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摘 要：利用富集培养法，从北方寒区施用阿特拉津的玉米地土壤中，分离出1株阿特拉津高效降解菌GH1，结合其形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，将菌株GH1初步鉴定为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）。菌株GH1在36h内能完全降解100mg/L的阿特拉津，这为北方寒区特定环境中阿特拉津的修复提供了良好的菌株资源。
关键词：阿特拉津;生物降解;16S rRNA;产脲节杆菌
中图分类号 X592 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）19-0018-03
Isolation and Identification of Atrazine Degrading Bacteria from Northern Cold Region
YANG Haoyun et al.
（College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）
Abstract： An atrazine degrading strain GH1 was isolated from the soil of maize field applied with atrazine by enrichment culture method in the cold region of northern China. Combined with its morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strain GH1 was identified as Paenarthrobacter ureafaciens. The strain GH1 can completely degrade 100mg/L atrazine within 36h， which provides a good strain resource for atrazine remediation in the unique environment of northern cold region.
Key words： Atrazine; Biodegradation; 16S rRNA; Paenarthrobacter ureafaciens
杂草严重制约着农业生产。随着农药的发展，除草剂逐渐成为杂草防除的重要措施。黑龙江是我国农业大省，人均耕地面积0.31hm2，是全国的3倍。在地多人少的特定条件下，除草剂的用量非常大，占农药用量的85%以上，居全国第1位。阿特拉津（Atrazine）又名莠去津，是一种三氮苯类除草剂，广泛用于玉米、高粱田等的一年生阔叶杂草的防除。由于其杂草防除效果较好，价格相对便宜，投入产出比较高，在东北寒区的禾本科作物田除草剂中占据非常重要的地位。但随着阿特拉津的连年、超量使用，对人类的生存健康、后茬作物的安全、黑土资源及生态环境构成了严重威胁，并且在部分地区已经影响到大豆玉米轮作制度的正常开展[1]。
目前，关于阿特拉津的降解，科研人员开展了大量研究，包括物理、化学及生物方法等，其中生物修复由于其对环境友好、无二次污染等优点，具有很强的优越性。目前，已有大量的阿特拉津降解菌被分离出来，如假单胞菌、土壤杆菌、肠杆菌、诺卡氏菌、根瘤菌、红球菌、节杆菌等[2-6]，但适合北方寒区的降解菌株资源还十分有限。本研究从从北方寒区长期施用阿特拉津的玉米田中采集土壤样品，进行降解菌分离鉴定以及降解率的测定，以期获得适应当地特殊环境的降解菌株，为阿特拉津污染环境的修复提供备选资源菌株。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 培养基 无机盐基础培养基：KH2PO4 0.9g、Na2HPO4·12H2O 6.5g、葡萄糖3g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.4g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0，115℃条件下灭菌20min。LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌20min。
1.1.2 土壤样品 土样采集自大兴安岭某农场长期施用阿特拉津的玉米田中。
1.1.3 仪器 高压蒸汽灭菌器、洁净工作台、立式智能精密摇床、生化培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等。
1.2 试验方法
1.2.1 降解菌的富集与分离 在洁净工作台中将10g土样加入到含有50mg/L阿特拉津的100mL无机盐基础培养基中，30℃、150r/min富集培养7d，然后取10mL富集培养液接种到100mL新鲜的无机盐基础培养基中，在其他条件不变的情况下，逐渐增加无机盐培养基中阿特拉津浓度，分别为100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L，30℃、150r/min富集培养7d。富集结束后，将富集培养液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，从中各取0.1mL富集培养液分别涂布于含有100mg/L的阿特拉津的LB固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养。培养结束后，挑取LB固体平板上产生明显水解圈的单菌落，并在LB平板上连续划线纯化培养，直到获得纯化菌株。
1.2.2 阿特拉津的提取及降解率测定 接种OD600=0.5的降解菌悬液1mL于含100mg/L阿特拉津的100mL无机盐基础培养基中，30℃、150r/min振荡培养。培养结束后，取5mL培養液与三氯甲烷（色谱纯）按照1∶2的比例混合，分离下层有机相，使用旋转蒸发仪将有机相浓缩并蒸发至干。最后用甲醇（色谱纯）溶液调节定容至1mL，用0.22μm的有机相尼龙膜进行过滤至进样瓶，采用高效液相色谱仪检测阿特拉津浓度并计算降解率。高效液相色谱仪参数设置为：采用反相C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相甲醇水溶液，体积比为70∶30，流速为0.8mL/min，可变波长紫外检测器检测波长为225nm，柱温为40℃，进样量为10μL。 1.2.3 高效降解菌株的鉴定 根据常见细菌系统鉴定手册对菌株的形态和生理生化特征进行鉴定[7]。降解菌的16S rRNA 基因克隆及序列分析：按照北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行阿特拉津降解菌基因组DNA的提取;PCR引物为16S rRNA通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。PCR反应体系为：Taq DNA Polymerase mix 25μL，降解菌基因组DNA 1μL，引物各1μL，补去离子水至50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，最终72℃延伸10min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小，并用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒纯化PCR产物，纯化后的PCR产物由吉林库美生物有限公司进行测序。通过RDP Release 11将菌株16S rRNA基因序列与数据库中的已知序列进行比对，得出相似性，使用MEGA 7.0软件中的Neighbor-Joining法对菌株的16S rRNA基因序列进行聚类分析，并构建系统进化树，用Bootstrap值进行检验，并重复1000次[8]。
2 结果与分析
2.1 阿特拉津降解菌的分离鉴定 经富集培养，成功筛选到1株高效阿特拉津降解菌，命名为GH1。菌株GH1在LB平板上，菌落边缘整齐，不透明，粘稠，金黄色，G+。生理生化试验结果显示氧化酶、淀粉水解、吲哚、硫化氢、甲基红、V-P、硝酸盐还原试验均为阴性，接触酶阳性。PCR扩增16S rRNA序列長度为1502bp（GenBank登录号为MZ208834），在RDP Release 11上作序列比对分析，GH1的16S rRNA序列与Paenarthrobacter ureafaciens模式菌株DSM 20126（GenBank登录号X80744）的16S rRNA基因序列相似性达100%，通过MEGA 7.0构建出菌株GH1的系统发育树如图1所示。结合其在LB培养基上的形态特征及生理生化试验结果，将菌株GH1归属于为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）。
系统发育树
2.2 对阿特拉津的降解能力 将降解菌GH1接种到含100mg/L阿特拉津的无机盐基础培养中，36h后提取发酵液中的阿特拉津，通过高效液相色谱仪测定菌株GH1降解阿特拉津的能力，分析图谱如图2所示。其中图2A为50mg/L阿特拉津标准溶液的图谱，图2B为菌株GH1降解阿特拉津36h的分析图谱。由图2可知，在该仪器参数设置下，阿特拉津的保留时间为7.095min，降解菌GH1在36h内将100mg/L的阿特拉津完全降解，说明降解菌GH1有较高的阿特拉津降解能力。
3 结论
试验结果表明：采用富集培养法，从北方寒区土壤中筛选出1株高效阿特拉津降解菌GH1，在36h内将100mg/L的阿特拉津完全降解;经菌株形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析，初步鉴定降解菌GH1为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens），这将为北方寒区环境中阿特拉津污染的修复提供良好的资源菌株。
参考文献
[1]杨晓燕，李艳苓，魏环宇，等.阿特拉津降解菌CS3的分离鉴定及其降解特性的研究[J].农业环境科学学报，2018（6）：1149-1158.
[2]李文帅，段玉春，范文艳，等.阿特拉津降解菌MSD6鉴定及其降解特性研究[J].安徽农学通报，2018，024（020）：45-48，72.
[3]李红梅，张新建，李纪顺，等.阿特拉津降解菌SD41的分离鉴定及土壤修复[J].环境科学与技术，2014，037（004）：38-41，129.
[4]吕惠萍.莠去津高效降解菌的分离与鉴定[J].化工技术与开发，2017，46（002）：22-24.
[5]李红梅，李成云，李纪顺，等.产脲节杆菌DnL1-1与植物联合对阿特拉津的降解[J].科学技术与工程，2017，17（017）：357-360.
[6]胡江，代先祝，李顺鹏.两株降解菌对阿特拉津污染土壤的修复效果研究[J].土壤学报，2005，42（002）：323-327.
[7]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[8]赵昕悦，马放，杨基先，等.阿特拉津降解菌Pseudomonas sp. ZXY-1的分离鉴定及降解动力学[J].哈尔滨工业大学学报， 2018，50（02）：82-88. （责编：徐世红）
关键词：阿特拉津;生物降解;16S rRNA;产脲节杆菌
中图分类号 X592 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）19-0018-03
Isolation and Identification of Atrazine Degrading Bacteria from Northern Cold Region
YANG Haoyun et al.
（College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）
Abstract： An atrazine degrading strain GH1 was isolated from the soil of maize field applied with atrazine by enrichment culture method in the cold region of northern China. Combined with its morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strain GH1 was identified as Paenarthrobacter ureafaciens. The strain GH1 can completely degrade 100mg/L atrazine within 36h， which provides a good strain resource for atrazine remediation in the unique environment of northern cold region.
Key words： Atrazine; Biodegradation; 16S rRNA; Paenarthrobacter ureafaciens
杂草严重制约着农业生产。随着农药的发展，除草剂逐渐成为杂草防除的重要措施。黑龙江是我国农业大省，人均耕地面积0.31hm2，是全国的3倍。在地多人少的特定条件下，除草剂的用量非常大，占农药用量的85%以上，居全国第1位。阿特拉津（Atrazine）又名莠去津，是一种三氮苯类除草剂，广泛用于玉米、高粱田等的一年生阔叶杂草的防除。由于其杂草防除效果较好，价格相对便宜，投入产出比较高，在东北寒区的禾本科作物田除草剂中占据非常重要的地位。但随着阿特拉津的连年、超量使用，对人类的生存健康、后茬作物的安全、黑土资源及生态环境构成了严重威胁，并且在部分地区已经影响到大豆玉米轮作制度的正常开展[1]。
目前，关于阿特拉津的降解，科研人员开展了大量研究，包括物理、化学及生物方法等，其中生物修复由于其对环境友好、无二次污染等优点，具有很强的优越性。目前，已有大量的阿特拉津降解菌被分离出来，如假单胞菌、土壤杆菌、肠杆菌、诺卡氏菌、根瘤菌、红球菌、节杆菌等[2-6]，但适合北方寒区的降解菌株资源还十分有限。本研究从从北方寒区长期施用阿特拉津的玉米田中采集土壤样品，进行降解菌分离鉴定以及降解率的测定，以期获得适应当地特殊环境的降解菌株，为阿特拉津污染环境的修复提供备选资源菌株。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 培养基 无机盐基础培养基：KH2PO4 0.9g、Na2HPO4·12H2O 6.5g、葡萄糖3g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.4g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0，115℃条件下灭菌20min。LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，121℃条件下灭菌20min。
1.1.2 土壤样品 土样采集自大兴安岭某农场长期施用阿特拉津的玉米田中。
1.1.3 仪器 高压蒸汽灭菌器、洁净工作台、立式智能精密摇床、生化培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等。
1.2 试验方法
1.2.1 降解菌的富集与分离 在洁净工作台中将10g土样加入到含有50mg/L阿特拉津的100mL无机盐基础培养基中，30℃、150r/min富集培养7d，然后取10mL富集培养液接种到100mL新鲜的无机盐基础培养基中，在其他条件不变的情况下，逐渐增加无机盐培养基中阿特拉津浓度，分别为100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L，30℃、150r/min富集培养7d。富集结束后，将富集培养液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，从中各取0.1mL富集培养液分别涂布于含有100mg/L的阿特拉津的LB固体平板上，置于30℃恒温培养箱中培养。培养结束后，挑取LB固体平板上产生明显水解圈的单菌落，并在LB平板上连续划线纯化培养，直到获得纯化菌株。
1.2.2 阿特拉津的提取及降解率测定 接种OD600=0.5的降解菌悬液1mL于含100mg/L阿特拉津的100mL无机盐基础培养基中，30℃、150r/min振荡培养。培养结束后，取5mL培養液与三氯甲烷（色谱纯）按照1∶2的比例混合，分离下层有机相，使用旋转蒸发仪将有机相浓缩并蒸发至干。最后用甲醇（色谱纯）溶液调节定容至1mL，用0.22μm的有机相尼龙膜进行过滤至进样瓶，采用高效液相色谱仪检测阿特拉津浓度并计算降解率。高效液相色谱仪参数设置为：采用反相C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相甲醇水溶液，体积比为70∶30，流速为0.8mL/min，可变波长紫外检测器检测波长为225nm，柱温为40℃，进样量为10μL。 1.2.3 高效降解菌株的鉴定 根据常见细菌系统鉴定手册对菌株的形态和生理生化特征进行鉴定[7]。降解菌的16S rRNA 基因克隆及序列分析：按照北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行阿特拉津降解菌基因组DNA的提取;PCR引物为16S rRNA通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。PCR反应体系为：Taq DNA Polymerase mix 25μL，降解菌基因组DNA 1μL，引物各1μL，补去离子水至50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，最终72℃延伸10min。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小，并用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒纯化PCR产物，纯化后的PCR产物由吉林库美生物有限公司进行测序。通过RDP Release 11将菌株16S rRNA基因序列与数据库中的已知序列进行比对，得出相似性，使用MEGA 7.0软件中的Neighbor-Joining法对菌株的16S rRNA基因序列进行聚类分析，并构建系统进化树，用Bootstrap值进行检验，并重复1000次[8]。
2 结果与分析
2.1 阿特拉津降解菌的分离鉴定 经富集培养，成功筛选到1株高效阿特拉津降解菌，命名为GH1。菌株GH1在LB平板上，菌落边缘整齐，不透明，粘稠，金黄色，G+。生理生化试验结果显示氧化酶、淀粉水解、吲哚、硫化氢、甲基红、V-P、硝酸盐还原试验均为阴性，接触酶阳性。PCR扩增16S rRNA序列長度为1502bp（GenBank登录号为MZ208834），在RDP Release 11上作序列比对分析，GH1的16S rRNA序列与Paenarthrobacter ureafaciens模式菌株DSM 20126（GenBank登录号X80744）的16S rRNA基因序列相似性达100%，通过MEGA 7.0构建出菌株GH1的系统发育树如图1所示。结合其在LB培养基上的形态特征及生理生化试验结果，将菌株GH1归属于为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）。
系统发育树
2.2 对阿特拉津的降解能力 将降解菌GH1接种到含100mg/L阿特拉津的无机盐基础培养中，36h后提取发酵液中的阿特拉津，通过高效液相色谱仪测定菌株GH1降解阿特拉津的能力，分析图谱如图2所示。其中图2A为50mg/L阿特拉津标准溶液的图谱，图2B为菌株GH1降解阿特拉津36h的分析图谱。由图2可知，在该仪器参数设置下，阿特拉津的保留时间为7.095min，降解菌GH1在36h内将100mg/L的阿特拉津完全降解，说明降解菌GH1有较高的阿特拉津降解能力。
3 结论
试验结果表明：采用富集培养法，从北方寒区土壤中筛选出1株高效阿特拉津降解菌GH1，在36h内将100mg/L的阿特拉津完全降解;经菌株形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析，初步鉴定降解菌GH1为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens），这将为北方寒区环境中阿特拉津污染的修复提供良好的资源菌株。
参考文献
[1]杨晓燕，李艳苓，魏环宇，等.阿特拉津降解菌CS3的分离鉴定及其降解特性的研究[J].农业环境科学学报，2018（6）：1149-1158.
[2]李文帅，段玉春，范文艳，等.阿特拉津降解菌MSD6鉴定及其降解特性研究[J].安徽农学通报，2018，024（020）：45-48，72.
[3]李红梅，张新建，李纪顺，等.阿特拉津降解菌SD41的分离鉴定及土壤修复[J].环境科学与技术，2014，037（004）：38-41，129.
[4]吕惠萍.莠去津高效降解菌的分离与鉴定[J].化工技术与开发，2017，46（002）：22-24.
[5]李红梅，李成云，李纪顺，等.产脲节杆菌DnL1-1与植物联合对阿特拉津的降解[J].科学技术与工程，2017，17（017）：357-360.
[6]胡江，代先祝，李顺鹏.两株降解菌对阿特拉津污染土壤的修复效果研究[J].土壤学报，2005，42（002）：323-327.
[7]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[8]赵昕悦，马放，杨基先，等.阿特拉津降解菌Pseudomonas sp. ZXY-1的分离鉴定及降解动力学[J].哈尔滨工业大学学报， 2018，50（02）：82-88. （责编：徐世红）