行了再生材料的制备，获得了具有优异力学性能的静电/湿法纺丝纤维。然而，这些使桑蚕丝纤维分纤的方法借助了化学助剂，对桑蚕丝纤维的结构造成了不同程度的破坏。综上所述，本文试图通过清水沸煮桑蚕丝纤维，研究不同时间清水沸煮对桑蚕丝纤维结构的影响，并观察清水沸煮桑蚕丝纤维使其分纤的过程，以探讨在不使用任何化学助剂的情况下，长时间沸煮桑蚕丝纤维进行脱胶和实现分纤的可行性。 1 实 验
1.1 材 料
桑蚕茧（广西融安县金鼎制丝有限责任公司），氯化钙、乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），Acr-Bis（30%，29︰1）、SDS十二烷基硫酸钠溶液（10%）、APS溶液（10%）、G250考馬斯蛋白快速染色液、SDS-PAGE蛋白加样缓冲液（5×）、Maker（相对分子质量11～180 kDa）等SDS-PAGE电泳试剂（福州飞净生物科技有限公司），截留量8～14 kDa透析袋（美国联合碳化物公司）。
1.2 仪 器
高精度电子天平（奥豪斯仪器有限公司），DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（常州市金坛区金城富威试验仪器厂），Discovery TGA 55热重分析仪（美国TA仪器公司），Nicolet 5700型智能傅里叶红外光谱仪（美国热电Nicolet公司），X’Pert-Pro型全自动X射线衍射仪（荷兰PANalytical公司），Phenom Pro X台式扫描电镜（复纳科学仪器有限公司），Bio-Rad电泳仪（美国伯乐公司）。
1.3 方 法
1.3.1 桑蚕丝纤维的沸煮方法
1）用剪刀将桑蚕茧剪开，去除其内的蛹及其蜕皮，获得白净的茧壳，再用手缓慢撕扯茧壳至蓬松状，备用。
2）用电子天平在同环境下同时精确称量之前准备好的蓬松桑蚕丝纤维共9份，每份10 g（记为G1），其中2份用于回潮率测定（记为W1），另外7份用于清水沸煮实验。
3）将每份桑蚕丝纤维装入尼龙网袋，分别置于盛有1 500 mL煮沸水（温度100 ℃）的不锈钢锅进行沸煮，在此过程中，每隔10 min补充一次100 ℃的水，使不锈钢锅中始终维持有1 500 mL水。上述7份桑蚕丝纤维中，其中5份用于表征测试，沸煮时间分别为1、2、3、5 h和10 h，另外2份用于回潮率测定（记为W2），沸煮时间为5 h。
4）经沸煮后的桑蚕丝纤维用清水反复清洗5次，晾干后称重（记为G2）。
5）关于失重率的计算公式如下：
L/%=G1/（1+W1）-G2/（1+W2）G1/（1+W1）（1）
1.3.2 扫描电镜观察
将桑蚕丝纤维样品贴于黏有导电胶的样品台上，喷金30 s，然后采用Phenom Pro X台式扫描电镜对样品进行形貌观察，测试电压10.0 kV。
1.3.3 X射线衍射测试
用剪刀将桑蚕丝纤维样品剪成粉末状，采用X’Pert-Pro型全自动X射线衍射仪进行测试。其中，X射线光源为CuK α射线，电压40 kV，电流25 mA，扫描速度10°/min，扫描范围5°～50°。
1.3.4 红外光谱测试
用剪刀将桑蚕丝纤维样品剪成粉末状，取适量加入KBr粉末中，充分搅拌研磨后制成压片，采用Nicolet 5700智能傅里叶红外光谱仪（FTIR）对其进行测试，范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描64次取平均值。
1.3.5 热重测试
采用Discovery TGA 55热重分析仪对剪成粉末的桑蚕丝纤维进行热失重分析，温度50～500 ℃，升温速率10 ℃/min，测试环境为氮气气氛，氮气流量50 mL/min。
1.3.6 SDS-PAGE测试
1）对于经不同时间沸煮的桑蚕丝纤维，分别取1 g，采用CaCl2-EtOH-H2O溶剂体系对其溶解，其中浴比为1︰50，温度80 ℃，时间2 h;得到的桑蚕丝纤维溶解原液经透析去盐得到纯丝素水溶液;丝素水溶液经聚乙二醇溶液浓缩，其中聚乙二醇相对分子质量20 000，质量分数40%，浓缩时间5 h;将得到的浓缩丝素水溶液经离心机离心，去除不溶物，所得上清液保存于4 ℃冰箱备用。
2）关于所制备丝素溶液质量分数的测算：取干燥载玻片称重（记为W0），用吸管取少许丝素溶液滴入干燥载玻片上测重（记为W1），将载有丝素溶液的载玻片置于60 ℃烘箱中烘干（时间6 h），取出载玻片称重（记为W2）。按照下式计算丝素溶液的质量分数，最终质量分数由上述步骤重复5次求平均值而得。
S/%=W2-W0W1-W0×100（2）
3）制备10 mL 15%分离胶：取dd H2O 2.5 mL，30%丙烯酰胺混合液5.0 mL，1.5M Tris-HCl（pH 8.8）2.5 mL，10%SDS溶液0.1 mL，10%过硫酸铵溶液0.1 mL，0.1 mL TEMED 0004 mL，加入20 mL干净烧杯中均匀混合;用移液枪缓慢注入准备好的玻璃夹板中，并留出一定空间注浓缩胶，分离胶注入完毕后用dd H2O将未注满的玻璃夹板注满，等待凝胶。
4）制备2 mL 5%浓缩胶：取dd H2O 1.4 mL，30%丙烯酰胺混合液0.33 mL，1.0M Tris-HCl（pH 6.8）0.25 mL，10%SDS溶液0.02 mL，10%过硫酸铵溶液0.02 mL，0.1 mL TEMED 0002 mL，加入10 mL干净烧杯中均匀混合;将分离胶上的封水层倒出并用吸水纸将残余的水分吸干，用移液枪将5%的浓缩胶注入，灌满后缓慢插入梳子，等待浓缩胶凝固。
5）将丝素溶液质量分数调节到1%，取80 μL样品蛋白溶液置于EP管内，加入20 μL上样缓冲液，混合均匀后煮沸5～10 min。
6）取出梳子，用dd H2O清洗加样孔并用吸水纸将残余水分吸干，将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20 μL各样品及5 μL Maker标准蛋白。
7）样品在浓缩胶电泳时电压调节为60 V，待溴酚蓝条带即将进入分离胶时调节电压为120 V，当溴酚蓝条带电泳到凝胶底部即将跑出时停止电泳。 8）取出凝胶置于10倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中染色1 h，染色完毕后取出加入20倍体积的脱色液中脱色，直至条带清晰。
2 结果与分析
2.1 失重率分析
表1为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的失重率。
由表1可知，隨着沸煮的时间增加，桑蚕丝纤维的失重率逐渐增加。通常桑蚕丝纤维的丝胶含量为22～25%[11]，而本文中桑蚕丝纤维在清水中沸煮1 h，失重率已达22.71%，说明此时桑蚕丝纤维的脱胶已基本完成;接着清水沸煮2 h和
3 h时，桑蚕丝纤维的失重率略有增加，分析认为此时仍为丝胶的溶失，但溶失量十分微弱，可以认为清水沸煮2 h时，丝胶已经完全除尽;随后，清水沸煮5 h和10 h，桑蚕丝纤维的失重率又显著的增加。从图1可以看出，桑蚕丝纤维表面存在较为严重的分纤现象，说明丝胶完全脱去后桑蚕丝纤维中原纤结构间连接带在沸水中遭到破坏，出现了原纤脱落和分离，进而造成失重率的增加。
2.2 形貌变化
图1为桑蚕丝纤维经不同时间清水沸煮前后的SEM图。其中，图1（a）为未经清水沸煮的桑蚕丝纤维，可以清楚地辨析出丝胶包覆丝素的皮心结构;图1（b）为清水沸煮1 h的桑蚕丝纤维，可以看出桑蚕丝纤维外围的丝胶已基本除尽，但仍有少许的丝胶颗粒;图1（c）为清水沸煮2 h的桑蚕丝纤维，可以看出桑蚕丝纤维表面的丝胶颗粒已经完全去除，桑蚕丝纤维表面的纵向沟壑清晰可辨;图1（d）为清水沸煮3 h的桑蚕丝纤维，可以看出已有大块丝端显露于桑蚕丝纤维表面，但这种现象并不普遍;图1（e）为清水沸煮5 h的桑蚕丝纤维，可以看出丝端显露的越来越清晰，且出现了更加微细的原纤状丝端;图1（f）为清水沸煮10 h的桑蚕丝纤维，可以看出丝端不止是显露于桑蚕丝纤维表面，甚至已经开始出现大规模的脱落和溃散。因此，可以认为随着煮沸时间的增加，桑蚕丝纤维出现越来越明显的分纤行为。
图2为桑蚕丝纤维在清水中沸煮10 h后不同放大倍数的SEM图。由图2可知，桑蚕丝纤维经清水沸煮10 h后，从桑蚕丝纤维基体中显露的原纤是普遍存在的，且尺寸较小的原纤紧贴着桑蚕丝纤维基体，而大尺寸原纤则伸出基体。由此可以猜测，在清水沸煮中，一些小尺寸的原纤已溶于水中，留在桑蚕丝纤维基体上的只剩下较大尺寸尚未分解掉的原纤，而那些紧贴在桑蚕丝纤维基体上的小尺寸原纤因有桑蚕丝纤维基体的牵扯尚留在桑蚕丝纤维上。
2.3 结晶结构分析
图3为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的XRD测试结果。
由图3可以看出，经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的结晶结构并没有出现显著的变化，在9.2°、20.7°和24.7°附近存在较强的衍射峰，而在40.8°和44.6°附近存在微弱的衍射峰，其中9.2°、20.7°和40.8°处的衍射峰属于Silk Ⅱ结晶结构，而24.7°和44.6°处的衍射峰属于Silk Ⅰ结晶结构[12]。由图3（b）～（f）可以看出，经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的XRD图谱可在9.6°、18.1°、20.7°、24.3°、29.0°、38.4°、41.4°和45.3°附近分出衍射峰，其中分峰9.6°、20.7°、24.3°、41.4°和45.3°与原XRD图谱基本对应，而新分峰18.1°、29.0°和38.4°均隶属属于Silk Ⅰ结晶结构。进一步地，根据拟合分峰面积计算桑蚕丝纤维的结晶度，计算方法见下式，计算结果如表2所示。
Xc/%=1-SaS×100（3）
式中：Sa为无定形拟合峰的面积，S为所有拟合峰的面积之和。
由表2可以看出，随着沸煮时间的增加，桑蚕丝纤维的结晶度不仅没有下降，反而存在上升的趋势。分析认为，桑蚕丝纤维在长时间清水沸煮过程中存在无定形区溃散脱落，而结晶区的脱落相对较小。结合式（3）可知，两者因素的综合使得桑蚕丝纤维的相对结晶度提高。
2.4 红外光谱分析
图4为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的FTIR测试结果。
由图4可以看出，经不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的红外光谱相似，没有峰位偏移。在1 655 cm-1和615 cm-1处的吸收峰分别归属于酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅴ带，属于α螺旋结构;在1 514、1 229、698 cm-1处出现的吸收峰值分别属于酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带和酰胺Ⅴ带，属于β折叠结构。为了进一步探究丝素蛋白分子构象的变化，针对酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）进行分峰拟合[13]，各样品的二级结构含量变化结果如表3所示。
由表3可以看出，随着煮沸时间的增加桑蚕丝纤维的α螺旋结构、β转角结构和无规卷曲结构含量逐渐减小，β折叠结构含量逐渐增加。这一结果与XRD分析结果一致，分析认为与桑蚕丝纤维的结晶区稳定性较高导致其在煮沸过程中损失较少有关。
2.5 热性能分析
图5为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的热分析结果。
由图5可以看出，不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的热性能差异不大，均呈现出3阶段变化趋势。第一阶段位于50～250 ℃，质量损失约为3%～6%，主要为桑蚕丝纤维中所含水分的散失[14];第二阶段位于250～360 ℃，质量损失趋势急剧下降，主要来源于桑蚕丝纤维的热分解，质量损失约为50%，质量损失最大速率出现在320℃左右;第三阶段位于360～500 ℃，因为此时桑蚕丝纤维降解接近完毕，热分解速率下降，随着温度的增加桑蚕丝纤维质量变化不大。桑蚕丝纤维的热性能与其结晶结构相关，结晶区的分子排列紧密，分子间作用力强，使其具备比非结晶区更好的热稳定性[15]，故通常丝蛋白材料的结晶度越大其热稳定性越好。而上述热分析结果表明，不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维对其热性能没有影响，这进一步验证了清水沸煮对桑蚕丝纤维的结晶结构没有显著影响。 2.6 分子量分析
图6为经不同时间清水沸煮桑蚕丝纤维的SDS-PAGE图，其中a～e分别为清水沸煮1、2、3、5、10 h，M为相对分子质量11～180 kDa的Maker标准蛋白。
由图6可知，经不同时间清水煮沸桑蚕丝纤维的SDS-PAGE的结果存在差异。通常认为蚕丝蛋白由相对分子量为390 kDa的重链和相对分子量为25 kDa的轻链组成，两者通过二硫键的形式连接在一起[16]，其中重链贯穿丝素蛋白结晶区和非结晶区，而轻链存在于丝素蛋白的非结晶区;结晶区分子排列紧密、分子间作用力强，结晶区分子排列疏松、分子间空隙较大，水、离子等容易进入，所以丝素的劣化一般先从非结晶区开始[16-17]。图6中样品a、b在相对分子量为25 kDa处有条带出现，而样品c、d、e在相对分子量为25 kDa没有出现条带，这说明随着清水沸煮时间的增加，桑蚕丝纤维的再溶相对分子质量降低。分析认为，虽然清水沸煮未破坏桑蚕丝纤维的结晶结构，但对无定形区中的分子链存在影响，从而导致分子链的断裂。
3 结 论
通过清水沸煮桑蚕丝纤维，研究了不同时间清水沸煮对桑蚕丝纤维结构的影响，并观察其在不同清水沸煮时间中的分纤过程，借助XRD、FTIR、热分析和SDS-PAGE技术对桑蚕丝纤维的结晶结构、二级结构含量、热学性能及相对分子质量进行了表征和分析，得到如下主要结论。
1）桑蚕丝纤维在清水中煮沸1 h后纤维表面残留少量丝胶;在清水中煮沸2 h后蚕丝基本上完成脱胶;在清水中煮沸3 h后桑蚕丝纤维出现分纤现象;在清水中煮沸5 h后纤维出现大量的分纤;在清水中煮沸10 h后桑蚕丝纤维分纤程度更大，普遍出现大原纤分解成微小原纤现象。
2）桑蚕丝纤维在清水中的煮沸时间长短对其结晶结构及二级结构组成影响不大。
3）桑蚕丝纤维在清水中煮沸2 h内分子量的变化不大，煮沸时间在3 h时丝素蛋白的分子量出现明显的减少;并且随着煮沸时间的增加丝素蛋白的分子量越来越小。
上述结果表明，采用长时间清水沸煮桑蚕丝纤维可实现脱尽丝胶的目的，而延长清水沸煮时间还可以在不借助任何化学助剂的前提下实现桑蚕丝纤维原纤的分离，为认识和研究桑蚕丝纤维的层级构造结构提供了新的手段。
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