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（武警四川总队医院 614000）
【摘要】方法：本研究通过MTT法观察七叶亭对体外培养关节软骨细胞增殖的影响。设立A组：阴性对照组（空白对照组）,B组：阳性对照组（40ug/ml）,C组：阳性对照组（80ug/ml）。结果：40ug/ml组，80ug/ml组从48小时后测得的OD值比空白对照组的OD值均高，且差异有显著性（P<0.05）；其中以80ug/ml组的对关节软骨细胞增殖最为显著，尤其在第4d、第8d时尤为明显，OD值分别比空白对照组高26.38%和22.53%。结论：本实验结果显示七叶亭能促进软骨细胞的增殖，以80ug/ml组最为明显。
【关键词】七叶亭;关节软骨; 细胞增殖
【中图分类号】R216.89【文献标识码】B【文章编号】1005-0515（2011）09-0258-02
1 材料和方法
1.1 实验材料：（1）实验动物：三周龄新西兰大耳白幼兔，雌性，三只，体重为180士10g。（2）实验药物：含七叶亭细胞培养液，浓度分别为40ug/ml，80ug/ml；甲苯胺蓝作为染色观察剂。
1.2 实验方法：取三周龄雌性健康新西兰幼兔三只，空气注射致死，75%乙醇中浸泡三分钟消毒,无菌条件下切取股骨头及股骨骼部关节面软骨,软骨细胞的分离参考王跃l的方法。软骨细胞融合约90%左右时开始传代，软骨细胞培养采用消化法。将分离培养的软骨细胞随机分为三组，分别放入不同浓度的七叶亭细胞培养液中：A组：阴性对照组（空白对照组）；B组：阳性对照组（40ug/ml）；C组：阳性对照组（80ug/ml）。
用MTT法测定软骨细胞增殖，每日同时间在上述细胞培养板中加入5mg/m1的MTT15ul，于37℃饱和湿度培养箱内继续培养4h，弃去培养液，加入DMSO150ul充分混匀后，用酶标仪在57Onm波长处读取OD值。连续测量8天。软骨细胞培养一周后，吸弃培养板内的培养液，将细胞玻片置于甲苯胺蓝染色液中染色5分钟，流水冲洗1分钟后，用蒸馏水冲洗1分钟，依次置于95%酒精（2次）及无水酒精中梯度脱水，每次3分钟，二甲苯透明后封片干燥，光学显微镜下观察。
1.3 统计学分析:全部计量数据资料均以均数士标准差（x士s）表示。采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理。检验水平0.05，P<0.05为差异显著，<0.01为差异非常显著。
2 实验结果
2.1 各组软骨细胞增殖的情况
表1各组软骨细胞增殖的情况（x士s）
表1结果显示：各组24小时内作用无明显差异（P＞0.05）；40ug/ml组、80ug/ml组从48小时后测得的OD值比空白对照组的OD值均高，且差异有统计学意义（P<0.05）；其中以80ug/ml组的对关节软骨细胞增殖最为显著，尤其在第4d、第8d时尤为明显，OD值分别比空白对照组高26.38%和22.53%。40ug/ml组与80ug/ml组比较，测得OD值80ug/ml均比40ug/m组高，但是两者间比较无统计学差异（P＞0.05）。
甲苯胺蓝染色，细胞培养一周后：细胞胞浆中有不同程度的紫红色颗粒，为体外培养软骨细胞分泌蛋白多糖。结果见图。
3 讨论
七叶亭作为天然药物秦皮的有效活性成分有着重要的药理作用。秦皮经常出现在抗骨关节炎的中药方剂中，但其具体机制尚不十分清楚。秦皮的主要有效成分是秦皮甲素（七叶灵）及七叶亭（也称秦皮乙素，秦皮素，七叶内脂，6、7一二羟基香豆素等）2，。
七叶亭在其它方面报导较多，Takao Kaneko等3报导了七叶亭具有正邻苯二酚结构，可作抗氧化剂抑制过氧化氢诱导的细胞毒性，说明了七叶亭可用于对抗氧自由基对人体的损害。研究表明七叶亭抑制Ras介导的细胞增殖，shoiw一lin等4认为七叶亭作为脂加氧酶抑制剂，通过脂加氧酶独立路径抑制血管平滑肌增殖。在其对骨关节炎方面的报导较少，特别是在国内，这方面的研究更少。七叶亭能抑制蛋白多糖和胶原的吸收，使MMP-l，MMP-3，MMP-13mRNA的表达减少，明显降低胶原溶解活性，保护关节软骨，但TIMP-1水平无变化5。为此，本实验通过观察七叶亭（即秦皮乙素，秦皮的有效活性成分）对体外培养软骨细胞增殖及活性的影响，探讨七叶亭对骨关节炎的修复作用。关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞能合成、分泌胶原和蛋白多糖，因此软骨细胞的代谢活动对关节软骨的代谢具有重要意义。患有骨性关节炎（OA）时软骨细胞数量减少，合成基质胶原和蛋白多糖的能力下降，无法产生足够的新生软骨进行组织修复，导致进行性软骨退变。软骨细胞数量的改变与骨性关节炎软骨进行性退变可能具有一定的相关性。本研究通过MTT法观察了七叶亭对体外培养关节软骨细胞增殖的影响,MTT是一种检测细胞存活与生长的方法。活细胞内线粒体能量代谢过程中产生唬拍脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色甲攒结晶（Formazan）沉积在细胞内和细胞周围，用二甲基亚枫（DMSO）溶解结晶，在570nm波长上比色，在一定范围内OD值与细胞增殖呈线性关系。本实验结果显示七叶亭能促进软骨细胞的增殖，以80ug/ml组最为明显。
参考文献
［1］ 王跃，杨志明，解慧琪等.人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特征［J］.中华实验外科杂志，2000，17（4）：319.
［2］ 王泽民，康葵，冯梅主编.当代结构药物全集［M］.北京:学苑出版社，1995：339
［3］ Takao Kaneko,Naomichi Baba. et al.Gerontology,1998,44：21
［4］ Shiow-Lin Pan，Ying -Wen Hunag，Jih-Hwa Guh et al. Esculetin inhibitis Ras-mediateed cellProliferation and attenuates vascular rstenosis following Angioplasty in rats［J］. BiochemicalPharmacology，2003,65:1897-1905
［5］ S Elliott,A D Rowan,O S Carrere et al. Esculetin inhibits cartilage resorpation induced by interleutin-1 alpha in combination with oncostation ［M］. Ann RheumDis,2001,60:158-165
【摘要】方法：本研究通过MTT法观察七叶亭对体外培养关节软骨细胞增殖的影响。设立A组：阴性对照组（空白对照组）,B组：阳性对照组（40ug/ml）,C组：阳性对照组（80ug/ml）。结果：40ug/ml组，80ug/ml组从48小时后测得的OD值比空白对照组的OD值均高，且差异有显著性（P<0.05）；其中以80ug/ml组的对关节软骨细胞增殖最为显著，尤其在第4d、第8d时尤为明显，OD值分别比空白对照组高26.38%和22.53%。结论：本实验结果显示七叶亭能促进软骨细胞的增殖，以80ug/ml组最为明显。
【关键词】七叶亭;关节软骨; 细胞增殖
【中图分类号】R216.89【文献标识码】B【文章编号】1005-0515（2011）09-0258-02
1 材料和方法
1.1 实验材料：（1）实验动物：三周龄新西兰大耳白幼兔，雌性，三只，体重为180士10g。（2）实验药物：含七叶亭细胞培养液，浓度分别为40ug/ml，80ug/ml；甲苯胺蓝作为染色观察剂。
1.2 实验方法：取三周龄雌性健康新西兰幼兔三只，空气注射致死，75%乙醇中浸泡三分钟消毒,无菌条件下切取股骨头及股骨骼部关节面软骨,软骨细胞的分离参考王跃l的方法。软骨细胞融合约90%左右时开始传代，软骨细胞培养采用消化法。将分离培养的软骨细胞随机分为三组，分别放入不同浓度的七叶亭细胞培养液中：A组：阴性对照组（空白对照组）；B组：阳性对照组（40ug/ml）；C组：阳性对照组（80ug/ml）。
用MTT法测定软骨细胞增殖，每日同时间在上述细胞培养板中加入5mg/m1的MTT15ul，于37℃饱和湿度培养箱内继续培养4h，弃去培养液，加入DMSO150ul充分混匀后，用酶标仪在57Onm波长处读取OD值。连续测量8天。软骨细胞培养一周后，吸弃培养板内的培养液，将细胞玻片置于甲苯胺蓝染色液中染色5分钟，流水冲洗1分钟后，用蒸馏水冲洗1分钟，依次置于95%酒精（2次）及无水酒精中梯度脱水，每次3分钟，二甲苯透明后封片干燥，光学显微镜下观察。
1.3 统计学分析:全部计量数据资料均以均数士标准差（x士s）表示。采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理。检验水平0.05，P<0.05为差异显著，<0.01为差异非常显著。
2 实验结果
2.1 各组软骨细胞增殖的情况
表1各组软骨细胞增殖的情况（x士s）
表1结果显示：各组24小时内作用无明显差异（P＞0.05）；40ug/ml组、80ug/ml组从48小时后测得的OD值比空白对照组的OD值均高，且差异有统计学意义（P<0.05）；其中以80ug/ml组的对关节软骨细胞增殖最为显著，尤其在第4d、第8d时尤为明显，OD值分别比空白对照组高26.38%和22.53%。40ug/ml组与80ug/ml组比较，测得OD值80ug/ml均比40ug/m组高，但是两者间比较无统计学差异（P＞0.05）。
甲苯胺蓝染色，细胞培养一周后：细胞胞浆中有不同程度的紫红色颗粒，为体外培养软骨细胞分泌蛋白多糖。结果见图。
3 讨论
七叶亭作为天然药物秦皮的有效活性成分有着重要的药理作用。秦皮经常出现在抗骨关节炎的中药方剂中，但其具体机制尚不十分清楚。秦皮的主要有效成分是秦皮甲素（七叶灵）及七叶亭（也称秦皮乙素，秦皮素，七叶内脂，6、7一二羟基香豆素等）2，。
七叶亭在其它方面报导较多，Takao Kaneko等3报导了七叶亭具有正邻苯二酚结构，可作抗氧化剂抑制过氧化氢诱导的细胞毒性，说明了七叶亭可用于对抗氧自由基对人体的损害。研究表明七叶亭抑制Ras介导的细胞增殖，shoiw一lin等4认为七叶亭作为脂加氧酶抑制剂，通过脂加氧酶独立路径抑制血管平滑肌增殖。在其对骨关节炎方面的报导较少，特别是在国内，这方面的研究更少。七叶亭能抑制蛋白多糖和胶原的吸收，使MMP-l，MMP-3，MMP-13mRNA的表达减少，明显降低胶原溶解活性，保护关节软骨，但TIMP-1水平无变化5。为此，本实验通过观察七叶亭（即秦皮乙素，秦皮的有效活性成分）对体外培养软骨细胞增殖及活性的影响，探讨七叶亭对骨关节炎的修复作用。关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成，软骨细胞能合成、分泌胶原和蛋白多糖，因此软骨细胞的代谢活动对关节软骨的代谢具有重要意义。患有骨性关节炎（OA）时软骨细胞数量减少，合成基质胶原和蛋白多糖的能力下降，无法产生足够的新生软骨进行组织修复，导致进行性软骨退变。软骨细胞数量的改变与骨性关节炎软骨进行性退变可能具有一定的相关性。本研究通过MTT法观察了七叶亭对体外培养关节软骨细胞增殖的影响,MTT是一种检测细胞存活与生长的方法。活细胞内线粒体能量代谢过程中产生唬拍脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色甲攒结晶（Formazan）沉积在细胞内和细胞周围，用二甲基亚枫（DMSO）溶解结晶，在570nm波长上比色，在一定范围内OD值与细胞增殖呈线性关系。本实验结果显示七叶亭能促进软骨细胞的增殖，以80ug/ml组最为明显。
参考文献
［1］ 王跃，杨志明，解慧琪等.人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特征［J］.中华实验外科杂志，2000，17（4）：319.
［2］ 王泽民，康葵，冯梅主编.当代结构药物全集［M］.北京:学苑出版社，1995：339
［3］ Takao Kaneko,Naomichi Baba. et al.Gerontology,1998,44：21
［4］ Shiow-Lin Pan，Ying -Wen Hunag，Jih-Hwa Guh et al. Esculetin inhibitis Ras-mediateed cellProliferation and attenuates vascular rstenosis following Angioplasty in rats［J］. BiochemicalPharmacology，2003,65:1897-1905
［5］ S Elliott,A D Rowan,O S Carrere et al. Esculetin inhibits cartilage resorpation induced by interleutin-1 alpha in combination with oncostation ［M］. Ann RheumDis,2001,60:158-165