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摘要：【目的】評价柴桂感寒口服液的毒性作用并初步确定其安全范围，为柴桂感寒口服液的兽医临床用药提供参考依据。【方法】选取健康的昆明系小鼠（18.00～22.00 g/只），按1.875、3.750、7.500、15.000和30.000 g/kg的给药剂量设5个处理组，于24 h内分2～3次灌胃给药进行急性毒性试验;另取20只昆明系小鼠，雌雄各半，按60.000 g/kg的剂量灌胃给药进行最大耐受量试验。长期毒性试验则选取健康清洁级SD大鼠80只，随机分为高剂量组（20.000 g/kg）、中剂量组（10.000 g/kg）、低剂量组（5.000 g/kg）和空白对照组（纯化水），每组20只（雌雄各半），给药周期30 d，于停药后第1 d（试验第31 d）和停药后1周（试验第38 d）分别进行眼球采血，用于血常规指标和血清生化指标检测，同时剖检并采集大鼠实质性脏器计算脏器指数及制作石蜡组织切片。【结果】急性毒性试验小鼠灌胃给药后30 min内嗜睡，精神萎靡，但40 min后其生理状态恢复正常，无中毒症状和死亡现象，因而无法计算出半数致死量（LD50）。在最大耐受量试验中，各给药剂量组小鼠也未出现死亡情况，剖检发现其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胃肠、睾丸（♂）、子宫（♀）和卵巢（♀）等脏器均无任何肉眼可见的特征性病理变化，即小鼠对柴桂感寒口服液的最大耐受量大于60.000 g/kg。长期服用柴桂感寒口服液对大鼠的采食量和体重均无不利影响，不会导致大鼠实质性脏器损伤或发生异常变化，对其血常规指标和血清生化指标也无明显影响;石蜡组织切片观察发现各给药剂量组大鼠肝脏、脾脏和肾脏的组织形态结构与空白对照组一致，均未出现异常病理变化。【结论】柴桂感寒口服液无急性毒性作用，长期连续服用也不会产生毒副作用，兽医临床用药安全性高，可用于治疗风寒感冒等病证。
关键词： 柴桂感寒口服液;急性毒性;最大耐受量;长期毒性
中图分类号： S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2327-08
Acute toxicity and long-term toxicity test of
Chaigui cold oral liquid
XIAO Rui， SHI Jun， XIE Xiao-dong， WEI Xiu-ying， WEI Ying-yi*， HU Ting-jun*
（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530004， China）
Abstract：【Objective】The aim of the present study was to evaluate the toxic effects of Chaigui cold oral liquid and to determine its safety range， and provide reference for veterinary clinical use of Chaigui cold oral liquid. 【Method】Twenty healthy Kunming mice（18.00-22.00 g/mouse） were selected for five dose groups in acute toxicity test， and were administered for twice to three times at a dose of 1.875，3.750，7.500，15.000 and 30.000 g/kg in 24 h by intragastric administration. Another 20 Kunming mice in half female and half male were fed with 60.000 g/kg by intragastric administration for the maximum tolerance limit test. The long-term toxicity test selected 80 SD mice of healthy clean grade， randomly divided them into high dose（20.000 g/kg）， middle dose（10.000 g/kg）， low dose（5.000 g/kg） and blank control（purified water） groups， each group was with 20 mice（half males and half females）. The drug administration period was 30 d. On the 1st day after the end of the administration（the 31th day of the test） and one week after the withdrawal（the 38th day of the test）， blood was collected from the eye for blood routine index test and serum biochemical indicators test. The mice organs were dissected and collected， the organ index was calculated and the paraffin tissue sections were made. 【Result】In acute toxicity test， the mice were lethargic and listless within 30 min after intragastric administration， but all recovered after 40 min without symptoms of poisoning and death. According to the toxicological evaluation criteria， the median lethal dose（LD50） could not be measured. In the maximum tolerance limit test， no death occurred in the mice in each dose group. The heart， liver， spleen， lung， kidney， thymus， intestines and stomach， testis（♂）， uterus（♀） and oarium（♀） had no visible pathological changes，which indicated that the maximum tolerance of mice to Chaigui cold oral liquid was greater than 60.000 g/kg. Long-term use of Chaigui cold oral liquid had no adverse effects on the feed intake and body weight of mice， and did not cause abnormal organ damage or abnormal changes in mice， and had no great effect on blood routine indicators and serum biochemical indicators. The histomorphological structure of the liver， spleen and kidney of themice in each dose group was consistent with that of the blank control group according to paraffin tissue sections， and no abnormal pathological changes were observed. 【Conclusion】Chaigui cold oral liquid has no acute toxicity and long-term continuous use of the drug has no sub-chronic toxicity. Its veterinary clinical medications are highly safe and can be widely applied to treat diseases such as cold. Key words： Chaigui cold oral liquid; acute toxicity; maximum tolerance dose; long-term toxicity
0 引言
【研究意义】鸡风寒感冒通常是因气候突变而引起，发病鸡群主要表现为流涕、咳嗽、呼吸困难或精神萎靡（吴永银等，2014），尤其在雏鸡的病期短且死亡率高，给家禽养殖业带来巨大损失。随着抗生素的禁用和生物制剂的发展，使得中兽药已成为治疗禽病的首选药物，但在中兽药研究领域至今未见关于柴桂制剂治疗家禽风寒感冒的报道，因此研究及明确柴桂感寒口服液的药理毒理学特性，对于满足家禽临床用药需求及促进家禽产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】柴桂感寒口服液组方源自张仲景的《伤寒论》柴胡桂枝干姜汤，由柴胡、桂枝、黄芩、干姜、天花粉、牡蛎和炙甘草等七味中药组成，按照现代药理学的协同药效作用，其具有疏肝胆郁滞、温通扶阳和化痰开结等功效（畅洪昇和张桂珍，2001）。目前，柴桂方剂及其制剂的临床应用已有较多报道。郭玉成等（2008）通过建立大鼠的酵母菌致热模型，证实柴桂制剂能在给药3 h后显著降低致热大鼠体温。陶方泽（2009）通过对柴胡桂枝干姜汤进行类方考证和药效述评，结果表明柴胡桂枝干姜汤主治的疾病可达23种，尤其是祛邪补虚作用明显。温小兰等（2013）研究发现，柴桂退热颗粒和利巴韦林联用能有效抑制小儿急性上呼吸道感染疾病，其治愈率达68.42%。谢胜等（2013）研究表明，柴胡桂枝干姜汤联合背俞指针疗法治疗脾虚型失眠效果显著，其治愈率高达95.6%。王勇和刘晓锋（2014）通过（小儿）柴桂退热糖浆的药效学试验，发现10倍稀釋剂量柴桂退热糖浆即具有体外抗甲型流感病毒的作用，灌服剂量为6.60 g/kg时能有效降低发热大鼠体温。王芳等（2014）研究证实，2.00 g/kg剂量的柴桂安神胶囊即能有效延长大鼠的睡眠时间，提高入睡率。付思为和徐强（2018）将柴胡桂枝干姜汤应用于临床慢性心力衰竭治疗，发现该方剂疗效确切，能有效缓解病症。【本研究切入点】柴桂感寒口服液是本课题组针对鸡风寒感冒研制而成，对自然发病雏鸡用药3～5 d后其流涕、发热等临床症状明显减轻，精神状态恢复，给药11 d后病鸡恢复正常体征，药效明显，但针对柴桂感寒口服液的毒理学研究目前尚无文献报道。【拟解决的关键问题】开展柴桂感寒口服液的急性毒性和长期毒性试验，评价药物的毒性作用并初步确定其安全范围，为柴桂感寒口服液的兽医临床用药提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
柴桂感寒口服液（100.00 mL/瓶）由河南牧翔动物药业有限公司生产，批号20170301，规格1.44 g/mL;昆明系小鼠（18.00～22.00 g/只）和SD大鼠（90.00～120.00 g/只）均购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各半。主要仪器设备：AB104-L分析天平（瑞士梅特勒）、DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴箱、Aida TD-5A台式低速离心机、尼康YS100生物显微镜、日本希森美康XT-2000i血球分析仪、全自动生化分析仪、徕卡组织切片机和明美病理系统等。
1. 2 急性毒性试验
1. 2. 1 预试验 取20只健康小鼠随机分成5组，每组4只，雌雄各半。按不同给药浓度设A（1.875 g/kg）、B（3.750 g/kg）、C（7.500 g/kg）、D（15.000 g/kg）、E（30.000 g/kg）5个剂量组，换算剂量组给药量分别为1.30、2.60、5.21、10.42和20.83 mL/kg，给药前禁食12 h，不限饮水;于试验开始当天（24 h内）分2～3次进行灌胃给药，连续观察7 d，详细记录小鼠的增重、饮食、饮水变化及是否有异常行为表现。观察期结束后将全部小鼠颈椎脱臼处死，剖检观察小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸（♂）、子宫（♀）和卵巢（♀）等器官有无异常变化。如预试验中出现小鼠死亡，记录死亡数并找出致死剂量，随后进行正式试验。
1. 2. 2 正式试验 由于预试验中受试动物死亡率为0，故将每组试验动物数量增至10只，并设1次重复试验。剂量分组设计及试验方法与预试验同，观察指标与预试验保持一致。
1. 3 最大耐受试验
随机选取小鼠20只（给药体重均按20.00 g/只计），按60.000 g/kg的剂量进行灌胃给药。给药后24 h内每隔1 h观察小鼠生理状态1次，记录是否有中毒反应或出现异常行为。给药后连续观察7 d，保持饲养条件不变，并记录小鼠的饮食、精神状态、自主活动和粪便情况等。观察期结束后将全部试验小鼠颈椎脱臼处死，剖检观察小鼠心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器有无异常变化。
1. 4 长期毒性试验
选取健康清洁级SD大鼠80只，随机分为高剂量组（20.000 g/kg）、中剂量组（10.000 g/kg）、低剂量组（5.000 g/kg）和空白对照组（纯化水），每组20只，雌雄各半，分笼饲养;药物剂量设计参考急性毒性试验和最大耐受试验结果。根据《兽药30天和90天喂养试验指导原则》，各给药剂量组连续给药30 d。通过饮水方式给药，每组大鼠每日饮水量均为200.00 mL。试验期间每天观察大鼠的一般健康状况，同时记录饮水投入量和饮水剩余量，按周时间段测量记录大鼠体重、投入饲料量和剩余饲料量，并计算平均增重、增重率、饲料利用率。
增重（g）=试验后体重（g）-试验前体重（g）
增重率（%）=增重（g）/试验前体重（g）×100
饲料利用率（%）=增重（g）/饲料消耗量（g）×100
于停药后第1 d（试验第31 d）及停药后1周（试验第38 d），禁食12 h，不限饮水，每次每组随机选取10只大鼠，经眼球采血进行血液学和血液生化学检查;采血后颈椎脱臼处死，进行系统剖检和病理学检查并记录观察结果，采集心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器称重，计算各脏器指数。脏器指数=脏器重（mg）/体重（g）。称重后采用10%福尔马林固定，制作病理组织切片进行病理学检查。 1. 5 统计分析
试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 急性毒性试验结果
预试验小鼠死亡率为0，24 h内也未出现中毒现象。在正式试验中，各剂量组小鼠在给药后30 min内嗜睡，精神萎靡，但40 min后其生理状态恢复正常，24 h内未出现中毒症状，行为活动正常、采食无异常、粪便正常、体重正常增长，与预试验结果一致。剖检小鼠观察发现，其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、肠胃等主要脏器均无异常变化。此外，以不同剂量柴桂感寒口服液灌胃给药后，小鼠体重仍呈增长趋势（表1），各剂量组小鼠平均增重5.46～7.80 g/只，增重率23.46%～34.00%，组间差异均不显著（P>0.05，下同）。依据中药急性毒性剂量分级标准，可判定柴桂感寒口服液对试验小鼠无毒。由于试验过程中未见小鼠死亡， 无法计算柴桂感寒口服液的半数致死量（LD50），而需进行最大耐受量试验以检验其安全性。
2. 2 最大耐受量试验结果
在最大耐受量试验期间，各给药剂量组小鼠也未出现死亡情况。临床观察发现，灌胃给药后30 min内小鼠精神萎靡，呼吸缓慢，但30 min后其精神和生理状态逐渐恢复，饮饲正常;24 h内小鼠未出现中毒症状。连续观察7 d，均无中毒症状和死亡现象出现，所有小鼠的呼吸、可视黏膜和被毛等体征均无异常，饮饲、排便等生理行为正常;给药后第8 d剖检观察，发现小鼠的心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器均无任何肉眼可见的特征性病理变化。根据药物毒理学评价标准判定，当药物LD50>5 g/kg时，该药物属于实际无毒性物质。本研究中柴桂感寒口服液最大耐受量试验的口服剂量达60.000 g/kg，小鼠仍健康存活，表明柴桂感寒口服液的安全性很高。
2. 3 長期毒性试验结果
2. 3. 1 临床表现 试验期间，大鼠生理活动无异常，粪便正常，饮饲情况与空白对照组一致。由图1可看出，试验第1～4周各处理组大鼠的采食量呈稳步上升趋势，至试验第4周时采食量最大。由图2可看出，各处理组大鼠体重均随日龄的增加而逐渐增加，且各药物剂量组与空白对照组间无显著差异。说明长期服用柴桂感寒口服液对大鼠的采食量和体重均无不利影响。
2. 3. 2 脏器指数 剖检观察发现，各药物剂量组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器表面光泽，颜色均匀，质地紧密富有弹性，形态无异常，无明显的肉眼可见病变。停药后第1 d（试验第31 d），各药物剂量组大鼠的脏器指数与空白对照组间无显著差异，且均在正常生理范围内;停药后1周（试验第38 d），除高剂量组雄性大鼠的睾丸指数显著小于空白对照组（P<0.05，下同）外，其他脏器指数与空白对照组间也无显著差异（表3）。说明长期服用柴桂感寒口服液不会导致大鼠实质脏器损伤或发生异常变化。
2. 3. 3 血常规指标 停药后第1 d（试验第31 d），仅中剂量组雄性大鼠的白细胞数显著低于对照组，其他血常规指标与空白对照组间均无显著差异（表4）。停药后1周（试验第38 d），中剂量组雌性大鼠的白细胞和淋巴细胞数显著高于空白对照组，高、低剂量组雌性大鼠的单核细胞数显著低于空白对照组，但均在正常生理范围内（詹纯列等，2004）;各药物剂量组雄性大鼠的血常规指标与空白对照组相比均无显著差异。可见，长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血常规指标无明显影响。
2. 3. 4 血清生化指标 停药后第1 d（试验第31 d），各给药剂量组大鼠的血清生化指标与空白对照组间均无显著差异（表5）;停药后1周（试验第38 d），除低剂量组雄性大鼠的血糖显著低于空白对照组外，其他血清生化指标与空白对照组间也无显著差异。说明长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血清生化指标无明显影响。
2. 3. 5 脏器组织形态结构 取各处理组大鼠的主要脏器（肝脏、脾脏和肾脏），以10%福尔马林固定后制作石蜡组织切片，于光学显微镜观察，发现各给药剂量组大鼠的肝脏、脾脏和肾脏石蜡组织切片未见异常病理变化（图3）。在大鼠肝脏石蜡组织切片中，肝细胞排列紧密，肝小叶结构完整，无异常变化;脾脏组织切片中红髓区和白髓区界限清晰，小梁结构无异常;大鼠肾脏组织结构完整，肾小球体积形态无异常变化且肾小管上皮细胞排列规律。说明长期服用柴桂感寒口服液不会对大鼠主要脏器产生毒副作用而造成其组织形态结构损伤。
3 讨论
柴桂方剂具有发汗解表、清里退热等多重功效（沈存思等，2016），尤其对治疗中医中的外感内伤效果显著（张智华，2008）。柴胡桂枝干姜汤在临床上应用较广泛，通常作为治疗流感和上呼吸道疾病的特效药（林怀德，2012），对临床上腹泻、胃胀等肝胆、脾胃病证也有一定疗效（徐维浓和陈明，2015）。郭起岳等（2016）研究证实，柴桂颗粒制剂对大鼠无长期毒性作用，即大鼠各项血液指标及脏器指数等检查均未显示出药物毒性。本研究的急性毒性试验结果表明，即使柴桂感寒口服液的给药剂量高达20.83 mL/kg，也未造成试验小鼠出现中毒症状和死亡现象，且连续观察7 d发现小鼠的饮饲和增重均表现正常，剖检观察，小鼠的心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器均无异常变化;在最大耐受量试验中，柴桂感寒口服液的口服剂量达60.000 g/kg，小鼠仍健康存活，其呼吸、可视黏膜和被毛等体征均无异常，药后剖检观察发现小鼠的实质性脏器均无任何肉眼可见的特征性病理变化。可见，柴桂感寒口服液对小鼠无毒性作用，兽医临床用药安全性高。
长期毒性试验的目的是观察连续重复给予受试药物对动物产生的毒性反应，包括出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况，进而确定无毒反应剂量，为临床安全用药提供参考（刘静等，2018;赵留涛等，2018）。本研究的长期毒性试验结果表明，长期服用柴桂感寒口服液对大鼠的采食量和体重均无不利影响，于停药后第1 d（试验第31 d）和停药后1周（试验第38 d）分别采血和剖解观察，发现长期服用柴桂感寒口服液不会导致大鼠实质性脏器损伤或发生异常变化，对大鼠血常规指标和血清生化指标也无明显影响。停药后继续观察1周发现，各给药剂量组大鼠的摄食量与空白对照组相比无异常，大鼠体重呈稳步上升趋势，符合其正常生长规律，且高剂量组大鼠的增重率明显高于空白对照组，可能是柴桂感寒口服液中含有温中散寒的干姜等中药，具有调理脾胃和促进胃液分泌的功能。从长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血常规指标和血清生化指标均无明显影响可初步判断，受试物对大鼠的肝脏和肾脏无靶器官毒性作用;结合剖检及石蜡组织切片观察，确定各给药剂量组大鼠的肝脏、脾脏和肾脏均未出现异常病理变化，进一步证实柴桂感寒口服液无药物毒性或毒性极低，即兽医临床用药安全性高。 4 结论
柴桂感寒口服液无急性毒性作用，长期连续服用也不会产生毒副作用，兽医临床用药安全性高，可用于治疗风寒感冒等病证。
参考文献：
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XIAO Rui， SHI Jun， XIE Xiao-dong， WEI Xiu-ying， WEI Ying-yi*， HU Ting-jun*
（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530004， China）
Abstract：【Objective】The aim of the present study was to evaluate the toxic effects of Chaigui cold oral liquid and to determine its safety range， and provide reference for veterinary clinical use of Chaigui cold oral liquid. 【Method】Twenty healthy Kunming mice（18.00-22.00 g/mouse） were selected for five dose groups in acute toxicity test， and were administered for twice to three times at a dose of 1.875，3.750，7.500，15.000 and 30.000 g/kg in 24 h by intragastric administration. Another 20 Kunming mice in half female and half male were fed with 60.000 g/kg by intragastric administration for the maximum tolerance limit test. The long-term toxicity test selected 80 SD mice of healthy clean grade， randomly divided them into high dose（20.000 g/kg）， middle dose（10.000 g/kg）， low dose（5.000 g/kg） and blank control（purified water） groups， each group was with 20 mice（half males and half females）. The drug administration period was 30 d. On the 1st day after the end of the administration（the 31th day of the test） and one week after the withdrawal（the 38th day of the test）， blood was collected from the eye for blood routine index test and serum biochemical indicators test. The mice organs were dissected and collected， the organ index was calculated and the paraffin tissue sections were made. 【Result】In acute toxicity test， the mice were lethargic and listless within 30 min after intragastric administration， but all recovered after 40 min without symptoms of poisoning and death. According to the toxicological evaluation criteria， the median lethal dose（LD50） could not be measured. In the maximum tolerance limit test， no death occurred in the mice in each dose group. The heart， liver， spleen， lung， kidney， thymus， intestines and stomach， testis（♂）， uterus（♀） and oarium（♀） had no visible pathological changes，which indicated that the maximum tolerance of mice to Chaigui cold oral liquid was greater than 60.000 g/kg. Long-term use of Chaigui cold oral liquid had no adverse effects on the feed intake and body weight of mice， and did not cause abnormal organ damage or abnormal changes in mice， and had no great effect on blood routine indicators and serum biochemical indicators. The histomorphological structure of the liver， spleen and kidney of themice in each dose group was consistent with that of the blank control group according to paraffin tissue sections， and no abnormal pathological changes were observed. 【Conclusion】Chaigui cold oral liquid has no acute toxicity and long-term continuous use of the drug has no sub-chronic toxicity. Its veterinary clinical medications are highly safe and can be widely applied to treat diseases such as cold. Key words： Chaigui cold oral liquid; acute toxicity; maximum tolerance dose; long-term toxicity
0 引言
【研究意义】鸡风寒感冒通常是因气候突变而引起，发病鸡群主要表现为流涕、咳嗽、呼吸困难或精神萎靡（吴永银等，2014），尤其在雏鸡的病期短且死亡率高，给家禽养殖业带来巨大损失。随着抗生素的禁用和生物制剂的发展，使得中兽药已成为治疗禽病的首选药物，但在中兽药研究领域至今未见关于柴桂制剂治疗家禽风寒感冒的报道，因此研究及明确柴桂感寒口服液的药理毒理学特性，对于满足家禽临床用药需求及促进家禽产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】柴桂感寒口服液组方源自张仲景的《伤寒论》柴胡桂枝干姜汤，由柴胡、桂枝、黄芩、干姜、天花粉、牡蛎和炙甘草等七味中药组成，按照现代药理学的协同药效作用，其具有疏肝胆郁滞、温通扶阳和化痰开结等功效（畅洪昇和张桂珍，2001）。目前，柴桂方剂及其制剂的临床应用已有较多报道。郭玉成等（2008）通过建立大鼠的酵母菌致热模型，证实柴桂制剂能在给药3 h后显著降低致热大鼠体温。陶方泽（2009）通过对柴胡桂枝干姜汤进行类方考证和药效述评，结果表明柴胡桂枝干姜汤主治的疾病可达23种，尤其是祛邪补虚作用明显。温小兰等（2013）研究发现，柴桂退热颗粒和利巴韦林联用能有效抑制小儿急性上呼吸道感染疾病，其治愈率达68.42%。谢胜等（2013）研究表明，柴胡桂枝干姜汤联合背俞指针疗法治疗脾虚型失眠效果显著，其治愈率高达95.6%。王勇和刘晓锋（2014）通过（小儿）柴桂退热糖浆的药效学试验，发现10倍稀釋剂量柴桂退热糖浆即具有体外抗甲型流感病毒的作用，灌服剂量为6.60 g/kg时能有效降低发热大鼠体温。王芳等（2014）研究证实，2.00 g/kg剂量的柴桂安神胶囊即能有效延长大鼠的睡眠时间，提高入睡率。付思为和徐强（2018）将柴胡桂枝干姜汤应用于临床慢性心力衰竭治疗，发现该方剂疗效确切，能有效缓解病症。【本研究切入点】柴桂感寒口服液是本课题组针对鸡风寒感冒研制而成，对自然发病雏鸡用药3～5 d后其流涕、发热等临床症状明显减轻，精神状态恢复，给药11 d后病鸡恢复正常体征，药效明显，但针对柴桂感寒口服液的毒理学研究目前尚无文献报道。【拟解决的关键问题】开展柴桂感寒口服液的急性毒性和长期毒性试验，评价药物的毒性作用并初步确定其安全范围，为柴桂感寒口服液的兽医临床用药提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
柴桂感寒口服液（100.00 mL/瓶）由河南牧翔动物药业有限公司生产，批号20170301，规格1.44 g/mL;昆明系小鼠（18.00～22.00 g/只）和SD大鼠（90.00～120.00 g/只）均购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各半。主要仪器设备：AB104-L分析天平（瑞士梅特勒）、DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴箱、Aida TD-5A台式低速离心机、尼康YS100生物显微镜、日本希森美康XT-2000i血球分析仪、全自动生化分析仪、徕卡组织切片机和明美病理系统等。
1. 2 急性毒性试验
1. 2. 1 预试验 取20只健康小鼠随机分成5组，每组4只，雌雄各半。按不同给药浓度设A（1.875 g/kg）、B（3.750 g/kg）、C（7.500 g/kg）、D（15.000 g/kg）、E（30.000 g/kg）5个剂量组，换算剂量组给药量分别为1.30、2.60、5.21、10.42和20.83 mL/kg，给药前禁食12 h，不限饮水;于试验开始当天（24 h内）分2～3次进行灌胃给药，连续观察7 d，详细记录小鼠的增重、饮食、饮水变化及是否有异常行为表现。观察期结束后将全部小鼠颈椎脱臼处死，剖检观察小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、睾丸（♂）、子宫（♀）和卵巢（♀）等器官有无异常变化。如预试验中出现小鼠死亡，记录死亡数并找出致死剂量，随后进行正式试验。
1. 2. 2 正式试验 由于预试验中受试动物死亡率为0，故将每组试验动物数量增至10只，并设1次重复试验。剂量分组设计及试验方法与预试验同，观察指标与预试验保持一致。
1. 3 最大耐受试验
随机选取小鼠20只（给药体重均按20.00 g/只计），按60.000 g/kg的剂量进行灌胃给药。给药后24 h内每隔1 h观察小鼠生理状态1次，记录是否有中毒反应或出现异常行为。给药后连续观察7 d，保持饲养条件不变，并记录小鼠的饮食、精神状态、自主活动和粪便情况等。观察期结束后将全部试验小鼠颈椎脱臼处死，剖检观察小鼠心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器有无异常变化。
1. 4 长期毒性试验
选取健康清洁级SD大鼠80只，随机分为高剂量组（20.000 g/kg）、中剂量组（10.000 g/kg）、低剂量组（5.000 g/kg）和空白对照组（纯化水），每组20只，雌雄各半，分笼饲养;药物剂量设计参考急性毒性试验和最大耐受试验结果。根据《兽药30天和90天喂养试验指导原则》，各给药剂量组连续给药30 d。通过饮水方式给药，每组大鼠每日饮水量均为200.00 mL。试验期间每天观察大鼠的一般健康状况，同时记录饮水投入量和饮水剩余量，按周时间段测量记录大鼠体重、投入饲料量和剩余饲料量，并计算平均增重、增重率、饲料利用率。
增重（g）=试验后体重（g）-试验前体重（g）
增重率（%）=增重（g）/试验前体重（g）×100
饲料利用率（%）=增重（g）/饲料消耗量（g）×100
于停药后第1 d（试验第31 d）及停药后1周（试验第38 d），禁食12 h，不限饮水，每次每组随机选取10只大鼠，经眼球采血进行血液学和血液生化学检查;采血后颈椎脱臼处死，进行系统剖检和病理学检查并记录观察结果，采集心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器称重，计算各脏器指数。脏器指数=脏器重（mg）/体重（g）。称重后采用10%福尔马林固定，制作病理组织切片进行病理学检查。 1. 5 统计分析
试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 急性毒性试验结果
预试验小鼠死亡率为0，24 h内也未出现中毒现象。在正式试验中，各剂量组小鼠在给药后30 min内嗜睡，精神萎靡，但40 min后其生理状态恢复正常，24 h内未出现中毒症状，行为活动正常、采食无异常、粪便正常、体重正常增长，与预试验结果一致。剖检小鼠观察发现，其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、肠胃等主要脏器均无异常变化。此外，以不同剂量柴桂感寒口服液灌胃给药后，小鼠体重仍呈增长趋势（表1），各剂量组小鼠平均增重5.46～7.80 g/只，增重率23.46%～34.00%，组间差异均不显著（P>0.05，下同）。依据中药急性毒性剂量分级标准，可判定柴桂感寒口服液对试验小鼠无毒。由于试验过程中未见小鼠死亡， 无法计算柴桂感寒口服液的半数致死量（LD50），而需进行最大耐受量试验以检验其安全性。
2. 2 最大耐受量试验结果
在最大耐受量试验期间，各给药剂量组小鼠也未出现死亡情况。临床观察发现，灌胃给药后30 min内小鼠精神萎靡，呼吸缓慢，但30 min后其精神和生理状态逐渐恢复，饮饲正常;24 h内小鼠未出现中毒症状。连续观察7 d，均无中毒症状和死亡现象出现，所有小鼠的呼吸、可视黏膜和被毛等体征均无异常，饮饲、排便等生理行为正常;给药后第8 d剖检观察，发现小鼠的心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器均无任何肉眼可见的特征性病理变化。根据药物毒理学评价标准判定，当药物LD50>5 g/kg时，该药物属于实际无毒性物质。本研究中柴桂感寒口服液最大耐受量试验的口服剂量达60.000 g/kg，小鼠仍健康存活，表明柴桂感寒口服液的安全性很高。
2. 3 長期毒性试验结果
2. 3. 1 临床表现 试验期间，大鼠生理活动无异常，粪便正常，饮饲情况与空白对照组一致。由图1可看出，试验第1～4周各处理组大鼠的采食量呈稳步上升趋势，至试验第4周时采食量最大。由图2可看出，各处理组大鼠体重均随日龄的增加而逐渐增加，且各药物剂量组与空白对照组间无显著差异。说明长期服用柴桂感寒口服液对大鼠的采食量和体重均无不利影响。
2. 3. 2 脏器指数 剖检观察发现，各药物剂量组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器表面光泽，颜色均匀，质地紧密富有弹性，形态无异常，无明显的肉眼可见病变。停药后第1 d（试验第31 d），各药物剂量组大鼠的脏器指数与空白对照组间无显著差异，且均在正常生理范围内;停药后1周（试验第38 d），除高剂量组雄性大鼠的睾丸指数显著小于空白对照组（P<0.05，下同）外，其他脏器指数与空白对照组间也无显著差异（表3）。说明长期服用柴桂感寒口服液不会导致大鼠实质脏器损伤或发生异常变化。
2. 3. 3 血常规指标 停药后第1 d（试验第31 d），仅中剂量组雄性大鼠的白细胞数显著低于对照组，其他血常规指标与空白对照组间均无显著差异（表4）。停药后1周（试验第38 d），中剂量组雌性大鼠的白细胞和淋巴细胞数显著高于空白对照组，高、低剂量组雌性大鼠的单核细胞数显著低于空白对照组，但均在正常生理范围内（詹纯列等，2004）;各药物剂量组雄性大鼠的血常规指标与空白对照组相比均无显著差异。可见，长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血常规指标无明显影响。
2. 3. 4 血清生化指标 停药后第1 d（试验第31 d），各给药剂量组大鼠的血清生化指标与空白对照组间均无显著差异（表5）;停药后1周（试验第38 d），除低剂量组雄性大鼠的血糖显著低于空白对照组外，其他血清生化指标与空白对照组间也无显著差异。说明长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血清生化指标无明显影响。
2. 3. 5 脏器组织形态结构 取各处理组大鼠的主要脏器（肝脏、脾脏和肾脏），以10%福尔马林固定后制作石蜡组织切片，于光学显微镜观察，发现各给药剂量组大鼠的肝脏、脾脏和肾脏石蜡组织切片未见异常病理变化（图3）。在大鼠肝脏石蜡组织切片中，肝细胞排列紧密，肝小叶结构完整，无异常变化;脾脏组织切片中红髓区和白髓区界限清晰，小梁结构无异常;大鼠肾脏组织结构完整，肾小球体积形态无异常变化且肾小管上皮细胞排列规律。说明长期服用柴桂感寒口服液不会对大鼠主要脏器产生毒副作用而造成其组织形态结构损伤。
3 讨论
柴桂方剂具有发汗解表、清里退热等多重功效（沈存思等，2016），尤其对治疗中医中的外感内伤效果显著（张智华，2008）。柴胡桂枝干姜汤在临床上应用较广泛，通常作为治疗流感和上呼吸道疾病的特效药（林怀德，2012），对临床上腹泻、胃胀等肝胆、脾胃病证也有一定疗效（徐维浓和陈明，2015）。郭起岳等（2016）研究证实，柴桂颗粒制剂对大鼠无长期毒性作用，即大鼠各项血液指标及脏器指数等检查均未显示出药物毒性。本研究的急性毒性试验结果表明，即使柴桂感寒口服液的给药剂量高达20.83 mL/kg，也未造成试验小鼠出现中毒症状和死亡现象，且连续观察7 d发现小鼠的饮饲和增重均表现正常，剖检观察，小鼠的心脏、肝脏、脾脏等实质性脏器均无异常变化;在最大耐受量试验中，柴桂感寒口服液的口服剂量达60.000 g/kg，小鼠仍健康存活，其呼吸、可视黏膜和被毛等体征均无异常，药后剖检观察发现小鼠的实质性脏器均无任何肉眼可见的特征性病理变化。可见，柴桂感寒口服液对小鼠无毒性作用，兽医临床用药安全性高。
长期毒性试验的目的是观察连续重复给予受试药物对动物产生的毒性反应，包括出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况，进而确定无毒反应剂量，为临床安全用药提供参考（刘静等，2018;赵留涛等，2018）。本研究的长期毒性试验结果表明，长期服用柴桂感寒口服液对大鼠的采食量和体重均无不利影响，于停药后第1 d（试验第31 d）和停药后1周（试验第38 d）分别采血和剖解观察，发现长期服用柴桂感寒口服液不会导致大鼠实质性脏器损伤或发生异常变化，对大鼠血常规指标和血清生化指标也无明显影响。停药后继续观察1周发现，各给药剂量组大鼠的摄食量与空白对照组相比无异常，大鼠体重呈稳步上升趋势，符合其正常生长规律，且高剂量组大鼠的增重率明显高于空白对照组，可能是柴桂感寒口服液中含有温中散寒的干姜等中药，具有调理脾胃和促进胃液分泌的功能。从长期服用柴桂感寒口服液对大鼠血常规指标和血清生化指标均无明显影响可初步判断，受试物对大鼠的肝脏和肾脏无靶器官毒性作用;结合剖检及石蜡组织切片观察，确定各给药剂量组大鼠的肝脏、脾脏和肾脏均未出现异常病理变化，进一步证实柴桂感寒口服液无药物毒性或毒性极低，即兽医临床用药安全性高。 4 结论
柴桂感寒口服液无急性毒性作用，长期连续服用也不会产生毒副作用，兽医临床用药安全性高，可用于治疗风寒感冒等病证。
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