【摘 要】
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目的 探究火把花根(CRT)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ACEⅡ)损伤的保护作用及对细胞间紧密连接蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠ACEⅡ.将细胞分为6组:对照组(完全培养基)、TNF-α组(TNF-α10μg/L)、地塞米松组(Dex组,Dex 1×10-6 mol/L+TNF-α10μg/L)、CRT高剂量组(CRT 1000 mg/L+TNF-α10μg/L)、CRT中剂量组(CRT 500 mg/L+TNF-α10μg/L)、CRT低剂量组(CRT 250 mg/L+T
【机 构】
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宁夏医科大学总医院重症医学科,银川 750004;沧州市人民医院呼吸内科,沧州 061000;宁夏医科大学总医院重症医学科,银川 750004;河北大学附属医院重症医学科,保定 071000
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目的 探究火把花根(CRT)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ACEⅡ)损伤的保护作用及对细胞间紧密连接蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠ACEⅡ.将细胞分为6组:对照组(完全培养基)、TNF-α组(TNF-α10μg/L)、地塞米松组(Dex组,Dex 1×10-6 mol/L+TNF-α10μg/L)、CRT高剂量组(CRT 1000 mg/L+TNF-α10μg/L)、CRT中剂量组(CRT 500 mg/L+TNF-α10μg/L)、CRT低剂量组(CRT 250 mg/L+TNF-α10μg/L).处理细胞48 h后,透射电镜观察细胞超微结构的改变,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞的增殖变化,流式双染法测定细胞凋亡,免疫荧光法测定细胞封闭蛋白4(Claudin-4)、带状闭锁蛋白-1(ZO-1)的定位分布及荧光强度改变,荧光定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法测定Claudin-4、ZO-1基因和蛋白表达水平的变化.结果 透射电镜下可见TNF-α组细胞明显损伤,细胞器结构损伤严重;CRT各剂量组及Dex组细胞损伤明显减轻.与对照组比较,TNF-α组细胞的增殖明显受到抑制(45.96％±1.40％比5.17％±0.57％,P<0.05),凋亡率增加(19.60％±3.75％比2.87％±0.40％,P<0.05).CRT各剂量组及Dex组细胞的增殖抑制率及凋亡率低于TNF-α组(抑制率:33.08％±2.11％、28.23％±2.31％、33.76％±0.81％、38.09％±1.65％比45.96％±1.40％;凋亡率:15.17％±1.80％、8.23％±2.24％、12.67％±1.99％、12.33％±2.64％比19.60％±3.75％,均P<0.05).共聚焦显微镜下可见TNF-α组细胞Claudin-4荧光密度降低,ZO-1线性荧光断裂、消失;CRT各剂量组及Dex组Claudin-4的荧光密度接近对照组,ZO-1荧光结构恢复网格状排列.TNF-α组细胞的Claudin-4、ZO-1的基因和蛋白表达水平均明显低于对照组〔Claudin-4 mRNA(2-ΔΔCt):0.026±0.006比1.000±0.000,Claudin-4蛋白(Claudin-4/β-actin):0.447±0.127比0.757±0.131;ZO-1 mRNA(2-ΔΔCt):0.183±0.090比1.000±0.000,ZO-1蛋白(ZO-1/β-actin):0.423±0.040比0.697±0.127,均P<0.05〕;CRT各剂量组及Dex组Claudin-4、ZO-1的基因和蛋白表达明显高于TNF-α组〔Claudin-4 mRNA(2-ΔΔCt):0.059±0.009、0.080±0.006、0.059±0.010、0.061±0.011比0.026±0.006,Claudin-4蛋白(Claudin-4/β-actin):0.780±0.046、1.327±0.055、0.710±0.053、0.670±0.087比0.447±0.127,ZO-1 mRNA(2-ΔΔCt):1.125±0.103、0.856±0.058、0.793±0.147、4.059±0.520比0.183±0.090,ZO-1蛋白(ZO-1/β-actin):0.637±0.068、0.663±0.057、0.617±0.050、0.813±0.090比0.423±0.040,均P<0.05〕.结论 CRT保护TNF-α诱导的肺上皮屏障损伤,通过抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,减弱细胞增殖抑制作用,修复细胞结构,保护ACEⅡ,并通过上调Claudin-4、ZO-1的表达,恢复紧密连接蛋白的定位,修复并加固紧密连接,降低细胞旁通透性.
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