【摘 要】
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肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖.肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过
【机 构】
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江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;
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肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖.肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid,L-IdoA).文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造.比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+)和pCold Ⅲ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pCold Ⅲ表达酶活最高,达到(1 873.61±5.42) U/L.为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50％,酶活达到(2 409.25±6.43) U/L.在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体(V153R)的酶活和比酶活分别为(5 804.32±5.63) U/L和(145.14±2.33) U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍.肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础.
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