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[摘 要]建立了高效液相色谱(HPLC)快速定量测定抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076和抗氧化剂168的分析方法。以甲醇/水为流动相,定量检测波长210nm。4种抗氧化剂在0.2~8 ug/mL范围内具有较好的线性关系,相关系数r均为0.999,定量下限(LOQ,S/N=10)抗氧化剂1010、330、1076为0.8 ng,抗氧化剂168为2.0 ng,样品的加标回收率为92.1%~102.8%,相对标准偏差均低于2.9%。将该方法应用于塑料输液容器用聚丙烯组合盖中抗氧化剂的检测,准确快速、灵敏度高,操作简便,稳定性好,可用于材料中抗氧化剂的质量控制。
[关键词]药品包装材料;聚丙烯组合盖;抗氧化剂;高效液相色谱
中图分类号:TQ325.14 文献标识码:A 文章编号:1009-914X(2014)48-0082-02
抗氧化剂作为包装材料的主要添加剂之一,广泛使用于塑料、纸制品、橡胶等行业,用以延缓材料的氧化和降解,提高材料的化学稳定性,延长材料使用寿命[1]。其与所包装药品或食品接触过程中,会通过吸收、溶解、渗透、扩散等过程透过包装材料迁移入药品或食品中[2],对人的心、肺、肾、脾等器官造成很大危害[3-4],易导致突变和致癌[5]。欧洲药典[6]明确对聚丙烯材料中的抗氧化剂含量作出严格规定。但其所选用的HPLC检测方法中,以乙腈和四氢呋喃等作为溶剂和流动相,有较大的毒性与腐蚀性,并且抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃混合溶液中极易分解,不能稳定存在,这给准确定量检测带来极大的困难。本文选择甲醇为溶剂,实验表明抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076、抗氧化剂168在甲醇中均有较好的稳定性,超过48 h无分解,解决了抗氧化剂168难以准确定量的难题。同时以甲醇/水为流动相,极大降低了流动相的毒性与腐蚀性,减少环境污染。该方法经过方法学验证,具有较好的线性关系,稳定性和重复性,灵敏度高,回收率好,并且操作简单,对环境污染小,相比于欧洲药典中抗氧化剂的检测方法,有较大改进。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪(Agilent 1260);电子天平(METTLER TOLEDO XP105);Millipore纯水系统(Milli-Q Academic)
抗氧化剂1076对照品(CAS号 2082-79-3,99%);抗氧化剂1010对照品(CAS号6683-19-8,99%);抗氧化剂330对照品(CAS号1709-70-2,98%);抗氧化剂168对照品(CAS号31570-04-4,98%)均购自Sigma-Aldrich。
样品:聚丙烯组合盖由生产企业A和B提供,聚丙烯粒料由C企业提供。
甲醇,甲苯(HPLC级,Merck);实验用水为超纯水(电阻率为18.2MΩcm)
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm*4.6 mm, 3.5 μm-Micron,Agilent)。流速:1.5 mL/min;柱温:40℃;检测波长:210 nm;进样体积:20μL。流动相A为超纯水,流动相B为甲醇,梯度洗脱程序见表1。
2.2 对照品溶液的制备
对照储备液:将抗氧化剂1010、330、1076、168对照品20 mg溶于甲醇溶液中,稀释定容至250 mL,置于棕色瓶中,作为对照储备液,4℃冰箱中保存备用。
对照品溶液:精密量取对照储备液 5mL用甲醇稀释至100 mL作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
将样品剪切成边长1 cm的碎片(粒料直接取样),分别精密称定4.0 g,放置于烧瓶中,加入甲苯80 mL,持续搅拌,加热回流1.5 h,冷却至60℃,在搅拌下加入甲醇120 mL,用4号砂芯漏斗过滤。用甲苯与甲醇的混合液(4:6)混合液25 mL清洗烧瓶和滤渣,将清洗液与滤液合并,并用甲醇稀释至250 mL,摇匀,用0.45μm滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系
将“2.3 ”项下对照品溶液,在“2.1”色谱条件下,用甲醇分别稀释至0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0ug/mL,每次进样20 uL。结果显示:在0.2~8.0ug/mL浓度范围内,抗氧化剂1010、330、1076、168均有良好的線性关系。
2.5 精密度试验
取2.0 ug/mL混合对照品溶液,连续进样6次,测定其峰面积,结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.9%、1.5%、1.1%、2.5%。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液(批号A(1304002)),分别在1,4,8,12,24,48h进样,测定其峰面积。结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%、2.2%,表明溶液在48小时内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一份聚丙烯组合盖样品(批号A(1304002))5份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按照上述色谱条件,测定峰面积。结果样品中氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.8%、1.0%、1.5%、2.7%。
2.8 回收率试验
取已知含量的聚丙烯材料样品(批号A(1304002))精密称定4 .0g,分别吸取对照储备液5.0 mL加入到样品中,按“2.3”项下方法制备供试溶液,结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的平均回收率(n=9)分别为102.8%,95.5%,98.4%,92.1%,RSD分别为1.0%,1.8%,1.5%,3.0%。 2.9 最低检出限与最低定量限
取“2.2”项下混合对照品溶液用甲醇稀释测定,当信噪比S/N为3:1时,抗氧化剂1010、330、1076、168的最低检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.8 ng,当信噪比S/N为10:1时,最低定量限分别为0.8、0.8、0.8、2.0 ng。
2.10 样品测定
取聚丙烯组合盖9批及聚丙烯粒料,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,测定。按标准曲线法以峰面积计算含量。测定结果见表2.
3.讨论
3.1 检测波长的确定
使用高效液相色谱仪对4种抗氧化剂混合对照液(5.0 μg/mL)进行分析,采用二极管阵列检测器在190~400 nm范围内进行波长扫描,结果发现4种抗氧化剂在200 nm波长附近均有较强的吸收带,但是考虑到应避免甲醇紫外吸收产生的影响,本文选择在210 nm波长下进行检测,此波长下色谱峰杂质少,基线平稳。
3.2 溶剂与流动相的选择
欧洲药典7.0版中提出抗氧化剂1010、330、1076、168用乙腈和四氢呋喃(1:1)混合溶液溶解稀释,同时液相色谱流动相选择为水/四氢呋喃/乙腈(1:3:6),但是在实验過程中发现抗氧化剂168不易保存,24 h 后峰面积明显减少并且在其他位置出现新的色谱峰,怀疑是抗氧化剂168的某种分解产物。这些迹象表明,抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃的混合溶液中极易分解,不能稳定存在,进而影响其含量的准确测定。而实验表明在甲醇溶液中,抗氧化剂168可稳定存在超过48 h,并且其余三种抗氧化剂均可稳定存在于甲醇溶液中,因此本文选择甲醇作为对照品溶液溶剂,并以甲醇/水作为液相色谱检测流动相,发现其具有较好的分离度和灵敏度。
3.3 样品处理方法的选择
欧洲药典7.0中,将样品剪碎以甲苯回流,过滤定容后,取50 mL真空45 ℃蒸干然后用5 mL乙腈与四氢呋喃的混合溶液溶解,得到供试品溶液。实验过程中发现蒸干再溶解的过程会导致抗氧化剂含量损失,因此本文所采用的方法是样品以甲苯回流过滤定容后,经0.45μm滤膜过滤后直接进样,通过梯度洗脱将甲苯峰与4种抗氧化剂峰分开,图谱(图1)显示其分离效果好且分析时间适中。
4.小结
本文对欧洲药典7.0中抗氧化剂检测方法进行改进,以甲醇/水作为流动相,避免了使用具有毒性和腐蚀性的试剂,并且具有较好的分离度和灵敏度。同时以甲醇为溶剂配制对照品溶液,4种抗氧化剂均可稳定存在,解决了抗氧化剂168易分解难以准确检测含量的问题。方法学验证结果表明,该检测方法在0.2~8.0 ug/mL范围内具有良好的线性关系,且灵敏度高,具有较好的稳定性和重复性,加样回收率在92%~103%之间。用该方法对3家不同企业聚丙烯粒料和组合盖中抗氧化剂1010、330、1076、168含量进行检测,结果表明,有7批聚丙烯粒料和组合盖中4种抗氧化剂均有添加,另外3批聚丙烯组合盖中检测到添加了抗氧化剂1010、330和168。该方法得建立为聚丙烯包装材料中4种抗氧化剂含量的控制提供一种实用高效的手段。
参考文献
[1] 陈宇,王朝晖,郑德.实用塑料助剂手册[M],化学工业出版社,2007: 272-291.
[2] Triantafyllou V I, Akrida-Demertzi K, Demertzis P G. Astudy on the migration of organic pollutants from recycled paperboard packaging materials to solid food matrices [J]. Food Chemistry,2007,101(4):1759-1768.
[3] 赵美萍,李元宗,常文保.酚类环境雌激素的分析研究进展[J].分析化学,2003,31(1):103-109.
[4] 赵泽文,常青,梁志清.环境雌激素对健康的影响[J].中国临床康复, 2004,8(9):1724-1725.
[5] 李涛,赵声兰,余旭亚,等.抗氧化剂的研究与应用现状[J].食品研究与开发,2003,24(2):23-26.
[6] EP.7.0.344.
[关键词]药品包装材料;聚丙烯组合盖;抗氧化剂;高效液相色谱
中图分类号:TQ325.14 文献标识码:A 文章编号:1009-914X(2014)48-0082-02
抗氧化剂作为包装材料的主要添加剂之一,广泛使用于塑料、纸制品、橡胶等行业,用以延缓材料的氧化和降解,提高材料的化学稳定性,延长材料使用寿命[1]。其与所包装药品或食品接触过程中,会通过吸收、溶解、渗透、扩散等过程透过包装材料迁移入药品或食品中[2],对人的心、肺、肾、脾等器官造成很大危害[3-4],易导致突变和致癌[5]。欧洲药典[6]明确对聚丙烯材料中的抗氧化剂含量作出严格规定。但其所选用的HPLC检测方法中,以乙腈和四氢呋喃等作为溶剂和流动相,有较大的毒性与腐蚀性,并且抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃混合溶液中极易分解,不能稳定存在,这给准确定量检测带来极大的困难。本文选择甲醇为溶剂,实验表明抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076、抗氧化剂168在甲醇中均有较好的稳定性,超过48 h无分解,解决了抗氧化剂168难以准确定量的难题。同时以甲醇/水为流动相,极大降低了流动相的毒性与腐蚀性,减少环境污染。该方法经过方法学验证,具有较好的线性关系,稳定性和重复性,灵敏度高,回收率好,并且操作简单,对环境污染小,相比于欧洲药典中抗氧化剂的检测方法,有较大改进。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪(Agilent 1260);电子天平(METTLER TOLEDO XP105);Millipore纯水系统(Milli-Q Academic)
抗氧化剂1076对照品(CAS号 2082-79-3,99%);抗氧化剂1010对照品(CAS号6683-19-8,99%);抗氧化剂330对照品(CAS号1709-70-2,98%);抗氧化剂168对照品(CAS号31570-04-4,98%)均购自Sigma-Aldrich。
样品:聚丙烯组合盖由生产企业A和B提供,聚丙烯粒料由C企业提供。
甲醇,甲苯(HPLC级,Merck);实验用水为超纯水(电阻率为18.2MΩcm)
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm*4.6 mm, 3.5 μm-Micron,Agilent)。流速:1.5 mL/min;柱温:40℃;检测波长:210 nm;进样体积:20μL。流动相A为超纯水,流动相B为甲醇,梯度洗脱程序见表1。
2.2 对照品溶液的制备
对照储备液:将抗氧化剂1010、330、1076、168对照品20 mg溶于甲醇溶液中,稀释定容至250 mL,置于棕色瓶中,作为对照储备液,4℃冰箱中保存备用。
对照品溶液:精密量取对照储备液 5mL用甲醇稀释至100 mL作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
将样品剪切成边长1 cm的碎片(粒料直接取样),分别精密称定4.0 g,放置于烧瓶中,加入甲苯80 mL,持续搅拌,加热回流1.5 h,冷却至60℃,在搅拌下加入甲醇120 mL,用4号砂芯漏斗过滤。用甲苯与甲醇的混合液(4:6)混合液25 mL清洗烧瓶和滤渣,将清洗液与滤液合并,并用甲醇稀释至250 mL,摇匀,用0.45μm滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系
将“2.3 ”项下对照品溶液,在“2.1”色谱条件下,用甲醇分别稀释至0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0ug/mL,每次进样20 uL。结果显示:在0.2~8.0ug/mL浓度范围内,抗氧化剂1010、330、1076、168均有良好的線性关系。
2.5 精密度试验
取2.0 ug/mL混合对照品溶液,连续进样6次,测定其峰面积,结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.9%、1.5%、1.1%、2.5%。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液(批号A(1304002)),分别在1,4,8,12,24,48h进样,测定其峰面积。结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%、2.2%,表明溶液在48小时内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一份聚丙烯组合盖样品(批号A(1304002))5份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按照上述色谱条件,测定峰面积。结果样品中氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.8%、1.0%、1.5%、2.7%。
2.8 回收率试验
取已知含量的聚丙烯材料样品(批号A(1304002))精密称定4 .0g,分别吸取对照储备液5.0 mL加入到样品中,按“2.3”项下方法制备供试溶液,结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的平均回收率(n=9)分别为102.8%,95.5%,98.4%,92.1%,RSD分别为1.0%,1.8%,1.5%,3.0%。 2.9 最低检出限与最低定量限
取“2.2”项下混合对照品溶液用甲醇稀释测定,当信噪比S/N为3:1时,抗氧化剂1010、330、1076、168的最低检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.8 ng,当信噪比S/N为10:1时,最低定量限分别为0.8、0.8、0.8、2.0 ng。
2.10 样品测定
取聚丙烯组合盖9批及聚丙烯粒料,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,测定。按标准曲线法以峰面积计算含量。测定结果见表2.
3.讨论
3.1 检测波长的确定
使用高效液相色谱仪对4种抗氧化剂混合对照液(5.0 μg/mL)进行分析,采用二极管阵列检测器在190~400 nm范围内进行波长扫描,结果发现4种抗氧化剂在200 nm波长附近均有较强的吸收带,但是考虑到应避免甲醇紫外吸收产生的影响,本文选择在210 nm波长下进行检测,此波长下色谱峰杂质少,基线平稳。
3.2 溶剂与流动相的选择
欧洲药典7.0版中提出抗氧化剂1010、330、1076、168用乙腈和四氢呋喃(1:1)混合溶液溶解稀释,同时液相色谱流动相选择为水/四氢呋喃/乙腈(1:3:6),但是在实验過程中发现抗氧化剂168不易保存,24 h 后峰面积明显减少并且在其他位置出现新的色谱峰,怀疑是抗氧化剂168的某种分解产物。这些迹象表明,抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃的混合溶液中极易分解,不能稳定存在,进而影响其含量的准确测定。而实验表明在甲醇溶液中,抗氧化剂168可稳定存在超过48 h,并且其余三种抗氧化剂均可稳定存在于甲醇溶液中,因此本文选择甲醇作为对照品溶液溶剂,并以甲醇/水作为液相色谱检测流动相,发现其具有较好的分离度和灵敏度。
3.3 样品处理方法的选择
欧洲药典7.0中,将样品剪碎以甲苯回流,过滤定容后,取50 mL真空45 ℃蒸干然后用5 mL乙腈与四氢呋喃的混合溶液溶解,得到供试品溶液。实验过程中发现蒸干再溶解的过程会导致抗氧化剂含量损失,因此本文所采用的方法是样品以甲苯回流过滤定容后,经0.45μm滤膜过滤后直接进样,通过梯度洗脱将甲苯峰与4种抗氧化剂峰分开,图谱(图1)显示其分离效果好且分析时间适中。
4.小结
本文对欧洲药典7.0中抗氧化剂检测方法进行改进,以甲醇/水作为流动相,避免了使用具有毒性和腐蚀性的试剂,并且具有较好的分离度和灵敏度。同时以甲醇为溶剂配制对照品溶液,4种抗氧化剂均可稳定存在,解决了抗氧化剂168易分解难以准确检测含量的问题。方法学验证结果表明,该检测方法在0.2~8.0 ug/mL范围内具有良好的线性关系,且灵敏度高,具有较好的稳定性和重复性,加样回收率在92%~103%之间。用该方法对3家不同企业聚丙烯粒料和组合盖中抗氧化剂1010、330、1076、168含量进行检测,结果表明,有7批聚丙烯粒料和组合盖中4种抗氧化剂均有添加,另外3批聚丙烯组合盖中检测到添加了抗氧化剂1010、330和168。该方法得建立为聚丙烯包装材料中4种抗氧化剂含量的控制提供一种实用高效的手段。
参考文献
[1] 陈宇,王朝晖,郑德.实用塑料助剂手册[M],化学工业出版社,2007: 272-291.
[2] Triantafyllou V I, Akrida-Demertzi K, Demertzis P G. Astudy on the migration of organic pollutants from recycled paperboard packaging materials to solid food matrices [J]. Food Chemistry,2007,101(4):1759-1768.
[3] 赵美萍,李元宗,常文保.酚类环境雌激素的分析研究进展[J].分析化学,2003,31(1):103-109.
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[5] 李涛,赵声兰,余旭亚,等.抗氧化剂的研究与应用现状[J].食品研究与开发,2003,24(2):23-26.
[6] EP.7.0.344.