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【摘要】目的：建立通过验证的埃索美拉唑钠的微生物限度检测方法。方法：用薄膜过滤加200mL pH70的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗的方法检查该品需氧菌总数，用常规培养法检查该品霉菌和酵母菌总数；直接薄膜过滤法检查控制菌大肠埃希菌。结果：对埃索美拉唑钠进行微生物限度检查可用薄膜过滤法。结论：应优先采用薄膜过滤法，以去除埃索美拉唑钠的抑菌效力，为其微生物检验方法的确立提供了实验室检测根据。
【关键词】埃索美拉唑钠；微生物限度；方法学验证
【中图分类号】R975+2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）11-0022-03
Validation of Microbial Limit Study of Esomeprazole Sodium
ZHENG Lu
Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China
Objective To validate the microbial limit tests of Esomeprazole sodium. Methods Compare studing with the conventional method， membrane-filter procedure， membrane-filter procedure and washing methods. Results Membrane-filter procedure and washing 200mL with pH 70 method can be used to examin total amount of aerobe， conventional culture method can be used to check the mold and yeast， direct membrane-filter procedure can be used to examin mould and saccharomycetes and Escherichia coli count. Conclusion Membrane- filter procedure should be considered preferentially in performing microbial limit test for Esomeprazole sodium.
Esomeprazole Sodium； Microbial Limit； Method Validation
埃索美拉唑鈉是治疗胃食管反流病等酸相关疾病的首选药物，抑酸效率很高且持续时间长，有可能有一定的抑菌作用[1]，按照2015年版《中国药典》四部[2]规定，对其微生物限度检查时要有必要的方法进行适用性试验。因此笔者进行了埃索美拉唑钠的微生物限度方法适用性试验，并对结果进行分析如下。
1仪器与材料
11仪器SHH-250LD生化培养箱（重庆四达）、HVA-110高压灭菌器（日本HIRAYAMA）、5A10003电子天平（上海越平科技仪器有限公司）、MZ-301微生物限度仪（美卓生物科技有限公司）。
12样品埃索美拉唑钠（福安药业股份有限公司）。
13菌种金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]均由中国药品生物制品检定所提供。
14培养基胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基。以上培养基由北京三药科技开发公司提供。
2方法与结果
21菌液制备取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌液体培养物分别用09%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物用09%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。取经25℃培养6天的黑曲霉菌斜面培养物，加入含005%（mL/mL）聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管至无菌试管内），用09%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
22供试液的制备精密称取样品10g，加pH70 NaCl-蛋白胨缓冲液至100mL使浓度成1：10的澄明供试液。
23验证方法按照《中国药典》2015年版[1]四部通则1105、1106微生物限度检查法进行微生物限度方法适用性检查，采用常规法、薄膜过滤法、以及薄膜过滤加冲洗液冲洗的方法验证。
24需氧菌总数计数验证进行3次独立的平行试验，并分别计算每种菌每个方法的回收率。
241常规法取供试液1mL和21项下制备的菌悬液1mL同时加入平皿中，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。
242过滤法取供试液1mL和21项下制备的菌悬液1mL混匀，薄膜过滤，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。
243过滤加冲洗法取供试液1mL薄膜过滤，过滤完毕，用100、200、400mL pH70的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，在最后一次的冲洗液中加入21项下的试验菌悬液1mL混匀，过滤。倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。 244结果回收率计算公式：各菌株回收率={[（试验组菌数—供试液对照组菌数）]}÷菌液组菌数×100%。
由表1可知，常规法检查时，金葡、铜绿和枯草的试验回收率很低，达不到药典要求。由表1、表2可知，枯草芽孢杆菌对该品种的药品较为敏感，因此过滤加冲洗法只采用了枯草芽孢杆菌进行验证。结果详见表1、表2、表3。
7
26控制菌大肠埃希菌验证
261试验组方法①取1∶[KG-3/5]10供试液10mL与每1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌同时加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。②取1∶10供试液10mL与每1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌混匀，薄膜过滤，将膜取下加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
262样品组方法取1∶10供试液10mL加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
263阳性对照方法将1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
264阴性对照取稀释液10mL加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
265结果大肠埃希菌验证结果详见表5。
3讨论
产品按《中国药典》（2015年版）[2]四部通则1105、1106微生物限度检查法进行微生物限度方法适用性检查，结果表明可用薄膜过滤，用200mL pH70的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗的方法检查本品需氧菌总数，用常规培养法检查本品霉菌和酵母菌总数，控制菌大肠埃希菌的检查用直接薄膜过滤法可行。
埃索美拉唑钠为抑制胃酸过多的一款首选药物，关于它的微生物限度方法学研究还没有见到相关的报到，此次研究表明其具有一定的抑菌作用，与刘志武等[3]关于注射用埃索美拉唑钠的研究结果相符。另外，在对其进行微生物检测时要用一定的方法去除其抑菌效力。研究为埃索美拉唑钠的微生物检验方法的确立提供了实验室检测依据。
参考文献
[1]李洁.埃索美拉唑与其他类质子泵抑制剂抑酸效果比较研究[J].食品与药品， 2012， 14（7）： 281-282.
[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）[S].北京： 中国医药科技出版社，2015：1105-1106.
[3]劉志武，武会芝，王霞，等. 注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法学的研究[J].中国药业指南，2014，12（22）：10-11.
（收稿日期：2017-04-01编辑：陶希睿）
【关键词】埃索美拉唑钠；微生物限度；方法学验证
【中图分类号】R975+2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）11-0022-03
Validation of Microbial Limit Study of Esomeprazole Sodium
ZHENG Lu
Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China
Objective To validate the microbial limit tests of Esomeprazole sodium. Methods Compare studing with the conventional method， membrane-filter procedure， membrane-filter procedure and washing methods. Results Membrane-filter procedure and washing 200mL with pH 70 method can be used to examin total amount of aerobe， conventional culture method can be used to check the mold and yeast， direct membrane-filter procedure can be used to examin mould and saccharomycetes and Escherichia coli count. Conclusion Membrane- filter procedure should be considered preferentially in performing microbial limit test for Esomeprazole sodium.
Esomeprazole Sodium； Microbial Limit； Method Validation
埃索美拉唑鈉是治疗胃食管反流病等酸相关疾病的首选药物，抑酸效率很高且持续时间长，有可能有一定的抑菌作用[1]，按照2015年版《中国药典》四部[2]规定，对其微生物限度检查时要有必要的方法进行适用性试验。因此笔者进行了埃索美拉唑钠的微生物限度方法适用性试验，并对结果进行分析如下。
1仪器与材料
11仪器SHH-250LD生化培养箱（重庆四达）、HVA-110高压灭菌器（日本HIRAYAMA）、5A10003电子天平（上海越平科技仪器有限公司）、MZ-301微生物限度仪（美卓生物科技有限公司）。
12样品埃索美拉唑钠（福安药业股份有限公司）。
13菌种金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]均由中国药品生物制品检定所提供。
14培养基胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基。以上培养基由北京三药科技开发公司提供。
2方法与结果
21菌液制备取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌液体培养物分别用09%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物用09%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液。取经25℃培养6天的黑曲霉菌斜面培养物，加入含005%（mL/mL）聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管至无菌试管内），用09%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
22供试液的制备精密称取样品10g，加pH70 NaCl-蛋白胨缓冲液至100mL使浓度成1：10的澄明供试液。
23验证方法按照《中国药典》2015年版[1]四部通则1105、1106微生物限度检查法进行微生物限度方法适用性检查，采用常规法、薄膜过滤法、以及薄膜过滤加冲洗液冲洗的方法验证。
24需氧菌总数计数验证进行3次独立的平行试验，并分别计算每种菌每个方法的回收率。
241常规法取供试液1mL和21项下制备的菌悬液1mL同时加入平皿中，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。
242过滤法取供试液1mL和21项下制备的菌悬液1mL混匀，薄膜过滤，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。
243过滤加冲洗法取供试液1mL薄膜过滤，过滤完毕，用100、200、400mL pH70的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，在最后一次的冲洗液中加入21项下的试验菌悬液1mL混匀，过滤。倒入胰酪大豆胨琼脂培养基35℃培养，同时按照相同的方法测试所加入试验菌的菌数，计算回收率。 244结果回收率计算公式：各菌株回收率={[（试验组菌数—供试液对照组菌数）]}÷菌液组菌数×100%。
由表1可知，常规法检查时，金葡、铜绿和枯草的试验回收率很低，达不到药典要求。由表1、表2可知，枯草芽孢杆菌对该品种的药品较为敏感，因此过滤加冲洗法只采用了枯草芽孢杆菌进行验证。结果详见表1、表2、表3。
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26控制菌大肠埃希菌验证
261试验组方法①取1∶[KG-3/5]10供试液10mL与每1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌同时加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。②取1∶10供试液10mL与每1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌混匀，薄膜过滤，将膜取下加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
262样品组方法取1∶10供试液10mL加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
263阳性对照方法将1mL含菌量不大于100 cfu大肠埃希菌加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
264阴性对照取稀释液10mL加入于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，按《中国药典》2015年版四部通则1106微生物限度检查法中控制菌检查：大肠埃希菌检查方法进行检查。
265结果大肠埃希菌验证结果详见表5。
3讨论
产品按《中国药典》（2015年版）[2]四部通则1105、1106微生物限度检查法进行微生物限度方法适用性检查，结果表明可用薄膜过滤，用200mL pH70的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗的方法检查本品需氧菌总数，用常规培养法检查本品霉菌和酵母菌总数，控制菌大肠埃希菌的检查用直接薄膜过滤法可行。
埃索美拉唑钠为抑制胃酸过多的一款首选药物，关于它的微生物限度方法学研究还没有见到相关的报到，此次研究表明其具有一定的抑菌作用，与刘志武等[3]关于注射用埃索美拉唑钠的研究结果相符。另外，在对其进行微生物检测时要用一定的方法去除其抑菌效力。研究为埃索美拉唑钠的微生物检验方法的确立提供了实验室检测依据。
参考文献
[1]李洁.埃索美拉唑与其他类质子泵抑制剂抑酸效果比较研究[J].食品与药品， 2012， 14（7）： 281-282.
[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）[S].北京： 中国医药科技出版社，2015：1105-1106.
[3]劉志武，武会芝，王霞，等. 注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法学的研究[J].中国药业指南，2014，12（22）：10-11.
（收稿日期：2017-04-01编辑：陶希睿）