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摘 要：白化突变体As-81647是在自交系81647的自交后代中发现的自然突变体。光合色素含量测定表明，白化突变体叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量分别为正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，推测光合色素含量的减少导致突变体光合作用强度减弱，无法利用光能进行营养生长，进而造成突变体产生白化表型，三叶期左右萎蔫死亡。组织细胞染色实验证实H2O2的积累可能是造成突变体细胞死亡的直接原因之一。本研究构建了As-81647杂合突变体与蒙自2的杂交F2分离群体，遗传分析表明该白化性状由一对隐性核基因控制，暂时命名为As-81647（Albino seeding-81647）。利用已公布的SSR分子标记和本实验室开发的分子标记，将该基因定位在玉米第3染色体umc1052和umc1641之间，遗传距离分别为0.7 cM和 2.8 cM 且与分子标记as47共分离。
关键词：玉米（Zea mays L.）；白化突变体；基因定位
中图分类号：S513.032 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）10-0012-04
高等植物中，植株叶色突变比较常见，该类突变体是研究植物光合作用、光形态建成等的理想材料[1～6]。此外，叶色突变极易识别，可作为标记性状应用于良种选育[7]和杂交育种[8]中。Gustafsson根据突变体苗期的叶色差异将叶色突变分为白化、黄化、淡绿、条纹和斑点五种类型[9]。其中，白化致死突变是叶绿素缺失突变体中缺失最彻底、最严重的一类，这种极端表型的突变体在机理研究方面具有更为重要的利用价值。目前在拟南芥[10]、玉米[11]、水稻[12，13]、烟草[14]等植物中均有白化突变体的报道。玉米突变体库MaizeGDB报道的177个叶色突变基因中，白化基因16个，黄白叶基因12个，这些基因的研究进展不一致，有些已定位到很小的区域，有些只初步定位到特定染色体上。16个白化基因及染色体定位结果为：w*-018-3（1）、w*-021-7（5）、w*-062-3（3）、w*-6577（1.06）、w*-8345（1.05）、w*-8889（9.03）、w*-8950（9）、w*-8954（6）、w*-9000（9.01）、w*-9005（4）、w20 white（1.05）、w24 white（1.06）、ij1 iojap striping1（7.03）、blh*-N2359（8.04）和blh*-N487C（1）； 12个黄白叶基因及染色体定位结果为：yg*-N2448（1.02）、v*-N308（5.05）、wl*-N1803（9）、wl*-N1982（8.05）、wl*-N311B（4.06）、wl*-N362B（6.02）、wl*-N4（3.05）、wl*-N44（5）、wl*-N47（1.06）、wl*-N56（1.06）、wl*-N60（1.06）、wlu7（1.05）和wlu9（5.05）。
本研究从玉米自交系81647中发现了白化突变体As-81647，此突变体从出苗到二叶或三叶期萎蔫死亡期间所有叶片均是白色，与我们之前报道的来源相同的黄化致死突变体nec-t[15]表型明显不同。本研究的主要目的是初步明确白化基因As-81647的遗传特点，确定其在染色体上的位置，为进一步研究白化突变体形成的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本实验室选育的含白化突变基因的自交系81647（As-81647杂合突变体）和正常自交系蒙自2。
1.2 光合色素提取及含量的测定
1.2.1 光合色素的提取 利用95%乙醇离体法萃取二至三叶期玉米叶片光合色素[16]。
1.2.2 光合色素含量的测定 利用紫外可见分光光度计UV-2450分别测量提取液在波长665、649 nm和470 nm 下的吸光度。根据Lichtenthaler修正公式[17]计算各光合色素的含量。
1.3 组织细胞染色
1.3.1 台盼蓝（Trypan blue）染色 将植株叶片浸泡在台盼蓝溶液中（每1 ml乳酚中溶解2.5 mg 台盼蓝粉末），沸水浴染色10 min，室温染色12 h，水合氯醛（2.5 g/ml）中脱色3～4 d 。解剖镜（Olympus， SZX12）下观察、照相。
1.3.2 二氨基联苯胺（Diamino benzidine， DAB）染色 将DAB溶于蒸馏水中，使终浓度为1 mg/ml，盐酸调pH至3.8。剪取长度为5 cm 的叶片，浸透于DAB溶液中，光照培养箱反应8 h。剪取中间3 cm 置于75%酒精中煮沸，脱色。解剖镜（Olympus， SZX12）下观察、照相。
1.4 遗传分离群体的构建
利用AS-81647杂合突变体作父本与蒙自2配置杂交组合，用自交能分离出白化突变体的对应单株进行F1自交，获得F2分离群体，用于玉米白化性状的遗传分析和白化基因定位。
1.5 基因组DNA提取与基因定位
1.5.1 基因组DNA提取 将获得的F2群体种植于山东农业大学农学试验站，于二叶期选取幼嫩叶片，采用SDS法提取基因组DNA[18]。
1.5.2 白化基因As-81647的连锁分析 采用BSA法筛选与突变基因连锁的分子标记[19]，所用PCR反应体系（10 μl）为： 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）1.0 μl、dNTPs（2.5 mmol/L ）0.2 μl、引物（10 μmol/L ） 1.0 μl、模板DNA（20～50 ng/μl） 1.0 μl、Taq酶（5 U/μl ）0.1 μl、ddH2O 6.7 μl。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 50 s，36个循环；72℃ 10 min。利用获得的多态性分子标记鉴定F2代植株并记录单株表型（白化或正常）。采用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离，使用MapDraw软件绘制连锁图谱。 2 结果与分析
2.1 白化突变体As-81647的发现和表型特征
在玉米自交系81647中发现叶色白化突变体As-81647，培养箱或大田种植，突变体幼苗都表现为白色，二叶或三叶期萎蔫死亡，整个生长期间除所有叶片表现为白色外，其他表型特征与正常植株无明显区别（图1）。由于纯合突变体无法进行生殖生长，该突变性状依靠杂合体遗传给后代。
2.2 白化突变株与正常植株光合色素含量差异
白化突变植株叶片光合色素含量均显著低于正常植株（表1），推测光合色素的缺失可能是导致突变体呈现白化性状的直接原因。一方面，突变体叶绿素含量极少，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量分别为正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，几乎不能利用光能进行营养生长，只能依靠胚乳提供的营养物质，待胚乳养分消耗殆尽，突变体随之死亡，突变体胚乳大小可能决定其萎蔫死亡的早晚；另一方面，突变体叶绿素a/b约为正常植株的1/10，远远低于正常水平，叶绿素a/b的值反映了植物的光能利用率，说明突变体的光能利用率也低于正常水平。
2.3 正常植株及突变体叶片的组织细胞染色
为进一步明确白化突变体死亡的原因，对突变体和正常植株叶片（三叶期）进行了组织细胞染色。
2.3.1 台盼蓝染色 植物细胞损伤或死亡时，细胞膜通透性增强，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色；而正常的活细胞，胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞，从而不会被台盼蓝染色，根据颜色差异可直接区分正常与死亡细胞。台盼蓝染色结果如图2所示，白化突变体叶片被染成深蓝色，整个叶片染色较均匀，而正常植株未被染成蓝色，表明该时期突变体叶片内部细胞已经死亡或在死亡进程中。
2.3.2 DAB染色 植物体可通过叶绿体、线粒体、过氧化物酶体等细胞器产生活性氧。活性氧具有较高化学毒性，低浓度活性氧能够引起植物防御，高浓度活性氧则能够造成植物细胞死亡。正常植株通过一系列代谢清除机制能够将活性氧浓度维持在正常水平，若代谢发生障碍则会造成活性氧的积累，从而造成植物体细胞损伤。DAB能与H2O2在过氧化物酶的催化作用下反应生成褐色沉淀物，可用于检测H2O2的产生及积累部位。DAB染色结果如图3所示，正常植株未见褐色沉淀，而白化突变体的整个叶片被染成褐色，说明白化突变体细胞死亡过程中整个叶片均有H2O2的积累。H2O2的积累可能是导致白化突变体细胞死亡的直接原因之一。
2.4 白化突变体遗传分析
为探讨该白化性状的遗传方式，将蒙自2与As-81647杂合突变体杂交，所得F1代植株叶片颜色均表现为绿色。F1自交得到F2，首先鉴定出F2中分离的果穗，从出现分离的果穗中挑选5个在大田种植鉴定其分离比（表2），卡方检验结果表明正常植株与白化植株呈现3∶1的分离比例，表明该白化突变表型受一对隐性核基因控制，暂命名为As-81647。
2.5 白化基因As-81647的定位
从玉米数据库中（http：//www.maizegdb.org）挑选308对均匀分布在玉米10条染色体上的SSR引物，在两亲本间共检测到76对多态性标记。利用BSA法构建正常基因池和白化突变基因池进一步筛选，得到10个多态性标记。连锁分析表明位于第3条染色体上的SSR标记umc1594（bin3.09）可能与目的基因连锁。利用496株F2代白化突变株验证，共出现84株交换单株，进一步证明umc1594（bin3.09）与目的基因是连锁的，遗传距离为16.9 cM 。利用SSRHunter、Primer Premier5.0软件在bin3.09区域开发出54对SSR标记，加上bin3.09区域25对公共SSR标记，对分离群体进行了连锁分析，最终将目标基因定位于umc1052和umc1641之间，遗传距离分别为0.7 cM 和2.8 cM ，且与as47共分离（as47所在BAC文库为AC212477.3，引物序列：正：AACCCCATCTTGCTCGTA，反：TCGCCATTCTGTAAAGTCC）。利用MapDraw软件绘制连锁图（图4）。
3 讨论
白化突变体As-81647与黄化类病变突变体nec-t都属于自然叶色突变，遗传分析表明两突变都是受一对隐性核基因控制，开始我们认为As-81647是nec-t突变的一种类型，通过进一步研究将As-81647定位在bin3.09区域，与nec-t突变基因定位区间明显不同，证明两突变基因并非等位基因。由于自然界中叶色突变时有发生，推测两基因在突变进程上可能并无太大关联，只是同宗亲本在不同方向上的突变。
MaizeGDB报道的28个表型相同或相近的突变基因均与白化基因As-81647处于不同位点且多数定位范围较笼统。其中，黄白叶突变基因wl*-N4定位在bin3.05区域，与As-81647定位区间不同，两突变体表型也略有差异，推断两突变基因为非等位基因；白化突变基因w*-062-3虽与As-81647定位在相同染色体上，但w*-062-3目前研究较少，无具体定位区间的报道，难以证明与As-81647基因是否等位，为判断As-81647是否是新的突变基因需要与w*-062-3进行进一步的等位性分析。此外，As-81647基因定位区间内尚有共分离的SSR标记，有待于进一步扩大群体缩小定位区间，并进一步克隆该基因，为探讨叶绿素合成过程及白化机理奠定基础。
参 考 文 献：
[1] Fambrini M， Castagna A， Vecchia F D， et al. Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower（Helianthus annuus L.） with abnormal chloroplast biogenesis， reduced PSⅡ activity and low endogenous level of abscisic acid[J]. Plant Science， 2004， 167（1）： 79-89. [2] Jung K H， Hur J， Ryu C H， et al. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system[J]. Plant and Cell Physiology， 2003， 44（5）： 463-472.
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关键词：玉米（Zea mays L.）；白化突变体；基因定位
中图分类号：S513.032 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）10-0012-04
高等植物中，植株叶色突变比较常见，该类突变体是研究植物光合作用、光形态建成等的理想材料[1～6]。此外，叶色突变极易识别，可作为标记性状应用于良种选育[7]和杂交育种[8]中。Gustafsson根据突变体苗期的叶色差异将叶色突变分为白化、黄化、淡绿、条纹和斑点五种类型[9]。其中，白化致死突变是叶绿素缺失突变体中缺失最彻底、最严重的一类，这种极端表型的突变体在机理研究方面具有更为重要的利用价值。目前在拟南芥[10]、玉米[11]、水稻[12，13]、烟草[14]等植物中均有白化突变体的报道。玉米突变体库MaizeGDB报道的177个叶色突变基因中，白化基因16个，黄白叶基因12个，这些基因的研究进展不一致，有些已定位到很小的区域，有些只初步定位到特定染色体上。16个白化基因及染色体定位结果为：w*-018-3（1）、w*-021-7（5）、w*-062-3（3）、w*-6577（1.06）、w*-8345（1.05）、w*-8889（9.03）、w*-8950（9）、w*-8954（6）、w*-9000（9.01）、w*-9005（4）、w20 white（1.05）、w24 white（1.06）、ij1 iojap striping1（7.03）、blh*-N2359（8.04）和blh*-N487C（1）； 12个黄白叶基因及染色体定位结果为：yg*-N2448（1.02）、v*-N308（5.05）、wl*-N1803（9）、wl*-N1982（8.05）、wl*-N311B（4.06）、wl*-N362B（6.02）、wl*-N4（3.05）、wl*-N44（5）、wl*-N47（1.06）、wl*-N56（1.06）、wl*-N60（1.06）、wlu7（1.05）和wlu9（5.05）。
本研究从玉米自交系81647中发现了白化突变体As-81647，此突变体从出苗到二叶或三叶期萎蔫死亡期间所有叶片均是白色，与我们之前报道的来源相同的黄化致死突变体nec-t[15]表型明显不同。本研究的主要目的是初步明确白化基因As-81647的遗传特点，确定其在染色体上的位置，为进一步研究白化突变体形成的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本实验室选育的含白化突变基因的自交系81647（As-81647杂合突变体）和正常自交系蒙自2。
1.2 光合色素提取及含量的测定
1.2.1 光合色素的提取 利用95%乙醇离体法萃取二至三叶期玉米叶片光合色素[16]。
1.2.2 光合色素含量的测定 利用紫外可见分光光度计UV-2450分别测量提取液在波长665、649 nm和470 nm 下的吸光度。根据Lichtenthaler修正公式[17]计算各光合色素的含量。
1.3 组织细胞染色
1.3.1 台盼蓝（Trypan blue）染色 将植株叶片浸泡在台盼蓝溶液中（每1 ml乳酚中溶解2.5 mg 台盼蓝粉末），沸水浴染色10 min，室温染色12 h，水合氯醛（2.5 g/ml）中脱色3～4 d 。解剖镜（Olympus， SZX12）下观察、照相。
1.3.2 二氨基联苯胺（Diamino benzidine， DAB）染色 将DAB溶于蒸馏水中，使终浓度为1 mg/ml，盐酸调pH至3.8。剪取长度为5 cm 的叶片，浸透于DAB溶液中，光照培养箱反应8 h。剪取中间3 cm 置于75%酒精中煮沸，脱色。解剖镜（Olympus， SZX12）下观察、照相。
1.4 遗传分离群体的构建
利用AS-81647杂合突变体作父本与蒙自2配置杂交组合，用自交能分离出白化突变体的对应单株进行F1自交，获得F2分离群体，用于玉米白化性状的遗传分析和白化基因定位。
1.5 基因组DNA提取与基因定位
1.5.1 基因组DNA提取 将获得的F2群体种植于山东农业大学农学试验站，于二叶期选取幼嫩叶片，采用SDS法提取基因组DNA[18]。
1.5.2 白化基因As-81647的连锁分析 采用BSA法筛选与突变基因连锁的分子标记[19]，所用PCR反应体系（10 μl）为： 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）1.0 μl、dNTPs（2.5 mmol/L ）0.2 μl、引物（10 μmol/L ） 1.0 μl、模板DNA（20～50 ng/μl） 1.0 μl、Taq酶（5 U/μl ）0.1 μl、ddH2O 6.7 μl。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 50 s，36个循环；72℃ 10 min。利用获得的多态性分子标记鉴定F2代植株并记录单株表型（白化或正常）。采用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离，使用MapDraw软件绘制连锁图谱。 2 结果与分析
2.1 白化突变体As-81647的发现和表型特征
在玉米自交系81647中发现叶色白化突变体As-81647，培养箱或大田种植，突变体幼苗都表现为白色，二叶或三叶期萎蔫死亡，整个生长期间除所有叶片表现为白色外，其他表型特征与正常植株无明显区别（图1）。由于纯合突变体无法进行生殖生长，该突变性状依靠杂合体遗传给后代。
2.2 白化突变株与正常植株光合色素含量差异
白化突变植株叶片光合色素含量均显著低于正常植株（表1），推测光合色素的缺失可能是导致突变体呈现白化性状的直接原因。一方面，突变体叶绿素含量极少，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量分别为正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，几乎不能利用光能进行营养生长，只能依靠胚乳提供的营养物质，待胚乳养分消耗殆尽，突变体随之死亡，突变体胚乳大小可能决定其萎蔫死亡的早晚；另一方面，突变体叶绿素a/b约为正常植株的1/10，远远低于正常水平，叶绿素a/b的值反映了植物的光能利用率，说明突变体的光能利用率也低于正常水平。
2.3 正常植株及突变体叶片的组织细胞染色
为进一步明确白化突变体死亡的原因，对突变体和正常植株叶片（三叶期）进行了组织细胞染色。
2.3.1 台盼蓝染色 植物细胞损伤或死亡时，细胞膜通透性增强，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色；而正常的活细胞，胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞，从而不会被台盼蓝染色，根据颜色差异可直接区分正常与死亡细胞。台盼蓝染色结果如图2所示，白化突变体叶片被染成深蓝色，整个叶片染色较均匀，而正常植株未被染成蓝色，表明该时期突变体叶片内部细胞已经死亡或在死亡进程中。
2.3.2 DAB染色 植物体可通过叶绿体、线粒体、过氧化物酶体等细胞器产生活性氧。活性氧具有较高化学毒性，低浓度活性氧能够引起植物防御，高浓度活性氧则能够造成植物细胞死亡。正常植株通过一系列代谢清除机制能够将活性氧浓度维持在正常水平，若代谢发生障碍则会造成活性氧的积累，从而造成植物体细胞损伤。DAB能与H2O2在过氧化物酶的催化作用下反应生成褐色沉淀物，可用于检测H2O2的产生及积累部位。DAB染色结果如图3所示，正常植株未见褐色沉淀，而白化突变体的整个叶片被染成褐色，说明白化突变体细胞死亡过程中整个叶片均有H2O2的积累。H2O2的积累可能是导致白化突变体细胞死亡的直接原因之一。
2.4 白化突变体遗传分析
为探讨该白化性状的遗传方式，将蒙自2与As-81647杂合突变体杂交，所得F1代植株叶片颜色均表现为绿色。F1自交得到F2，首先鉴定出F2中分离的果穗，从出现分离的果穗中挑选5个在大田种植鉴定其分离比（表2），卡方检验结果表明正常植株与白化植株呈现3∶1的分离比例，表明该白化突变表型受一对隐性核基因控制，暂命名为As-81647。
2.5 白化基因As-81647的定位
从玉米数据库中（http：//www.maizegdb.org）挑选308对均匀分布在玉米10条染色体上的SSR引物，在两亲本间共检测到76对多态性标记。利用BSA法构建正常基因池和白化突变基因池进一步筛选，得到10个多态性标记。连锁分析表明位于第3条染色体上的SSR标记umc1594（bin3.09）可能与目的基因连锁。利用496株F2代白化突变株验证，共出现84株交换单株，进一步证明umc1594（bin3.09）与目的基因是连锁的，遗传距离为16.9 cM 。利用SSRHunter、Primer Premier5.0软件在bin3.09区域开发出54对SSR标记，加上bin3.09区域25对公共SSR标记，对分离群体进行了连锁分析，最终将目标基因定位于umc1052和umc1641之间，遗传距离分别为0.7 cM 和2.8 cM ，且与as47共分离（as47所在BAC文库为AC212477.3，引物序列：正：AACCCCATCTTGCTCGTA，反：TCGCCATTCTGTAAAGTCC）。利用MapDraw软件绘制连锁图（图4）。
3 讨论
白化突变体As-81647与黄化类病变突变体nec-t都属于自然叶色突变，遗传分析表明两突变都是受一对隐性核基因控制，开始我们认为As-81647是nec-t突变的一种类型，通过进一步研究将As-81647定位在bin3.09区域，与nec-t突变基因定位区间明显不同，证明两突变基因并非等位基因。由于自然界中叶色突变时有发生，推测两基因在突变进程上可能并无太大关联，只是同宗亲本在不同方向上的突变。
MaizeGDB报道的28个表型相同或相近的突变基因均与白化基因As-81647处于不同位点且多数定位范围较笼统。其中，黄白叶突变基因wl*-N4定位在bin3.05区域，与As-81647定位区间不同，两突变体表型也略有差异，推断两突变基因为非等位基因；白化突变基因w*-062-3虽与As-81647定位在相同染色体上，但w*-062-3目前研究较少，无具体定位区间的报道，难以证明与As-81647基因是否等位，为判断As-81647是否是新的突变基因需要与w*-062-3进行进一步的等位性分析。此外，As-81647基因定位区间内尚有共分离的SSR标记，有待于进一步扩大群体缩小定位区间，并进一步克隆该基因，为探讨叶绿素合成过程及白化机理奠定基础。
参 考 文 献：
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