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摘要[目的]研究重鉻酸钾和3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻和斜生栅藻的毒性效应。[方法]以羊角月牙藻和斜生柵藻为试验绿藻，进行了重铬酸钾和3，5-二氯苯酚为参比物的72 h毒性试验。[结果]重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.02 mg/L，95%置信区间为0.98～1.06 mg/L；EryC50为2.48 mg/L，95%置信区间为2.25～2.74 mg/L。3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.12 mg/L，95%置信区间为1.08～1.16 mg/L；EryC50为2.41 mg/L，95%置信区间为2.22～2.62 mg/L。重铬酸钾对斜生栅藻的72 h EyC50为0.43 mg/L，95%置信区间为0.42～0.43 mg/L；EryC50为1.07 mg/L，95%置信区间为1.02～1.12 mg/L。添加不同初始藻浓度，初始量为0.5×104个/mL时，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.68 mg/L，95%置信区间为1.63～1.72 mg/L；EryC50为1.43 mg/L，95%置信区间为1.42～1.44 mg/L。初始量为1.0×104个/mL时，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.55 mg/L，95%置信区间为1.51～1.60 mg/L；EryC50为1.39 mg/L，95%置信区间为1.38～1.40 mg/L。[结论]重铬酸钾和3，5-二氯苯酚可以作为参比物来评价绿藻的敏感度。
关键词 羊角月牙藻；斜生栅藻；重铬酸钾；3，5-二氯苯酚
中图分类号 X835 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0058-03
Abstract[Objective] To study toxic effects of potassium bichromate and 3，5dichlorophenol on growth of Selenastrum capricornutum and Scenedesmus obliquus. [Method] Growth inhibition test of potassium bichromate and 3，5dichlorophenol was conducted with Selenastrum capricornutum and Scenedesmus obliquus over the 72hour test period. [Result] Based on the results， the 72hour EyC50 of Potassium bichromate to Selenastrum capricornutum was 1.02 mg/L and 95% confidence limit was 0.98-1.06 mg/L. The 72hour ErC50 was 2.48 mg/L and 95% confidence limit was 2.25-2.74 mg/L. The 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Selenastrum capricornutum was 1.12 mg/L and 95% confidence limit was 1.08-1.16 mg/L. The 72hour ErC50 was 2.41 mg/L and 95% confidence limit was 2.22-2.62 mg/L.The 72hour EyC50 of Potassium bichromate to Scenedesmus obliquus was 0.426 mg/L and 95% confidence limit was 0.418-0.434 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.07 mg/L and 95% confidence limit was 1.02-1.12 mg/L. For the initial biomass （0.5×104 ind/ml） in the test cultures， the 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Scenedesmus obliquus was 1.68 mg/L and 95% confidence limit was 1.63-1.72 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.43 mg/L and 95% confidence limit was 1.42-1.44 mg/L. For the initial biomass （1.0×104 ind/ml） in the test cultures， the 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Scenedesmus obliquus was 1.55 mg/L and 95% confidence limit was 1.51-1.60 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.39 mg/L and 95% confidence limit was 1.38-1.40 mg/L. [Conclusion] Potassium bichromate and 3，5dichlorophenol can be used as reference compound on evaluating sensitivity of green alga.
Key words Selenastrum capricornutum； Scenedesmus obliquus； Potassium bichromate； 3， 5dichlorophenol 在环境评价领域，传统的理化测试指标存在一些缺陷，因此，需要寻找合适的测试生物作为环境污染的评价指标。藻类个体小、繁殖快、比表面积大（仅次于细菌），对毒物敏感。在研究毒物对水生生态系统的影响时，人们都把藻类测试作为一项重要内容[1]，藻类有着独特的生物监测优点，与理化监测互补，可进一步提高预测生态系统反应的能力，藻类作为环境监测指示生物方面的研究已被各国学者所广泛关注[2]。
当前我国生产和销售的化学品已达30 000余种，各种化学品在生产和使用过程中必将进入环境，而水域往往是它们的最终归宿。我国是一个农业大国，大量使用农药，农药污染对水生生态系统有着严重影响[3]。目前在环境监测中一般采用理化监测和生物监测的方法。藻类是水生态系统的初级生产者，是水生食物链的基础，它具有生命力强、繁殖快等特点，近年来利用藻类检验污染物的毒性并研究具体的防治措施日益受到重视[4]。藻类作为水生态系统的初级生产者，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构功能。因而，成为监测评价水环境质量的重要指标[5-6]。目前，应用藻类监测环境废水、农药等方面急性毒性已有文献报道，但有关该方法的质控方法研究鲜见报道。笔者以重铬酸钾和3，5-二氯苯酚作为参比物，研究了羊角月牙藻和斜生栅藻的毒性效应，筛选出阳性参比毒物。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试药剂与仪器见表1、2。
1.2 测试绿藻品种
羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）和斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）购自中国科学院水生生物研究所，以OECD藻类培养基保存于4 ℃冰箱中备用。
1.3 培养方法
用OECD201藻类培养基在250 mL三角瓶中振荡培养，振荡频率为（100±20） r/min，持续光照，光照强度4 440～8 880 lx，温度（23±1） ℃。待大量繁殖后（72～96 h 转接1 次），取0.5～1.0 mL绿藻再次接入新鲜培养液中（100 mL）培养。反复3～5 次，镜检细胞生长正常后用作供试绿藻。试验周期为72 h。
1.4 试验方法
1.4.1 试验浓度设计。
重铬酸钾对羊角月牙藻试验的设计浓度为0.30、0.53、0.95、1.96、3.00 mg/L，3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻试验的设计浓度为0.50、0.80、1.20、1.90、3.00 mg/L。重铬酸钾对斜生栅藻试验的设计浓度为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mg/L，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻试验的设计浓度为0.50、0.78、1.22、1.92、3.00 mg/L。采用母液稀释法，分别配制100 mg/L重铬酸钾和3，5-二氯苯酚母液，依次吸取母液，稀释成相应试验液，定容至500 mL，分装成3个重复，每个重复100 mL试验液。设置空白对照组。试验接种量为1.0×104个/mL。
1.4.2 不同初始生物量对毒性效应的影响。
3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的毒性影响试验中，分别加入藻液为1.0×104和0.5×104个/mL，比较添加不同绿藻生物量对毒性效应的影响。设计浓度为0.50、0.78、1.22、1.92、3.00 mg/L。
1.5 测试指标
试验开始后24、48、72 h时，从每个瓶中取样，使用血球计数板在显微镜下计数，测定藻细胞的生长。
血球计数板型号：V=0.1 mm3，16×25大格。
藻细胞数（个/mL）=每小格的平均藻数×4 000 000×稀释倍数。
1.6 数据分析
1.6.1 生物量增长的抑制百分率。
2 结果与分析
2.1 重铬酸钾对羊角月牙藻的毒性效应
从图1可以看出，随着重铬酸钾浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.30 mg/L Iy在24、48和72 h，以生长量为基础抑制率分别达到1.7%、0.3%和2.6%，大于以生长率为基础的Ir的0.7%、0.1%和0.5%；最高浓度3.00 mg/L，48、72 h Iy分别达到94.6%、97.9%，明显大于Ir的66.8%和67.7%。经计算，重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.02 mg/L，95%置信区间为0.98～1.06 mg/L；重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h EryC50为2.48 mg/L，95%置信区间为2.25～2.74 mg/L。
2.2 3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的毒性效应
从图2可以看出，随着3，5-二氯苯酚浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.3 mg/L，24、48、72 h以Iy分别达到10.3%、13.6%、10.2%，Ir分别达到4.2%、3.6%、2.0%；最高浓度3.00 mg/L，24和48 h Iy抑制率均達到100%，72 h抑制率为99.0%；24 h Ir的抑制率均为100%，72 h抑制率为79.3%。经计算，3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.12 mg/L，95%置信区间为1.08～1.16 mg/L；3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的72 h EryC50为2.41 mg/L，95%置信区间为2.22～2.62 mg/L。
2.3 重铬酸钾对斜生栅藻的毒性效应
从图3可以看出，随着重铬酸钾浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.10 mg/L，24、48和72 h Iy分别为0、1.1%和1.0%，24、48和72 h Ir分别为0、0.3%和0.3%；最高浓度1.60 mg/L，24、48和72 h Iy抑制率分别达到100%、99.9%和97.7%；24、48和72 h Ir抑制率分别为100%、79.3%、70.2%。經计算，重铬酸钾对斜生栅藻的72 h EyC50为0.43 mg/L，95%置信区间为0.42～0.43 mg/L；重铬酸钾对斜生栅藻的72 h EryC50为1.07 mg/L，95%置信区间为1.02～1.12 mg/L。 2.4 添加不同初始生物量对毒性效应的影响
从图4可以看出，添加0.5×104个/mL初始绿藻生物量时，除最低浓度0.50 mg/L外，其余浓度24 h Iy 的生长抑制率均超过50%，1.22、1.92和3.00 mg/L生长抑制率均为100%，抑制效应不显著，48和72 h时抑制才出现明显的浓度效应。经计算，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.68 mg/L，95%置信区间为1.63～1.72 mg/L；3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EryC50为1.43 mg/L，95%置信区间为1.42～1.44 mg/L。
从图5可以看出，添加1.0×104个/mL初始生物量时，各阶段均出现抑制情况，随着浓度的升高抑制率增大。经计算，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.55 mg/L，95%置信区间为1.51～1.60 mg/L；3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EryC50为1.39 mg/L，95%置信区间为1.38～1.40 mg/L。
3 结论
该研究表明，斜生栅藻和羊角月牙藻以重铬酸钾和3，5-二氯苯酚的毒性范围72 h EryC50和EyC50均在中毒范围内，并且与添加量影响不大，因此，重铬酸钾和3，5-二氯苯酚可以作为参比物来评价绿藻的敏感度。
参考文献
[1] 蔡道基.农药环境毒理学研究[M].北京：中国环境科学出版社，1999：18.
[2] 卢雁，张顺意.藻类急性毒性实验阳性参比毒物的筛选[J].辽宁城乡环境科技，1999（2）：37-39.
[3] 宋志慧，刘冰.氧化乐果对小球藻的毒性研究[J].生态毒理学报，2014，9（3）：483-489.
[4] 党亚爱，王国栋，辛宝平，等.几种染料抑制斜生柵藻生长的毒性效应[J].西北植物学报.2003，23（2）：332-335.
[5] 李义刚，刘滨扬，彭颖，等.三氯生对羊角月牙藻生长及其抗氧化系统的影响[J].生态毒理学报，2013，8（3）：357-365.
[6] 高礼，石丽娟，袁涛.典型抗生素对羊角月牙藻的生長抑制及其联合毒性[J].环境与健康杂志，2013，30（6）：475-478.
关键词 羊角月牙藻；斜生栅藻；重铬酸钾；3，5-二氯苯酚
中图分类号 X835 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0058-03
Abstract[Objective] To study toxic effects of potassium bichromate and 3，5dichlorophenol on growth of Selenastrum capricornutum and Scenedesmus obliquus. [Method] Growth inhibition test of potassium bichromate and 3，5dichlorophenol was conducted with Selenastrum capricornutum and Scenedesmus obliquus over the 72hour test period. [Result] Based on the results， the 72hour EyC50 of Potassium bichromate to Selenastrum capricornutum was 1.02 mg/L and 95% confidence limit was 0.98-1.06 mg/L. The 72hour ErC50 was 2.48 mg/L and 95% confidence limit was 2.25-2.74 mg/L. The 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Selenastrum capricornutum was 1.12 mg/L and 95% confidence limit was 1.08-1.16 mg/L. The 72hour ErC50 was 2.41 mg/L and 95% confidence limit was 2.22-2.62 mg/L.The 72hour EyC50 of Potassium bichromate to Scenedesmus obliquus was 0.426 mg/L and 95% confidence limit was 0.418-0.434 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.07 mg/L and 95% confidence limit was 1.02-1.12 mg/L. For the initial biomass （0.5×104 ind/ml） in the test cultures， the 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Scenedesmus obliquus was 1.68 mg/L and 95% confidence limit was 1.63-1.72 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.43 mg/L and 95% confidence limit was 1.42-1.44 mg/L. For the initial biomass （1.0×104 ind/ml） in the test cultures， the 72hour EyC50 of 3， 5dichlorophenol to Scenedesmus obliquus was 1.55 mg/L and 95% confidence limit was 1.51-1.60 mg/L. The 72hour ErC50 was 1.39 mg/L and 95% confidence limit was 1.38-1.40 mg/L. [Conclusion] Potassium bichromate and 3，5dichlorophenol can be used as reference compound on evaluating sensitivity of green alga.
Key words Selenastrum capricornutum； Scenedesmus obliquus； Potassium bichromate； 3， 5dichlorophenol 在环境评价领域，传统的理化测试指标存在一些缺陷，因此，需要寻找合适的测试生物作为环境污染的评价指标。藻类个体小、繁殖快、比表面积大（仅次于细菌），对毒物敏感。在研究毒物对水生生态系统的影响时，人们都把藻类测试作为一项重要内容[1]，藻类有着独特的生物监测优点，与理化监测互补，可进一步提高预测生态系统反应的能力，藻类作为环境监测指示生物方面的研究已被各国学者所广泛关注[2]。
当前我国生产和销售的化学品已达30 000余种，各种化学品在生产和使用过程中必将进入环境，而水域往往是它们的最终归宿。我国是一个农业大国，大量使用农药，农药污染对水生生态系统有着严重影响[3]。目前在环境监测中一般采用理化监测和生物监测的方法。藻类是水生态系统的初级生产者，是水生食物链的基础，它具有生命力强、繁殖快等特点，近年来利用藻类检验污染物的毒性并研究具体的防治措施日益受到重视[4]。藻类作为水生态系统的初级生产者，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构功能。因而，成为监测评价水环境质量的重要指标[5-6]。目前，应用藻类监测环境废水、农药等方面急性毒性已有文献报道，但有关该方法的质控方法研究鲜见报道。笔者以重铬酸钾和3，5-二氯苯酚作为参比物，研究了羊角月牙藻和斜生栅藻的毒性效应，筛选出阳性参比毒物。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试药剂与仪器见表1、2。
1.2 测试绿藻品种
羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）和斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）购自中国科学院水生生物研究所，以OECD藻类培养基保存于4 ℃冰箱中备用。
1.3 培养方法
用OECD201藻类培养基在250 mL三角瓶中振荡培养，振荡频率为（100±20） r/min，持续光照，光照强度4 440～8 880 lx，温度（23±1） ℃。待大量繁殖后（72～96 h 转接1 次），取0.5～1.0 mL绿藻再次接入新鲜培养液中（100 mL）培养。反复3～5 次，镜检细胞生长正常后用作供试绿藻。试验周期为72 h。
1.4 试验方法
1.4.1 试验浓度设计。
重铬酸钾对羊角月牙藻试验的设计浓度为0.30、0.53、0.95、1.96、3.00 mg/L，3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻试验的设计浓度为0.50、0.80、1.20、1.90、3.00 mg/L。重铬酸钾对斜生栅藻试验的设计浓度为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mg/L，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻试验的设计浓度为0.50、0.78、1.22、1.92、3.00 mg/L。采用母液稀释法，分别配制100 mg/L重铬酸钾和3，5-二氯苯酚母液，依次吸取母液，稀释成相应试验液，定容至500 mL，分装成3个重复，每个重复100 mL试验液。设置空白对照组。试验接种量为1.0×104个/mL。
1.4.2 不同初始生物量对毒性效应的影响。
3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的毒性影响试验中，分别加入藻液为1.0×104和0.5×104个/mL，比较添加不同绿藻生物量对毒性效应的影响。设计浓度为0.50、0.78、1.22、1.92、3.00 mg/L。
1.5 测试指标
试验开始后24、48、72 h时，从每个瓶中取样，使用血球计数板在显微镜下计数，测定藻细胞的生长。
血球计数板型号：V=0.1 mm3，16×25大格。
藻细胞数（个/mL）=每小格的平均藻数×4 000 000×稀释倍数。
1.6 数据分析
1.6.1 生物量增长的抑制百分率。
2 结果与分析
2.1 重铬酸钾对羊角月牙藻的毒性效应
从图1可以看出，随着重铬酸钾浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.30 mg/L Iy在24、48和72 h，以生长量为基础抑制率分别达到1.7%、0.3%和2.6%，大于以生长率为基础的Ir的0.7%、0.1%和0.5%；最高浓度3.00 mg/L，48、72 h Iy分别达到94.6%、97.9%，明显大于Ir的66.8%和67.7%。经计算，重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.02 mg/L，95%置信区间为0.98～1.06 mg/L；重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h EryC50为2.48 mg/L，95%置信区间为2.25～2.74 mg/L。
2.2 3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的毒性效应
从图2可以看出，随着3，5-二氯苯酚浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.3 mg/L，24、48、72 h以Iy分别达到10.3%、13.6%、10.2%，Ir分别达到4.2%、3.6%、2.0%；最高浓度3.00 mg/L，24和48 h Iy抑制率均達到100%，72 h抑制率为99.0%；24 h Ir的抑制率均为100%，72 h抑制率为79.3%。经计算，3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的72 h EyC50为1.12 mg/L，95%置信区间为1.08～1.16 mg/L；3，5-二氯苯酚对羊角月牙藻的72 h EryC50为2.41 mg/L，95%置信区间为2.22～2.62 mg/L。
2.3 重铬酸钾对斜生栅藻的毒性效应
从图3可以看出，随着重铬酸钾浓度的升高，抑制率明显增大。最低浓度0.10 mg/L，24、48和72 h Iy分别为0、1.1%和1.0%，24、48和72 h Ir分别为0、0.3%和0.3%；最高浓度1.60 mg/L，24、48和72 h Iy抑制率分别达到100%、99.9%和97.7%；24、48和72 h Ir抑制率分别为100%、79.3%、70.2%。經计算，重铬酸钾对斜生栅藻的72 h EyC50为0.43 mg/L，95%置信区间为0.42～0.43 mg/L；重铬酸钾对斜生栅藻的72 h EryC50为1.07 mg/L，95%置信区间为1.02～1.12 mg/L。 2.4 添加不同初始生物量对毒性效应的影响
从图4可以看出，添加0.5×104个/mL初始绿藻生物量时，除最低浓度0.50 mg/L外，其余浓度24 h Iy 的生长抑制率均超过50%，1.22、1.92和3.00 mg/L生长抑制率均为100%，抑制效应不显著，48和72 h时抑制才出现明显的浓度效应。经计算，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.68 mg/L，95%置信区间为1.63～1.72 mg/L；3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EryC50为1.43 mg/L，95%置信区间为1.42～1.44 mg/L。
从图5可以看出，添加1.0×104个/mL初始生物量时，各阶段均出现抑制情况，随着浓度的升高抑制率增大。经计算，3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EyC50为1.55 mg/L，95%置信区间为1.51～1.60 mg/L；3，5-二氯苯酚对斜生栅藻的72 h EryC50为1.39 mg/L，95%置信区间为1.38～1.40 mg/L。
3 结论
该研究表明，斜生栅藻和羊角月牙藻以重铬酸钾和3，5-二氯苯酚的毒性范围72 h EryC50和EyC50均在中毒范围内，并且与添加量影响不大，因此，重铬酸钾和3，5-二氯苯酚可以作为参比物来评价绿藻的敏感度。
参考文献
[1] 蔡道基.农药环境毒理学研究[M].北京：中国环境科学出版社，1999：18.
[2] 卢雁，张顺意.藻类急性毒性实验阳性参比毒物的筛选[J].辽宁城乡环境科技，1999（2）：37-39.
[3] 宋志慧，刘冰.氧化乐果对小球藻的毒性研究[J].生态毒理学报，2014，9（3）：483-489.
[4] 党亚爱，王国栋，辛宝平，等.几种染料抑制斜生柵藻生长的毒性效应[J].西北植物学报.2003，23（2）：332-335.
[5] 李义刚，刘滨扬，彭颖，等.三氯生对羊角月牙藻生长及其抗氧化系统的影响[J].生态毒理学报，2013，8（3）：357-365.
[6] 高礼，石丽娟，袁涛.典型抗生素对羊角月牙藻的生長抑制及其联合毒性[J].环境与健康杂志，2013，30（6）：475-478.