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摘 要：驴由于役用功能减弱、养殖效益差等原因，近年来存栏数量骤减；同时受母畜季节性发情、生殖道结构特殊、繁殖周期长等生理条件限制，驴精液冷冻研究及应用一直没有系统展开。概述了国内外驴精液采集、稀释液的优化、冷冻后精液品质的评价及人工输精等方面的技术应用。
关键词：驴；精液冷冻；稀释液；人工授精
中图分类号 S85822 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）03-121-04
Application of Related Technology of Semen Freezing of Donkey
Zhang Ruitao1， 2 et al.
（1 Shandong Normal University， Ji’nan 250013，China； 2 Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Science， Ji’nan 250100，China）
Abstract：The living number of donkey has been dropping quickly in recent years， because of draft function abated， deficiency of breeding benefit. At the same time， semen freezing research and application of jack have not been launched on system， mainly due to season oestrus， special structure of genital tract of jenny， long reproduction cycle and confined by other physiological conditions. Based on the domestic and foreign research data， this review focuses on the application of semen acquisition， the optimization of diluent， the technology of semen quality evaluation and artificial insemination （AI）.
Key words：Donkey；Semen freezing；Diluent；Artificial insemination （AI）
历史上驴一直是役用为主，肉、革、药等综合利用为辅。近年来由于农业和运输业的快速发展，驴在许多国家已经逐渐退出役用及运输工具的行列，导致驴的养殖规模日益缩小，存栏量以每年3.6%的速度递减。据《中国农村统计年鉴》公布的数据显示，我国家驴正面临着种质资源逐步退化、驴群数量骤减和质量逐渐降低的严峻形势。自1798年Lazzaro Spallanzani等[1]成功实施人工授精试验以来，在众多科研工作者的努力下人工授精技术逐步完善，从试验阶段迅速走向实用阶段，目前已成为家畜改良和生产力提高的重要手段。另外精液冷冻和人工输精在马、羊等动物中的应用也非常广泛，但其在驴中的应用非常有限。因而加大驴的人工繁殖技术研究力度，对未来提高驴的遗传品质、增加种群数量、避免驴品种灭绝均有重要意义。驴的人工授精包括精液采集、精液品质评定、精液的处理及冷冻保存、输精4个环节，笔者重点概述国内外来在驴人工授精方面的最新研究成果。
1 精液采集
采精是人工授精的重要环节。国外对马、驴采精多采用全自动采精仪分别收集射精各阶段不同密度的精液[2]，进行精液品质评价分析。国内驴精液采集多用假阴道刺激收集。与牛相比，公驴、马的睾丸及阴茎均较大，因而驴采精需要特制的假阴道，长度、内径均比牛用的要大许多；且公驴达到勃起及射精的性准备活动时间较长，约为5～30min；整个射精时间约为6～12s，射精量大约为10～110mL。采精前先装好假阴道，假阴道内加1.5～2L水（约为假阴道容积的1/2）[3]，水温45～55℃（冬季采精水降温快，夏季降温慢，可根据环境温度及驴采精时的反应适当调节水温）。在接精杯口铺4～6层纱布，将接精杯固定在假阴道的精液收集端。假阴道装好后放到45℃恒温箱中保温。
让公驴攀爬固定好的发情母驴或台畜，刺激公驴兴奋使其阴茎勃起。阴茎勃起后，采精员根据阴茎大小及公驴喜好调整假阴道压力，右手托假阴道站在母驴右侧，待公驴爬上母驴左手轻托阴茎，假阴道置于母驴生殖道位置将阴茎自然导入假阴道内[3]。射精时公驴尾根抽动，待不抽动时射精完成，此时可排气减压使阴茎自然地缩出假阴道。竖起假阴道使精液完全滤到接精杯内。每头驴隔2～3d采集精液1次[4]。
2 冷冻保存液的优化
精液冷冻过程中精子损伤主要有2种类型：氧化性损伤和物理性损伤[5]，因此精液冷冻保存技术的研究多数集中在如何降低氧化性损伤和物理性损伤两方面。
2.1 氧化性损伤的降低 氧化性损伤主要是由于氧化应激引起的，是影响受孕率的一个主要因素[6]。氧化应激会导致精子损伤、畸形甚至引起雄性不育[6]。高浓度的活性氧会引起精子核酸磷酸化不足、脂质过氧化、运动和存活能力下降等[6]，但低浓度的活性氧或将活性氧浓度控制在一定范围，会对精子的正常生理功能（比如精子获能、顶体反应和受精信号传导等方面）维持起重要作用[7]。在精液贮藏用稀释液中添加适量抗氧化剂或抗氧化剂酶能在精液冷冻时保证精子品质不降低[6]。
维生素E能直接阻断由亚铁抗坏血酸引起的脂质过氧化反应产生的自由基，比如过氧化氢、烷氧基，因此一直作为一种主要的抗氧化剂使用[8]。Mn2+能通过降低氧化应激来提高精子活性、存活时间、精子获能和顶体反应[9-10]。研究发现在冷冻稀释液中分别添加维生素E及 Mn2+，能对牛、绵羊、山羊[7]、猪、犬和人的精子提供保护作用，并且能提高解冻后精子活力、膜完整性等精子品质指标。 抗氧化剂酶也是一种天然的抗氧化剂，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR） ，它们能消除过量活性氧从而保护细胞结构免受损伤。Bustamante Filho等[11]比较研究了马的鲜精、脱脂奶-卵黄稀释液稀释的精液和解冻后的精液中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化能力的活力变化，结果发现鲜精中3种抗氧化剂酶活性显著高于稀释后的精液和解冻后的精液（P<0.01），但稀释后的精液和解冻的精液中3种酶活性差异不显著（P>0.05）。在离心去除精清中抗氧化酶的情况下，精液冷冻前后3种酶活性差异不显著（P>0.05）。因而，上述实验结果提示我们如在马、驴冷冻精液制作过程中，在稀释液中适量添加抗氧化酶，可弥补离心去除精清过程中损失的抗氧化酶，从而提高马、驴冷冻精液解冻后的品质。
2.2 物理性损伤的优化 物理性损伤主要是由于细胞内外形成冰晶造成的。一方面冰晶会破坏细胞结构，另一方面局部结冰会使细胞内渗透压发生变化，对细胞造成损伤[12-13]。细胞冷冻时，首先在细胞外形成冰晶，在-10℃以上细胞内仍不能结冰，当继续降温时，细胞外冰晶加快形成[12]。而在未结冰的水中，溶质的浓度越来越高，这会使细胞内过冷溶液和细胞外愈益变浓的溶质之间的化学势出现巨大差异。当降温速率较慢时，细胞外的溶液中首先出现冰晶，细胞内外出现化学势差异，促使细胞内的水分通过细胞膜向外渗出，细胞内溶质浓度升高，产生细胞膜和胞内蛋白损伤，即“溶质损伤”[12-13]；而当降温速率较快时，细胞内部水分来不及外渗，就会出现胞内冰晶网，对细胞膜造成机械损伤[14]。精液在降温过程中0～60℃为有害温度区域，因此在精液的冷冻过程中要尽快通过这个温度危险区，才能获得比较理想的冷冻效果。理论上马、驴精液冷冻最佳降温速度是36.5℃/min[12]。
细胞外冰晶的形成强烈地改变着细胞所处溶液的性质，这种变化常称为“溶液效应”。发生这种现象的原因是冷冻时冰晶与溶质分离。添加非电解质，如甘油等，可明显改变溶液效应。Vidament等[15]报道在冷冻驴精液时添加2.2%、3.5%、4.8%的甘油，均影响受胎率，他们推测甘油可能对母驴的生殖道有毒性作用。近2年间我们课题组用含5.9%的甘油冷冻保存了50 000多份驴的精液，2012年在5个试验基地共725头驴和马的配种试验中，3个情期不返情率（受孕率）为53.11%，与鲜精配种结果相当。
3 精液品质评价
精液品质决定精液样品的取舍和原精的稀释倍数，现行精液品质评定多从外观评定、显微镜评定活力和生化检查三方面进行。驴的原精活力70%～80%，高于马；驴精液pH=7.6，明显不同于牛、羊精液的pH=6.5～6.9。本节重点介绍精子活力、顶体完整性、线粒体活性、DNA完整性和精子膜完整性等实验室评价技术[5]。
3.1 膜完整性检测 质膜是精子最外层的细胞结构，对细胞内外起着生理屏障作用，其完整性与精子正常的生理功能、新陈代谢、获能、顶体反应、雄配子和雌配子的结合、精子与卵细胞的融合过程有着直接的联系。有研究表明精子质膜是最易损伤的部位，其完整性是精子死活的间接指标。检测膜完整性较经典的方法是Osinowo等发明的低渗肿胀测试法（HOST）。操作要点[16]：将精液用低渗溶液稀释，37℃孵育后取混合均匀的样品涂到37℃预热的载玻片上，在400倍光学显微镜下观察。膜完整的精细胞通过低渗肿胀测试后尾卷曲，膜不完整的精子不出现这种现象[28]。
3.2 线粒体活性检测 线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，线粒体活性直接影响着精子的受精能力。精子线粒体活性可用罗丹明123（Rh123）染色的方法鉴定。罗丹明123是一种可以通过细胞膜、能染色活细胞线粒体的荧光染料，对细胞没有毒性，仅几分钟就可和具有活性的线粒体结合，呈黄绿色荧光[17]。操作要点[16]：将罗丹明123溶于HEPES/BSA溶液中，取精液样品加到罗丹明染液中，随后置于潮湿黑暗的地方37℃孵育30min后取样制片，400倍荧光显微镜观察。
3.3 顶体完整性检测 采用与异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素（FITC—PNA）检测顶体完整性[18]。操作要点[16]：取精子样品涂片，风干后用甲醇固定再风干。将玻片浸没在FITC—PNA溶液中。用PBS漂洗玻片，风干后涂一层防褪色溶液保护荧光，封片，荧光显微镜下观察，顶体完整的精子细胞发出强荧光。
3.4 DNA完整性检测 Evenson等科研工作者发明并改进了用染色质结构分析（SCSA）的方法来检测精子DNA完整性[19-20]。基本原理是：精子冷冻后受损伤的DNA会断裂为单链，吖啶橙（AO）可与双链DNA精子结合呈单体形式发出绿色荧光，而与单链DNA精子结合呈聚合物形式发出红色或黄色荧光。检测方法[16]：用TNE buffer稀释精液样品，低pH洗涤液洗30s，再用吖啶橙染色6min。蒸馏水漂洗后盖上盖玻片荧光显微镜下观察。DNA完整的精子细胞发出绿色荧光，DNA链断裂或单链DNA发出橘黄色、黄色、红色荧光。
DNA完整性检测还可以用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测。单细胞凝胶电泳技术由Ostling等首创，后经Singh等[21]进一步完善而逐渐发展起来，是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验（comet assay）。操作要点[22]：先用正常熔点琼脂糖制备第1层胶，再将稀释精液样品、低熔点琼脂糖涂于第1层胶上，然后分别用裂解液、RNase和蛋白酶K消化处理，电泳、染色，400倍荧光显微镜下观察。 DNA断裂的细胞会形成彗星样条带，DNA完整的精细胞则不会出现这种情况。Rahul等[23]用SCGE法分析冬季和夏季精子冷冻前与冷冻后DNA完整性，发现水牛精子冷冻后DNA损伤程度高（P<0.05）；同时发现夏季DNA损伤程度显著高于冬季（P<0.05）。Fraser等[40]用SCGE法检测猪精子DNA完整性，发现冷冻-解冻可引起精子DNA片段化程度增高（P<0.05），而与采精方法及使用的冻存液类型无关。 虽然驴精液冻存研究较少，相关检测方法在驴中也未见相关报道，但鉴于精子这5种冻后指标检测方法在人、牛、猪等物种中都有相关应用[15，22，24]，因此推测在驴精子冻存检测中也是适用的。
4 人工输精技术
与其他家畜相比，马和驴人工授精技术发展相对缓慢，主要原因一是缺乏繁殖记录，对驴排卵机制认知有限。驴发情周期大约20～40d，多数品种在23～30d，发情持续6～9d，其中发情5～6d后才排卵；二是对此的认同度不高[25]，马及驴的本交或人工授精在1个发情周期中大约要进行2～4次，显著不同于牛的人工输精；三是在马和驴人工输精过程中出现了其他物种不存在的技术障碍，如母驴的子宫颈通常比母马长，且子宫颈口直径较小[25]。但驴和马有一定的经济价值，且人工授精技术在大规模饲养条件下可较大程度上降低养殖成本、减少疫病传播、提高优良种质利用效率、选择最佳的配种时机等，因而有必要形成一套有效的人工辅助繁殖技术[25]。
马低剂量人工输精经常采用子宫颈深部授精的方式，即用导管将精液输送到与卵巢卵泡发育同侧的近输卵管乳突部，此方法在精子数量有限的条件下能有效提高受精率[27-28]。目前常用的有直肠引导深角授精技术（TRG）和宫腔镜深角授精技术（HYS）2种方式。宫腔镜深角授精使得授精位置准确，但宫腔镜设备昂贵[29]，且子宫内窥镜检测和相关的空气扩张子宫可能引起细菌滋生造成子宫内膜炎[30]，也会降低受孕率。采用一次性授精管通过直肠引导的方式将精液输送到近输卵管乳突部的方法可替代宫腔镜授精方法[31]。
19卷03期张瑞涛等 驴精液采集与冷冻相关技术研究TRG操作要点[16，19]：吸取精液，手拿导管经产道穿过子宫颈，然后将手臂撤出产道插入直肠，经直肠引导输精管到达与卵泡发育的卵巢同侧的子宫角顶部。通过触诊的方式确认输精管末端到达子宫角顶端，推动注射器慢慢将精液缓缓注入子宫腔内。拔下注射器吸取3mL空气接到输精管上缓缓压到输精管中，确保精液完全排出输精管。输精结束3min后再让驴走动。HYS操作要点[29]：与直肠引导输精技术相似，手拿可弯曲的内窥镜进入产道穿过子宫颈。撤出手臂插入到直肠中，通过直肠引导内窥镜到与卵泡发育的卵巢同侧的子宫角中。向子宫角末端充气，使内窥镜前行，直至看到输卵管乳头。内部输精管前行到接近输卵管乳头，此时将精液全部排到乳头内。将输精管撤出，将内窥镜撤到子宫角底排除子宫内的空气，最后将内窥镜撤出。
对比2种授精方式，Lindsey等[33]认为HYS（5/10，50%）比TRG（0/10，0%）受孕率高，但Brinsko等[32]认为HYS（12/18，66%）和TRG（10/18，56%）2种授精方式受孕率差异不显著，后来Lindsey等[34]研究发现HYS（12/22，）和TRG（9/24）2种授精方式对受孕率影响不显著。Hayden 等[29]进一步研究发现：输精量足够时2种授精方式对受孕率影响不大，但当输精量在25×106～50×106时明显影响受孕率，因而建议用冻存精液或性控筛选精液配种时需采用深角输精法。
参考文献
[1]Pacey A.A， Tomlinson J.M. Sperm Banking： Theory and Practice [M].Cambridge University， Cambridge University Press， 2009.
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[3]曾维斌，王艳萍. 马、驴精液保存研究进展 [J]. 中国食草动物，2009，29 （4）：59-62.
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关键词：驴；精液冷冻；稀释液；人工授精
中图分类号 S85822 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）03-121-04
Application of Related Technology of Semen Freezing of Donkey
Zhang Ruitao1， 2 et al.
（1 Shandong Normal University， Ji’nan 250013，China； 2 Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Science， Ji’nan 250100，China）
Abstract：The living number of donkey has been dropping quickly in recent years， because of draft function abated， deficiency of breeding benefit. At the same time， semen freezing research and application of jack have not been launched on system， mainly due to season oestrus， special structure of genital tract of jenny， long reproduction cycle and confined by other physiological conditions. Based on the domestic and foreign research data， this review focuses on the application of semen acquisition， the optimization of diluent， the technology of semen quality evaluation and artificial insemination （AI）.
Key words：Donkey；Semen freezing；Diluent；Artificial insemination （AI）
历史上驴一直是役用为主，肉、革、药等综合利用为辅。近年来由于农业和运输业的快速发展，驴在许多国家已经逐渐退出役用及运输工具的行列，导致驴的养殖规模日益缩小，存栏量以每年3.6%的速度递减。据《中国农村统计年鉴》公布的数据显示，我国家驴正面临着种质资源逐步退化、驴群数量骤减和质量逐渐降低的严峻形势。自1798年Lazzaro Spallanzani等[1]成功实施人工授精试验以来，在众多科研工作者的努力下人工授精技术逐步完善，从试验阶段迅速走向实用阶段，目前已成为家畜改良和生产力提高的重要手段。另外精液冷冻和人工输精在马、羊等动物中的应用也非常广泛，但其在驴中的应用非常有限。因而加大驴的人工繁殖技术研究力度，对未来提高驴的遗传品质、增加种群数量、避免驴品种灭绝均有重要意义。驴的人工授精包括精液采集、精液品质评定、精液的处理及冷冻保存、输精4个环节，笔者重点概述国内外来在驴人工授精方面的最新研究成果。
1 精液采集
采精是人工授精的重要环节。国外对马、驴采精多采用全自动采精仪分别收集射精各阶段不同密度的精液[2]，进行精液品质评价分析。国内驴精液采集多用假阴道刺激收集。与牛相比，公驴、马的睾丸及阴茎均较大，因而驴采精需要特制的假阴道，长度、内径均比牛用的要大许多；且公驴达到勃起及射精的性准备活动时间较长，约为5～30min；整个射精时间约为6～12s，射精量大约为10～110mL。采精前先装好假阴道，假阴道内加1.5～2L水（约为假阴道容积的1/2）[3]，水温45～55℃（冬季采精水降温快，夏季降温慢，可根据环境温度及驴采精时的反应适当调节水温）。在接精杯口铺4～6层纱布，将接精杯固定在假阴道的精液收集端。假阴道装好后放到45℃恒温箱中保温。
让公驴攀爬固定好的发情母驴或台畜，刺激公驴兴奋使其阴茎勃起。阴茎勃起后，采精员根据阴茎大小及公驴喜好调整假阴道压力，右手托假阴道站在母驴右侧，待公驴爬上母驴左手轻托阴茎，假阴道置于母驴生殖道位置将阴茎自然导入假阴道内[3]。射精时公驴尾根抽动，待不抽动时射精完成，此时可排气减压使阴茎自然地缩出假阴道。竖起假阴道使精液完全滤到接精杯内。每头驴隔2～3d采集精液1次[4]。
2 冷冻保存液的优化
精液冷冻过程中精子损伤主要有2种类型：氧化性损伤和物理性损伤[5]，因此精液冷冻保存技术的研究多数集中在如何降低氧化性损伤和物理性损伤两方面。
2.1 氧化性损伤的降低 氧化性损伤主要是由于氧化应激引起的，是影响受孕率的一个主要因素[6]。氧化应激会导致精子损伤、畸形甚至引起雄性不育[6]。高浓度的活性氧会引起精子核酸磷酸化不足、脂质过氧化、运动和存活能力下降等[6]，但低浓度的活性氧或将活性氧浓度控制在一定范围，会对精子的正常生理功能（比如精子获能、顶体反应和受精信号传导等方面）维持起重要作用[7]。在精液贮藏用稀释液中添加适量抗氧化剂或抗氧化剂酶能在精液冷冻时保证精子品质不降低[6]。
维生素E能直接阻断由亚铁抗坏血酸引起的脂质过氧化反应产生的自由基，比如过氧化氢、烷氧基，因此一直作为一种主要的抗氧化剂使用[8]。Mn2+能通过降低氧化应激来提高精子活性、存活时间、精子获能和顶体反应[9-10]。研究发现在冷冻稀释液中分别添加维生素E及 Mn2+，能对牛、绵羊、山羊[7]、猪、犬和人的精子提供保护作用，并且能提高解冻后精子活力、膜完整性等精子品质指标。 抗氧化剂酶也是一种天然的抗氧化剂，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR） ，它们能消除过量活性氧从而保护细胞结构免受损伤。Bustamante Filho等[11]比较研究了马的鲜精、脱脂奶-卵黄稀释液稀释的精液和解冻后的精液中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化能力的活力变化，结果发现鲜精中3种抗氧化剂酶活性显著高于稀释后的精液和解冻后的精液（P<0.01），但稀释后的精液和解冻的精液中3种酶活性差异不显著（P>0.05）。在离心去除精清中抗氧化酶的情况下，精液冷冻前后3种酶活性差异不显著（P>0.05）。因而，上述实验结果提示我们如在马、驴冷冻精液制作过程中，在稀释液中适量添加抗氧化酶，可弥补离心去除精清过程中损失的抗氧化酶，从而提高马、驴冷冻精液解冻后的品质。
2.2 物理性损伤的优化 物理性损伤主要是由于细胞内外形成冰晶造成的。一方面冰晶会破坏细胞结构，另一方面局部结冰会使细胞内渗透压发生变化，对细胞造成损伤[12-13]。细胞冷冻时，首先在细胞外形成冰晶，在-10℃以上细胞内仍不能结冰，当继续降温时，细胞外冰晶加快形成[12]。而在未结冰的水中，溶质的浓度越来越高，这会使细胞内过冷溶液和细胞外愈益变浓的溶质之间的化学势出现巨大差异。当降温速率较慢时，细胞外的溶液中首先出现冰晶，细胞内外出现化学势差异，促使细胞内的水分通过细胞膜向外渗出，细胞内溶质浓度升高，产生细胞膜和胞内蛋白损伤，即“溶质损伤”[12-13]；而当降温速率较快时，细胞内部水分来不及外渗，就会出现胞内冰晶网，对细胞膜造成机械损伤[14]。精液在降温过程中0～60℃为有害温度区域，因此在精液的冷冻过程中要尽快通过这个温度危险区，才能获得比较理想的冷冻效果。理论上马、驴精液冷冻最佳降温速度是36.5℃/min[12]。
细胞外冰晶的形成强烈地改变着细胞所处溶液的性质，这种变化常称为“溶液效应”。发生这种现象的原因是冷冻时冰晶与溶质分离。添加非电解质，如甘油等，可明显改变溶液效应。Vidament等[15]报道在冷冻驴精液时添加2.2%、3.5%、4.8%的甘油，均影响受胎率，他们推测甘油可能对母驴的生殖道有毒性作用。近2年间我们课题组用含5.9%的甘油冷冻保存了50 000多份驴的精液，2012年在5个试验基地共725头驴和马的配种试验中，3个情期不返情率（受孕率）为53.11%，与鲜精配种结果相当。
3 精液品质评价
精液品质决定精液样品的取舍和原精的稀释倍数，现行精液品质评定多从外观评定、显微镜评定活力和生化检查三方面进行。驴的原精活力70%～80%，高于马；驴精液pH=7.6，明显不同于牛、羊精液的pH=6.5～6.9。本节重点介绍精子活力、顶体完整性、线粒体活性、DNA完整性和精子膜完整性等实验室评价技术[5]。
3.1 膜完整性检测 质膜是精子最外层的细胞结构，对细胞内外起着生理屏障作用，其完整性与精子正常的生理功能、新陈代谢、获能、顶体反应、雄配子和雌配子的结合、精子与卵细胞的融合过程有着直接的联系。有研究表明精子质膜是最易损伤的部位，其完整性是精子死活的间接指标。检测膜完整性较经典的方法是Osinowo等发明的低渗肿胀测试法（HOST）。操作要点[16]：将精液用低渗溶液稀释，37℃孵育后取混合均匀的样品涂到37℃预热的载玻片上，在400倍光学显微镜下观察。膜完整的精细胞通过低渗肿胀测试后尾卷曲，膜不完整的精子不出现这种现象[28]。
3.2 线粒体活性检测 线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，线粒体活性直接影响着精子的受精能力。精子线粒体活性可用罗丹明123（Rh123）染色的方法鉴定。罗丹明123是一种可以通过细胞膜、能染色活细胞线粒体的荧光染料，对细胞没有毒性，仅几分钟就可和具有活性的线粒体结合，呈黄绿色荧光[17]。操作要点[16]：将罗丹明123溶于HEPES/BSA溶液中，取精液样品加到罗丹明染液中，随后置于潮湿黑暗的地方37℃孵育30min后取样制片，400倍荧光显微镜观察。
3.3 顶体完整性检测 采用与异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素（FITC—PNA）检测顶体完整性[18]。操作要点[16]：取精子样品涂片，风干后用甲醇固定再风干。将玻片浸没在FITC—PNA溶液中。用PBS漂洗玻片，风干后涂一层防褪色溶液保护荧光，封片，荧光显微镜下观察，顶体完整的精子细胞发出强荧光。
3.4 DNA完整性检测 Evenson等科研工作者发明并改进了用染色质结构分析（SCSA）的方法来检测精子DNA完整性[19-20]。基本原理是：精子冷冻后受损伤的DNA会断裂为单链，吖啶橙（AO）可与双链DNA精子结合呈单体形式发出绿色荧光，而与单链DNA精子结合呈聚合物形式发出红色或黄色荧光。检测方法[16]：用TNE buffer稀释精液样品，低pH洗涤液洗30s，再用吖啶橙染色6min。蒸馏水漂洗后盖上盖玻片荧光显微镜下观察。DNA完整的精子细胞发出绿色荧光，DNA链断裂或单链DNA发出橘黄色、黄色、红色荧光。
DNA完整性检测还可以用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测。单细胞凝胶电泳技术由Ostling等首创，后经Singh等[21]进一步完善而逐渐发展起来，是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验（comet assay）。操作要点[22]：先用正常熔点琼脂糖制备第1层胶，再将稀释精液样品、低熔点琼脂糖涂于第1层胶上，然后分别用裂解液、RNase和蛋白酶K消化处理，电泳、染色，400倍荧光显微镜下观察。 DNA断裂的细胞会形成彗星样条带，DNA完整的精细胞则不会出现这种情况。Rahul等[23]用SCGE法分析冬季和夏季精子冷冻前与冷冻后DNA完整性，发现水牛精子冷冻后DNA损伤程度高（P<0.05）；同时发现夏季DNA损伤程度显著高于冬季（P<0.05）。Fraser等[40]用SCGE法检测猪精子DNA完整性，发现冷冻-解冻可引起精子DNA片段化程度增高（P<0.05），而与采精方法及使用的冻存液类型无关。 虽然驴精液冻存研究较少，相关检测方法在驴中也未见相关报道，但鉴于精子这5种冻后指标检测方法在人、牛、猪等物种中都有相关应用[15，22，24]，因此推测在驴精子冻存检测中也是适用的。
4 人工输精技术
与其他家畜相比，马和驴人工授精技术发展相对缓慢，主要原因一是缺乏繁殖记录，对驴排卵机制认知有限。驴发情周期大约20～40d，多数品种在23～30d，发情持续6～9d，其中发情5～6d后才排卵；二是对此的认同度不高[25]，马及驴的本交或人工授精在1个发情周期中大约要进行2～4次，显著不同于牛的人工输精；三是在马和驴人工输精过程中出现了其他物种不存在的技术障碍，如母驴的子宫颈通常比母马长，且子宫颈口直径较小[25]。但驴和马有一定的经济价值，且人工授精技术在大规模饲养条件下可较大程度上降低养殖成本、减少疫病传播、提高优良种质利用效率、选择最佳的配种时机等，因而有必要形成一套有效的人工辅助繁殖技术[25]。
马低剂量人工输精经常采用子宫颈深部授精的方式，即用导管将精液输送到与卵巢卵泡发育同侧的近输卵管乳突部，此方法在精子数量有限的条件下能有效提高受精率[27-28]。目前常用的有直肠引导深角授精技术（TRG）和宫腔镜深角授精技术（HYS）2种方式。宫腔镜深角授精使得授精位置准确，但宫腔镜设备昂贵[29]，且子宫内窥镜检测和相关的空气扩张子宫可能引起细菌滋生造成子宫内膜炎[30]，也会降低受孕率。采用一次性授精管通过直肠引导的方式将精液输送到近输卵管乳突部的方法可替代宫腔镜授精方法[31]。
19卷03期张瑞涛等 驴精液采集与冷冻相关技术研究TRG操作要点[16，19]：吸取精液，手拿导管经产道穿过子宫颈，然后将手臂撤出产道插入直肠，经直肠引导输精管到达与卵泡发育的卵巢同侧的子宫角顶部。通过触诊的方式确认输精管末端到达子宫角顶端，推动注射器慢慢将精液缓缓注入子宫腔内。拔下注射器吸取3mL空气接到输精管上缓缓压到输精管中，确保精液完全排出输精管。输精结束3min后再让驴走动。HYS操作要点[29]：与直肠引导输精技术相似，手拿可弯曲的内窥镜进入产道穿过子宫颈。撤出手臂插入到直肠中，通过直肠引导内窥镜到与卵泡发育的卵巢同侧的子宫角中。向子宫角末端充气，使内窥镜前行，直至看到输卵管乳头。内部输精管前行到接近输卵管乳头，此时将精液全部排到乳头内。将输精管撤出，将内窥镜撤到子宫角底排除子宫内的空气，最后将内窥镜撤出。
对比2种授精方式，Lindsey等[33]认为HYS（5/10，50%）比TRG（0/10，0%）受孕率高，但Brinsko等[32]认为HYS（12/18，66%）和TRG（10/18，56%）2种授精方式受孕率差异不显著，后来Lindsey等[34]研究发现HYS（12/22，）和TRG（9/24）2种授精方式对受孕率影响不显著。Hayden 等[29]进一步研究发现：输精量足够时2种授精方式对受孕率影响不大，但当输精量在25×106～50×106时明显影响受孕率，因而建议用冻存精液或性控筛选精液配种时需采用深角输精法。
参考文献
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