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摘要：建立了苹果和土壤中超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测乙嘧酚残留方法，考察了基质效应，并对实际样品进行了检测。苹果和土壤经乙腈振荡提取后，用MCX柱净化，采用UPLC-MS/MS正离子扫描分析乙嘧酚。以苹果和土壤为基质进行3档添加水平和5 次重复性试验，结果表明添加浓度为001、005、01 mg/kg的平均回收率为88%～102%，相对标准偏差为21%～87%。本方法在苹果和土壤中的检出限为2 μg/kg，定量限为4 μg/kg，在10～300 μg/L范围内线性关系好（r>0999）。
关键词：乙嘧酚；超高效液相色谱-串联质谱；残留；苹果；土壤
中图分类号：O657.63文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0101-05
目前国内有关乙嘧酚残留的分析研究较少，多集中于其在黄瓜中的残留分析，已知其在黄瓜中的最大残留限量值是1 mol/L[6]，尚未制定出苹果中乙嘧酚的残留限量标准。刘康云等（2008）[7]采用高效液相色谱-紫外检测法分析了乙嘧酚在黄瓜中的残留量。王蒙岑等（2009）[8]利用高效液相色谱-二极管阵列检测器建立了乙嘧酚在黄瓜和土壤中的残留检测方法，参照国家标准GB/T 20769检测乙嘧酚，回收率低，且难以达到较低的限量要求。采用超高效液相色谱-串联质谱法可以提高目标物质的灵敏度和回收率，缩短进样时间，提高检测效率。张文童等（2012）[9]研究用高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜、草莓中乙嘧酚。Pizzutti等（2009）[10]报道了液相色谱-串联质谱分析葡萄等 6 种农作物中包括乙嘧酚的171 种农药残留。
本研究采用Waters的MCX离子柱进行前处理，大大纯化了样品，通过优化液相色谱条件，采用超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC -MS/MS），建立了乙嘧酚的快速、准确的检测方法。
1材料与方法
2结果与讨论21前处理条件优化
为方便快捷提取分离乙嘧酚，取分别添加了01、05、10 mg/kg乙嘧酚的空白苹果样品，用乙腈进行粗提取后，用旋转蒸发仪蒸发近干，加入2 ml甲醇定容，022 μm滤膜过滤，上液相色谱紫外光谱测定，发现这种方法基本上可以将乙嘧酚和杂质峰分开，但是杂质含量非常高，而且乙嘧酚峰会发生漂移，最大可漂移2 min左右。为解决这个问题，对粗提取液进行净化处理。
考察Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱及调节乙腈提取液酸碱度的方法。取3份添加了05 mg/kg乙嘧酚的空白苹果样品，用乙腈进行粗提取后，前2份粗提取液用旋转蒸发仪蒸发近干，之后分别过Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱；另外一份加入10 ml乙腈，先用稀盐酸调节pH值为4～5，萃取分层取水层，再用弱碱调节pH值为9～10，用乙腈萃取，旋转蒸干，用2 ml甲醇定容，022 μm滤膜过滤，上机，结果发现，用Waters Sep-pak C18固相萃取小柱进行前处理的样品回收率只有186%，调节乙腈提取液酸碱度的方法回收率可以达到786%，而Waters Oasis MCX固相萃取小柱的回收率能达到958%。很显然用Waters Oasis MCX固相萃取小柱前处理的方法提取分离的效果最好。
乙嘧酚的结构含有碱性基团氨基，而羟基在这个结构中不具有酸性，所以该化合物为碱性化合物，而且化合物中含有极性基团羟基及氨基使其极性较大，Waters Sep-pak C18固相萃取小柱不足以使乙嘧酚吸附在小柱上；试验也证明，提取液通过小柱时，收集提取液，过膜上机检测，发现含有大量的乙嘧酚。
调节乙腈提取液酸碱度的方法和Waters Oasis MCX固相萃取小柱都能纯化分离乙嘧酚，但是调节pH值的方法繁琐，工作量大，效率低；Waters Oasis MCX固相萃取小柱和调节pH值的方法原理相同，但是Waters Oasis MCX固相萃取小柱更方便、更快捷，回收率好，且乙嘧酚峰不会发生漂移，所以选择Waters Oasis MCX固相萃取小柱分离纯化前处理。
22色谱条件优化
乙嘧酚的测定方法通常是以高效液相色谱为基础的紫外法。紫外法干扰峰很多，尤其对于基质复杂的样品，很难满足较为严格的限量要求。液相色谱-质谱联用方法测定乙嘧酚残留具有高灵敏度、高选择性的优势。
乙嘧酚在C18柱上保留性差，流动相中的极性溶剂含量比较高。比较了甲醇体系和乙腈体系，发现甲醇体系下乙嘧酚是乙腈体系下的10倍。通过试验确定流动相为甲醇和01%甲酸溶液，采用梯度洗脱程序，既能保证乙嘧酚的灵敏度，又能保证其较好的峰型。
23质谱条件优化
选择乙嘧酚的加合离子峰为母离子，主要有[M+H]+，在流动相存在的条件下进行质谱条件的优化。当流动相为01%甲酸和乙腈时，[M+H]+灵敏度低；当流动相为01%甲酸和甲醇时，[M+H]+灵敏度高。同时对质谱的毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度、脱溶剂气和锥孔气流量进行了优化，最终确定了质谱条件。再对母离子进行子离子扫描，从而确定子离子及碰撞能量。
乙嘧酚含有氨基集团，具有碱性，易结合氢根变成氨基正离子，因此这种化合物可采用ESI+模式扫描测定。通过母离子扫描（MS Scan），可获得一级质谱图，见图1，两种化合物的软电离均以准分子离子峰[M+H]形式存在。
关键词：乙嘧酚；超高效液相色谱-串联质谱；残留；苹果；土壤
中图分类号：O657.63文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0101-05
目前国内有关乙嘧酚残留的分析研究较少，多集中于其在黄瓜中的残留分析，已知其在黄瓜中的最大残留限量值是1 mol/L[6]，尚未制定出苹果中乙嘧酚的残留限量标准。刘康云等（2008）[7]采用高效液相色谱-紫外检测法分析了乙嘧酚在黄瓜中的残留量。王蒙岑等（2009）[8]利用高效液相色谱-二极管阵列检测器建立了乙嘧酚在黄瓜和土壤中的残留检测方法，参照国家标准GB/T 20769检测乙嘧酚，回收率低，且难以达到较低的限量要求。采用超高效液相色谱-串联质谱法可以提高目标物质的灵敏度和回收率，缩短进样时间，提高检测效率。张文童等（2012）[9]研究用高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜、草莓中乙嘧酚。Pizzutti等（2009）[10]报道了液相色谱-串联质谱分析葡萄等 6 种农作物中包括乙嘧酚的171 种农药残留。
本研究采用Waters的MCX离子柱进行前处理，大大纯化了样品，通过优化液相色谱条件，采用超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC -MS/MS），建立了乙嘧酚的快速、准确的检测方法。
1材料与方法
2结果与讨论21前处理条件优化
为方便快捷提取分离乙嘧酚，取分别添加了01、05、10 mg/kg乙嘧酚的空白苹果样品，用乙腈进行粗提取后，用旋转蒸发仪蒸发近干，加入2 ml甲醇定容，022 μm滤膜过滤，上液相色谱紫外光谱测定，发现这种方法基本上可以将乙嘧酚和杂质峰分开，但是杂质含量非常高，而且乙嘧酚峰会发生漂移，最大可漂移2 min左右。为解决这个问题，对粗提取液进行净化处理。
考察Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱及调节乙腈提取液酸碱度的方法。取3份添加了05 mg/kg乙嘧酚的空白苹果样品，用乙腈进行粗提取后，前2份粗提取液用旋转蒸发仪蒸发近干，之后分别过Waters Sep-pak C18固相萃取小柱、Waters Oasis MCX固相萃取小柱；另外一份加入10 ml乙腈，先用稀盐酸调节pH值为4～5，萃取分层取水层，再用弱碱调节pH值为9～10，用乙腈萃取，旋转蒸干，用2 ml甲醇定容，022 μm滤膜过滤，上机，结果发现，用Waters Sep-pak C18固相萃取小柱进行前处理的样品回收率只有186%，调节乙腈提取液酸碱度的方法回收率可以达到786%，而Waters Oasis MCX固相萃取小柱的回收率能达到958%。很显然用Waters Oasis MCX固相萃取小柱前处理的方法提取分离的效果最好。
乙嘧酚的结构含有碱性基团氨基，而羟基在这个结构中不具有酸性，所以该化合物为碱性化合物，而且化合物中含有极性基团羟基及氨基使其极性较大，Waters Sep-pak C18固相萃取小柱不足以使乙嘧酚吸附在小柱上；试验也证明，提取液通过小柱时，收集提取液，过膜上机检测，发现含有大量的乙嘧酚。
调节乙腈提取液酸碱度的方法和Waters Oasis MCX固相萃取小柱都能纯化分离乙嘧酚，但是调节pH值的方法繁琐，工作量大，效率低；Waters Oasis MCX固相萃取小柱和调节pH值的方法原理相同，但是Waters Oasis MCX固相萃取小柱更方便、更快捷，回收率好，且乙嘧酚峰不会发生漂移，所以选择Waters Oasis MCX固相萃取小柱分离纯化前处理。
22色谱条件优化
乙嘧酚的测定方法通常是以高效液相色谱为基础的紫外法。紫外法干扰峰很多，尤其对于基质复杂的样品，很难满足较为严格的限量要求。液相色谱-质谱联用方法测定乙嘧酚残留具有高灵敏度、高选择性的优势。
乙嘧酚在C18柱上保留性差，流动相中的极性溶剂含量比较高。比较了甲醇体系和乙腈体系，发现甲醇体系下乙嘧酚是乙腈体系下的10倍。通过试验确定流动相为甲醇和01%甲酸溶液，采用梯度洗脱程序，既能保证乙嘧酚的灵敏度，又能保证其较好的峰型。
23质谱条件优化
选择乙嘧酚的加合离子峰为母离子，主要有[M+H]+，在流动相存在的条件下进行质谱条件的优化。当流动相为01%甲酸和乙腈时，[M+H]+灵敏度低；当流动相为01%甲酸和甲醇时，[M+H]+灵敏度高。同时对质谱的毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度、脱溶剂气和锥孔气流量进行了优化，最终确定了质谱条件。再对母离子进行子离子扫描，从而确定子离子及碰撞能量。
乙嘧酚含有氨基集团，具有碱性，易结合氢根变成氨基正离子，因此这种化合物可采用ESI+模式扫描测定。通过母离子扫描（MS Scan），可获得一级质谱图，见图1，两种化合物的软电离均以准分子离子峰[M+H]形式存在。