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[摘 要]建立了高效液相色谱（HPLC）快速定量测定抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076和抗氧化剂168的分析方法。以甲醇/水为流动相，定量检测波长210nm。4种抗氧化剂在0.2～8 ug/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数r均为0.999，定量下限（LOQ，S/N=10）抗氧化剂1010、330、1076为0.8 ng，抗氧化剂168为2.0 ng，样品的加标回收率为92.1%～102.8%，相对标准偏差均低于2.9%。将该方法应用于塑料输液容器用聚丙烯组合盖中抗氧化剂的检测，准确快速、灵敏度高，操作简便，稳定性好，可用于材料中抗氧化剂的质量控制。
[关键词]药品包装材料；聚丙烯组合盖；抗氧化剂；高效液相色谱
中图分类号：TQ325.14 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）48-0082-02
抗氧化剂作为包装材料的主要添加剂之一，广泛使用于塑料、纸制品、橡胶等行业，用以延缓材料的氧化和降解，提高材料的化学稳定性，延长材料使用寿命[1]。其与所包装药品或食品接触过程中，会通过吸收、溶解、渗透、扩散等过程透过包装材料迁移入药品或食品中[2]，对人的心、肺、肾、脾等器官造成很大危害[3-4]，易导致突变和致癌[5]。欧洲药典[6]明确对聚丙烯材料中的抗氧化剂含量作出严格规定。但其所选用的HPLC检测方法中，以乙腈和四氢呋喃等作为溶剂和流动相，有较大的毒性与腐蚀性，并且抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃混合溶液中极易分解，不能稳定存在，这给准确定量检测带来极大的困难。本文选择甲醇为溶剂，实验表明抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076、抗氧化剂168在甲醇中均有较好的稳定性，超过48 h无分解，解决了抗氧化剂168难以准确定量的难题。同时以甲醇/水为流动相，极大降低了流动相的毒性与腐蚀性，减少环境污染。该方法经过方法学验证，具有较好的线性关系，稳定性和重复性，灵敏度高，回收率好，并且操作简单，对环境污染小，相比于欧洲药典中抗氧化剂的检测方法，有较大改进。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent 1260）；电子天平（METTLER TOLEDO XP105）；Millipore纯水系统（Milli-Q Academic）
抗氧化剂1076对照品（CAS号 2082-79-3，99%）；抗氧化剂1010对照品（CAS号6683-19-8，99%）；抗氧化剂330对照品（CAS号1709-70-2，98%）；抗氧化剂168对照品（CAS号31570-04-4，98%）均购自Sigma-Aldrich。
样品：聚丙烯组合盖由生产企业A和B提供，聚丙烯粒料由C企业提供。
甲醇，甲苯（HPLC级，Merck）；实验用水为超纯水（电阻率为18.2MΩcm）
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm*4.6 mm， 3.5 μm-Micron，Agilent）。流速：1.5 mL/min；柱温：40℃；检测波长：210 nm；进样体积：20μL。流动相A为超纯水，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。
2.2 对照品溶液的制备
对照储备液：将抗氧化剂1010、330、1076、168对照品20 mg溶于甲醇溶液中，稀释定容至250 mL，置于棕色瓶中，作为对照储备液，4℃冰箱中保存备用。
对照品溶液：精密量取对照储备液 5mL用甲醇稀释至100 mL作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
将样品剪切成边长1 cm的碎片（粒料直接取样），分别精密称定4.0 g，放置于烧瓶中，加入甲苯80 mL，持续搅拌，加热回流1.5 h，冷却至60℃，在搅拌下加入甲醇120 mL，用4号砂芯漏斗过滤。用甲苯与甲醇的混合液（4：6）混合液25 mL清洗烧瓶和滤渣，将清洗液与滤液合并，并用甲醇稀释至250 mL，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系
将“2.3 ”项下对照品溶液，在“2.1”色谱条件下，用甲醇分别稀释至0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0ug/mL，每次进样20 uL。结果显示：在0.2～8.0ug/mL浓度范围内，抗氧化剂1010、330、1076、168均有良好的線性关系。
2.5 精密度试验
取2.0 ug/mL混合对照品溶液，连续进样6次，测定其峰面积，结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.9%、1.5%、1.1%、2.5%。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液（批号A（1304002）），分别在1，4，8，12，24，48h进样，测定其峰面积。结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%、2.2%，表明溶液在48小时内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一份聚丙烯组合盖样品（批号A（1304002））5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，测定峰面积。结果样品中氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.8%、1.0%、1.5%、2.7%。
2.8 回收率试验
取已知含量的聚丙烯材料样品（批号A（1304002））精密称定4 .0g，分别吸取对照储备液5.0 mL加入到样品中，按“2.3”项下方法制备供试溶液，结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的平均回收率（n=9）分别为102.8%，95.5%，98.4%，92.1%，RSD分别为1.0%，1.8%，1.5%，3.0%。 2.9 最低检出限与最低定量限
取“2.2”项下混合对照品溶液用甲醇稀释测定，当信噪比S/N为3：1时，抗氧化剂1010、330、1076、168的最低检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.8 ng，当信噪比S/N为10：1时，最低定量限分别为0.8、0.8、0.8、2.0 ng。
2.10 样品测定
取聚丙烯组合盖9批及聚丙烯粒料，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定。按标准曲线法以峰面积计算含量。测定结果见表2.
3.讨论
3.1 检测波长的确定
使用高效液相色谱仪对4种抗氧化剂混合对照液（5.0 μg/mL）进行分析，采用二极管阵列检测器在190～400 nm范围内进行波长扫描，结果发现4种抗氧化剂在200 nm波长附近均有较强的吸收带，但是考虑到应避免甲醇紫外吸收产生的影响，本文选择在210 nm波长下进行检测，此波长下色谱峰杂质少，基线平稳。
3.2 溶剂与流动相的选择
欧洲药典7.0版中提出抗氧化剂1010、330、1076、168用乙腈和四氢呋喃（1：1）混合溶液溶解稀释，同时液相色谱流动相选择为水/四氢呋喃/乙腈（1：3：6），但是在实验過程中发现抗氧化剂168不易保存，24 h 后峰面积明显减少并且在其他位置出现新的色谱峰，怀疑是抗氧化剂168的某种分解产物。这些迹象表明，抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃的混合溶液中极易分解，不能稳定存在，进而影响其含量的准确测定。而实验表明在甲醇溶液中，抗氧化剂168可稳定存在超过48 h，并且其余三种抗氧化剂均可稳定存在于甲醇溶液中，因此本文选择甲醇作为对照品溶液溶剂，并以甲醇/水作为液相色谱检测流动相，发现其具有较好的分离度和灵敏度。
3.3 样品处理方法的选择
欧洲药典7.0中，将样品剪碎以甲苯回流，过滤定容后，取50 mL真空45 ℃蒸干然后用5 mL乙腈与四氢呋喃的混合溶液溶解，得到供试品溶液。实验过程中发现蒸干再溶解的过程会导致抗氧化剂含量损失，因此本文所采用的方法是样品以甲苯回流过滤定容后，经0.45μm滤膜过滤后直接进样，通过梯度洗脱将甲苯峰与4种抗氧化剂峰分开，图谱（图1）显示其分离效果好且分析时间适中。
4.小结
本文对欧洲药典7.0中抗氧化剂检测方法进行改进，以甲醇/水作为流动相，避免了使用具有毒性和腐蚀性的试剂，并且具有较好的分离度和灵敏度。同时以甲醇为溶剂配制对照品溶液，4种抗氧化剂均可稳定存在，解决了抗氧化剂168易分解难以准确检测含量的问题。方法学验证结果表明，该检测方法在0.2～8.0 ug/mL范围内具有良好的线性关系，且灵敏度高，具有较好的稳定性和重复性，加样回收率在92%～103%之间。用该方法对3家不同企业聚丙烯粒料和组合盖中抗氧化剂1010、330、1076、168含量进行检测，结果表明，有7批聚丙烯粒料和组合盖中4种抗氧化剂均有添加，另外3批聚丙烯组合盖中检测到添加了抗氧化剂1010、330和168。该方法得建立为聚丙烯包装材料中4种抗氧化剂含量的控制提供一种实用高效的手段。
参考文献
[1] 陈宇，王朝晖，郑德.实用塑料助剂手册[M]，化学工业出版社，2007： 272-291.
[2] Triantafyllou V I， Akrida-Demertzi K， Demertzis P G. Astudy on the migration of organic pollutants from recycled paperboard packaging materials to solid food matrices [J]. Food Chemistry，2007，101（4）：1759-1768.
[3] 赵美萍，李元宗，常文保.酚类环境雌激素的分析研究进展[J].分析化学，2003，31（1）：103-109.
[4] 赵泽文，常青，梁志清.环境雌激素对健康的影响[J].中国临床康复， 2004，8（9）：1724-1725.
[5] 李涛，赵声兰，余旭亚，等.抗氧化剂的研究与应用现状[J].食品研究与开发，2003，24（2）：23-26.
[6] EP.7.0.344.
[关键词]药品包装材料；聚丙烯组合盖；抗氧化剂；高效液相色谱
中图分类号：TQ325.14 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）48-0082-02
抗氧化剂作为包装材料的主要添加剂之一，广泛使用于塑料、纸制品、橡胶等行业，用以延缓材料的氧化和降解，提高材料的化学稳定性，延长材料使用寿命[1]。其与所包装药品或食品接触过程中，会通过吸收、溶解、渗透、扩散等过程透过包装材料迁移入药品或食品中[2]，对人的心、肺、肾、脾等器官造成很大危害[3-4]，易导致突变和致癌[5]。欧洲药典[6]明确对聚丙烯材料中的抗氧化剂含量作出严格规定。但其所选用的HPLC检测方法中，以乙腈和四氢呋喃等作为溶剂和流动相，有较大的毒性与腐蚀性，并且抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃混合溶液中极易分解，不能稳定存在，这给准确定量检测带来极大的困难。本文选择甲醇为溶剂，实验表明抗氧化剂1010、抗氧化剂330、抗氧化剂1076、抗氧化剂168在甲醇中均有较好的稳定性，超过48 h无分解，解决了抗氧化剂168难以准确定量的难题。同时以甲醇/水为流动相，极大降低了流动相的毒性与腐蚀性，减少环境污染。该方法经过方法学验证，具有较好的线性关系，稳定性和重复性，灵敏度高，回收率好，并且操作简单，对环境污染小，相比于欧洲药典中抗氧化剂的检测方法，有较大改进。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent 1260）；电子天平（METTLER TOLEDO XP105）；Millipore纯水系统（Milli-Q Academic）
抗氧化剂1076对照品（CAS号 2082-79-3，99%）；抗氧化剂1010对照品（CAS号6683-19-8，99%）；抗氧化剂330对照品（CAS号1709-70-2，98%）；抗氧化剂168对照品（CAS号31570-04-4，98%）均购自Sigma-Aldrich。
样品：聚丙烯组合盖由生产企业A和B提供，聚丙烯粒料由C企业提供。
甲醇，甲苯（HPLC级，Merck）；实验用水为超纯水（电阻率为18.2MΩcm）
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm*4.6 mm， 3.5 μm-Micron，Agilent）。流速：1.5 mL/min；柱温：40℃；检测波长：210 nm；进样体积：20μL。流动相A为超纯水，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。
2.2 对照品溶液的制备
对照储备液：将抗氧化剂1010、330、1076、168对照品20 mg溶于甲醇溶液中，稀释定容至250 mL，置于棕色瓶中，作为对照储备液，4℃冰箱中保存备用。
对照品溶液：精密量取对照储备液 5mL用甲醇稀释至100 mL作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
将样品剪切成边长1 cm的碎片（粒料直接取样），分别精密称定4.0 g，放置于烧瓶中，加入甲苯80 mL，持续搅拌，加热回流1.5 h，冷却至60℃，在搅拌下加入甲醇120 mL，用4号砂芯漏斗过滤。用甲苯与甲醇的混合液（4：6）混合液25 mL清洗烧瓶和滤渣，将清洗液与滤液合并，并用甲醇稀释至250 mL，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系
将“2.3 ”项下对照品溶液，在“2.1”色谱条件下，用甲醇分别稀释至0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0ug/mL，每次进样20 uL。结果显示：在0.2～8.0ug/mL浓度范围内，抗氧化剂1010、330、1076、168均有良好的線性关系。
2.5 精密度试验
取2.0 ug/mL混合对照品溶液，连续进样6次，测定其峰面积，结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.9%、1.5%、1.1%、2.5%。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液（批号A（1304002）），分别在1，4，8，12，24，48h进样，测定其峰面积。结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为1.3%、1.0%、1.1%、2.2%，表明溶液在48小时内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一份聚丙烯组合盖样品（批号A（1304002））5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，测定峰面积。结果样品中氧化剂1010、330、1076、168的RSD分别为0.8%、1.0%、1.5%、2.7%。
2.8 回收率试验
取已知含量的聚丙烯材料样品（批号A（1304002））精密称定4 .0g，分别吸取对照储备液5.0 mL加入到样品中，按“2.3”项下方法制备供试溶液，结果显示抗氧化剂1010、330、1076、168的平均回收率（n=9）分别为102.8%，95.5%，98.4%，92.1%，RSD分别为1.0%，1.8%，1.5%，3.0%。 2.9 最低检出限与最低定量限
取“2.2”项下混合对照品溶液用甲醇稀释测定，当信噪比S/N为3：1时，抗氧化剂1010、330、1076、168的最低检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.8 ng，当信噪比S/N为10：1时，最低定量限分别为0.8、0.8、0.8、2.0 ng。
2.10 样品测定
取聚丙烯组合盖9批及聚丙烯粒料，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定。按标准曲线法以峰面积计算含量。测定结果见表2.
3.讨论
3.1 检测波长的确定
使用高效液相色谱仪对4种抗氧化剂混合对照液（5.0 μg/mL）进行分析，采用二极管阵列检测器在190～400 nm范围内进行波长扫描，结果发现4种抗氧化剂在200 nm波长附近均有较强的吸收带，但是考虑到应避免甲醇紫外吸收产生的影响，本文选择在210 nm波长下进行检测，此波长下色谱峰杂质少，基线平稳。
3.2 溶剂与流动相的选择
欧洲药典7.0版中提出抗氧化剂1010、330、1076、168用乙腈和四氢呋喃（1：1）混合溶液溶解稀释，同时液相色谱流动相选择为水/四氢呋喃/乙腈（1：3：6），但是在实验過程中发现抗氧化剂168不易保存，24 h 后峰面积明显减少并且在其他位置出现新的色谱峰，怀疑是抗氧化剂168的某种分解产物。这些迹象表明，抗氧化剂168在乙腈与四氢呋喃的混合溶液中极易分解，不能稳定存在，进而影响其含量的准确测定。而实验表明在甲醇溶液中，抗氧化剂168可稳定存在超过48 h，并且其余三种抗氧化剂均可稳定存在于甲醇溶液中，因此本文选择甲醇作为对照品溶液溶剂，并以甲醇/水作为液相色谱检测流动相，发现其具有较好的分离度和灵敏度。
3.3 样品处理方法的选择
欧洲药典7.0中，将样品剪碎以甲苯回流，过滤定容后，取50 mL真空45 ℃蒸干然后用5 mL乙腈与四氢呋喃的混合溶液溶解，得到供试品溶液。实验过程中发现蒸干再溶解的过程会导致抗氧化剂含量损失，因此本文所采用的方法是样品以甲苯回流过滤定容后，经0.45μm滤膜过滤后直接进样，通过梯度洗脱将甲苯峰与4种抗氧化剂峰分开，图谱（图1）显示其分离效果好且分析时间适中。
4.小结
本文对欧洲药典7.0中抗氧化剂检测方法进行改进，以甲醇/水作为流动相，避免了使用具有毒性和腐蚀性的试剂，并且具有较好的分离度和灵敏度。同时以甲醇为溶剂配制对照品溶液，4种抗氧化剂均可稳定存在，解决了抗氧化剂168易分解难以准确检测含量的问题。方法学验证结果表明，该检测方法在0.2～8.0 ug/mL范围内具有良好的线性关系，且灵敏度高，具有较好的稳定性和重复性，加样回收率在92%～103%之间。用该方法对3家不同企业聚丙烯粒料和组合盖中抗氧化剂1010、330、1076、168含量进行检测，结果表明，有7批聚丙烯粒料和组合盖中4种抗氧化剂均有添加，另外3批聚丙烯组合盖中检测到添加了抗氧化剂1010、330和168。该方法得建立为聚丙烯包装材料中4种抗氧化剂含量的控制提供一种实用高效的手段。
参考文献
[1] 陈宇，王朝晖，郑德.实用塑料助剂手册[M]，化学工业出版社，2007： 272-291.
[2] Triantafyllou V I， Akrida-Demertzi K， Demertzis P G. Astudy on the migration of organic pollutants from recycled paperboard packaging materials to solid food matrices [J]. Food Chemistry，2007，101（4）：1759-1768.
[3] 赵美萍，李元宗，常文保.酚类环境雌激素的分析研究进展[J].分析化学，2003，31（1）：103-109.
[4] 赵泽文，常青，梁志清.环境雌激素对健康的影响[J].中国临床康复， 2004，8（9）：1724-1725.
[5] 李涛，赵声兰，余旭亚，等.抗氧化剂的研究与应用现状[J].食品研究与开发，2003，24（2）：23-26.
[6] EP.7.0.344.