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摘 要 2012年10月，在海南省文昌市的椰子苗圃中，发现了一种新的叶斑病。显微观察表明，病原菌分生孢子稍弯曲，浅褐色，纺锤状或梭状，具有5～9个假隔膜、分生孢子梗多单生，直立或稍弯曲，表明其为平脐蠕孢属（Bipolari. sp）。ITS序列分析表明其和4株狗尾草平脐蠕孢的序列同源性（HE792936.1，JX462256，GUO73108.1，FJ606786.1）的同源性为99%。生物学特性研究结果表明：该菌菌丝适宜生长温度为20～30 ℃，菌丝生长和孢子最适萌发温度分别是25 ℃和30 ℃；最适pH值为4～11；玉米粉培养基（CAM）及马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）最适合菌丝生长，最佳碳源为蔗糖，甘油不适合菌丝生长；最佳氮源为蛋白胨，其次是磷酸氢二铵；完全光照有利于菌丝生长。菌丝及分生孢子的致死温度和时间分别是56 ℃，15 min。
关键词 椰子；平脐蠕孢；生物学特性
中图分类号 S435. 61 文献标识码 A
Abstract In October 2012， a new leaf spot disease was observed on coconut seedlings in Wenchang， Hainan province. Based on microscopic observation， the conidiophores were slightly flexuous or straight， produced curved， spindle-shaped or fusiform， septate conidia with 5 to 9 pseuedo-septa. Thus， the pathogen belong to Bipolari. sp. Furthermore， the result of ITS sequence analysis revealed 99% sequence similarity with B. setariae. The results of biological characteristics showed that CAM and PDA medium were the best for the mycelial growth of pathogen. Temperature ranged from 20 to 30 ℃ were optimum for its mycelia growth， and conidia germinated best on 30 ℃. pH ranged from 4 to 11 was optimum for its mycelia growth. The mycelia grew best on media with sucrose as C source. Peptone nitrate and was the best nitrogen sources for mycelial growth and the（NH4）2HPO4 nitrate was the second. Continuous light was the best for mycelial growth. The lethal temperature was 56 ℃， 15 minutes for hypha growth and conidiospore.
Key words Cocos nucifera L.； Bipolaris.sp； Biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.023
椰子（Cocos nucifera L.）属于棕榈科椰子属，是热带地区主要的木本油料作物之一，综合利用经济效益高，故享有“宝树”之称， 具有极其重要的观赏价值[1]。在海南、广西、广东、云南、四川、福建及台湾等省（区）均有种植，其中主要集中在海南省，种植面积已达到约14万hm2[2]。随着海南国际旅游岛建设步伐的加快，椰子的需求量日益增加、供不应求，其经济价值也逐年提升，致使椰子种植面积不断扩大，但随之而来的椰子树的病害也日趋严重，制约了椰子产业化的发展。
2012年10月，笔者在海南省文昌市椰子研究所椰子种植苗圃发现了一种新的叶斑病，该病主要为害椰子叶，严重影响长势并降低观赏价值。该病主要危害2～6龄椰子幼苗，严重时病斑扩大至叶尖，整片叶子枯萎死亡。本实验开展该病害的病原菌鉴定和生物学特性研究，为进一步开展该病害的防治工作提供了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 椰子品种和平脐蠕孢叶斑病病样 病样来源：椰子平脐蠕孢叶斑病病样采自海南省文昌市椰子研究所；接种材料：椰子大观园椰子叶，椰子品种为海南本地高种。
1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），椰叶琼脂培养基（CLAM），椰子肉培养基（CMAM），查氏琼脂培养基（Czapek），理查德琼脂培养基（Richard），燕麦片琼脂培养基（OMAM）玉米培琼脂培养基（CAM），详细配方见参考牛晓庆等[3]文献。
1.1.3 供试试剂 Taq酶、dNTPs、胶回收试剂盒（Gel Extraction Mini Kit W5221）等购自天跟生化科技（北京）有限公司，引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGA
ACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA
TGC-3′）由上海生工生物工程股份有限公司（上海生工）合成；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离与致病性测定 按常规分离方法分离和纯化病原菌[4]。取在玉米培养基上培养15 d的病原菌，加10～15 mL无菌水，用无菌刀片刮取菌丝，2层滤纸过滤菌丝，将孢子浓度调为105（个/mL）。洗净的椰子叶片以叶脉为界，两边均用灭菌针头刺6～7个伤口，取100 uL孢子液涂抹一边，另一边涂等量无菌水为对照，3次重复。叶片放置于25 ℃培养箱。逐日观察发病情况。根据再分离菌株菌落特征以及分生孢子形状，与最初分离的菌株进行比较以确认分离物的致病性。 1.2.2 病原菌鉴定 （1）病原菌形态观察。打取生长7 d、大小6 mm×6 mm的病原菌菌丝块，置于铺有润湿滤纸的干净培养皿上，于25 ℃保湿培养，7 d后观察分生孢子梗的形态；病原菌在玉米培养基上培养14 d后，观察孢子形态并测量其大小，所用设备为倒置生物显微镜（Leica DMIL）及其配备的系统软件Leica Application Suite 3.80。
（2）ITS序列分析。采用尿素法提取菌丝基因组DNA[5]。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应混合液总体积为 25 μL：包括2 μL 10×PCR反应缓冲液，2.5 mmol/L的dNTPs 1.0 μL，引物各0.5 μL，5 U/μL的Taq酶0.5 μL，模板2.0 μL，双蒸水补足到25 μL，混匀。PCR反应程序按参考牛晓庆等[3]文献进行。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收，回收产物送往上海生工用引物为ITS1和ITS4进行测序，然后将所获序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上进行比较分析。
1.2.3 病原菌生物学特性研究 将病原菌在PDA平板上培养7 d，打取直径为6 mm的菌饼，接种于培养基平板（Φ=9 cm）中央进行培养，其中培养基设PDA、CLAM、CMAM、Richard、CAM、OMAM、Czape等7个处理；温度设5、10、15、20、25、30、35 ℃等7个处理，pH值设2、3、4、5、6、7、8、9、10、11等10个处理，光照设完全黑暗、完全光照和光暗交替（光照和黑暗各12 h）3个处理。碳氮源分别设葡萄糖、阿拉伯树胶粉、乳糖、甘露醇、甘油、果糖和蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵等处理（参照Czapek培养基的配方，用等量的碳源或氮源置换其中的蔗糖或硝酸钠），以不加碳源或氮氮为对照。各处理均重复6次，培养7 d 后用十字交叉法测量菌落直径，所得数据用DPS数据分析软件进行处理[6]。
参照（1）的方法制备菌块，放入装有无菌水的试管内，分别于40、45 、50、55、56、57 ℃处理15 min。将处理后的菌块接种PDA平板上，25 ℃培养4 d后观察生长情况。
制备病菌浓度为105（个/mL）的孢子液。取1～2滴滴加于干净凹载玻片上，分别在5、10、15、20、25、30、35 ℃培养6 h，取出镜检孢子萌发情况，以芽管长度超过分生孢子直径的一半视为萌发[4]。每个处理不少于10个视野，100个孢子，计算孢子萌发率，用DPS软件进行分析。取0.5 mL孢子液，分别于40、45、50、52、55、56、57 ℃处理15 min，后涂布在PDA培养基平板上，25 ℃培养4 d后观察萌发情况。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离及致病性测定
从椰子叶病斑病健交界处分离纯化得到一菌株，将菌株编号为YC-19。该病原菌主要侵染幼龄椰子，发病初期，在椰子叶片上产生褐色水渍状病斑，病斑形状椭圆至圆形或不规则形，周围有浅黄色晕圈（图1）。严重时病斑褐色面积扩大，有黑褐色晕圈出现，最外围仍是浅黄色晕圈，病部向叶尖扩展，导致叶尖枯萎至灰褐色最终导致整个叶片灰色死亡（图2）。接种菌丝块10 d后，接种位点出现和田间类似的症状（图3）。接种所用的孢子浓度为3.1×105个/mL。从接种后发病病斑上重新分离获得了病原物，其培养性状和分生孢子形态与最初分离物一致，表明这菌株YC-19为该病的致病菌。
2.2 病原菌鉴定
2.2.1 病原菌形态学鉴定 病原菌YC-19在CMA培养基上，菌落初期是灰白色，菌丝轮纹状扩展，随着培养时间增加，菌落变为灰黑色（图4）。显微观察表明分生孢子表面光滑，褐色，稍弯曲或长梭形弯曲，两端钝圆（图5），脐点位于基细胞内，平截（图6），略突出，有5～9个假隔膜，分生孢子大小为39～86 μm×9～16 μm。分生孢子梗单生，直立或稍弯曲，宽5～11 μm（图7），根据以上描述特征，并参考Dimuthu[7]文献将椰子叶枯病的病原鉴定为平脐蠕孢真菌（Bipolaris sp.）。
2.2.2 分子鉴定 电泳结果表明扩增片段大小约为0.5 kb，测序结果表明所获序列为532 nt。序列已提交GenBank数据库，登录号为KJ605157。分析表明该序列与4株狗尾草平脐蠕孢菌Bipolaris setariae的ITS序列（HE792936.1，JX462256，GUO73108.1，FJ606786.1）具有99%的同源性。
2.3 病原菌生物学特性研究
2.3.1 培养基对菌落生长的影响 培养结果表明，YC-19在供试的8种培养基上均能生长，在CAM和PDA平板上生长最快，7 d后菌落直径分别为（74.1±1.24）和（69.6±1.32）mm（图8）。
2.3.2 温度对菌落生长的影响 从图9可以看出，适合病原菌YC-19生长的温度范围是20～30 ℃，在25 ℃时生长速度最快，菌落直径为（87.1±0.48）mm，与其他温度下的菌落直径有显著差异；低于10 ℃或高于40 ℃都不能生长。表明YC-19菌丝生长的最适温度为25 ℃；在5～30 ℃内，孢子萌发率呈递增趋势，30 ℃时达到最高，为84%，30 ℃以后，孢子萌发率下降，40 ℃时，仅为8%。
2.3.3 pH值对菌落生长的影响 在pH为4～11的PDA培养基平板上，病原菌YC-19均能正常生长，且菌丝生长良好，10 d后几乎长满整个平板（图10）。
2.3.4 碳源对菌丝生长的影响 碳源对YC-19菌落生长有较明显影响。在果糖、乳糖、葡萄糖、阿拉伯树胶粉、甘露醇为碳源的培养基上，菌落直径均大于缺碳对照，只有甘油为碳源时菌落直径小于对照。蔗糖为碳源时，菌落直径为（73.6±2.46）mm，最适合YC-19的生长；其次为葡萄糖，阿拉伯树胶粉和果糖，菌落直径分别为（47.5±1.51）mm，（45.7±1.03）mm和（43.6±1.24）mm菌丝生长较旺盛；甘油作为碳源时菌落直径最小，分别为（28.7±1.83）mm，且菌丝长势不好（图11）。 2.3.5 氮源对菌落生长的影响 氮源对YC-19的菌丝生长没有明显影响。蛋白胨作为氮源时，YC-19的菌落直径达（62.3±2.44）mm；其次为磷酸氢二铵，菌落直径为（61.0±1.97）mm，且菌丝生长茂盛；硝酸钾作为氮源时，菌落直径仅为（35.2±0.54）mm， 表明供试氮源中蛋白胨是YC-19菌丝生长的最适氮源，其次为磷酸氢二铵（图12）。
2.3.6 光照对菌落生长的影响 光照条件对YC-19菌落生长影响较大，表明菌丝生长光照要求比较严格。光照和光暗交替及完全黑暗条件下的菌落直径差异显著，其中黑暗条件下的菌落直径仅（22.8±2.31）mm，而光照条件下，菌落直径高达（57.5±2.73）mm。光暗交替条件下的菌落直径介于二者之间（图13）。
2.3.7 菌丝和分生孢子致死温度测定 对不同温度处理过的菌块培养结果表明，经过57 ℃处理15 min后，菌丝块失去生长能力，分生孢子经56 ℃以上温度处理15 min后，孢子即完全丧失了萌发能力，致死温度和时间分别为56 ℃，15 min（图14）。
3 讨论与结论
本文对新发现的一种椰子叶部病害病原YC-19进行了形态学和分子生物学鉴定，最终将其归为狗尾草平脐蠕孢菌（Bipolaris setariae），并对其生物学特性进行了初步研究。结果表明，最适合菌丝生长的培养基是CMA培养基；该病原菌菌丝生长适宜温度为20～30 ℃，最适温度是25 ℃，10 ℃以下，40 ℃以上停止生长；在CMA培养基上分生孢子的最适萌发温度是30 ℃，其次为25 ℃；菌丝和分生孢子的致死温度和时间为56 ℃，15 min；该病菌的适宜pH值为4～11，范围较广，酸或碱的条件下几乎不影响菌丝的生长。最适合菌丝生长的碳源和氮源分别是蔗糖和蛋白胨，除了甘油会抑制菌丝生长外，对碳氮源的要求也不严格，说明该菌具有很强的环境适应性。
该病原菌主要侵染幼龄椰子，发病初期，在椰子叶片上产生褐色病斑，病斑形状椭圆至圆形或不规则形，周围有浅黄色晕圈，严重时病斑褐色面积扩大，有黑褐色晕圈出现，最外围仍是浅黄色晕圈，与椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis palmarum）引起的症状不同。灰斑病发病初期叶片出现橙黄色圆点，后扩展成灰色条斑，病斑中心有黑色小颗粒[8]，而该病菌引起的病斑中心无明显病征；该病菌引起的病症与Bipolaris incurvata引起的椰子枯萎病菌相似，但Bipolaris incurvata分生孢子为8～13个假隔膜，大小为100～150×19～22 μm，与B. setariae分生孢子5～9个假隔膜，大小为39～86 μm×9～16 μm不同[9]。依据以上所述该新病害的发病特点及对病原的鉴定结果，根据病原菌属名而将该病害命为平脐蠕孢叶斑病。狗尾草平脐蠕孢菌寄主范围比较广，其寄主除本文所报道的椰子外，还有禾本科杂草，如牛筋草（Eleusine indica L.） Gaertn，马唐（Digitaria sanguinalis L.）Scop，小麦（Triticum aestivum L.），谷子（Setaria italica L.），玉米（Zea mays L.）等[10]。该菌其是否侵染其他热带油料作物的叶片或果实是后续的研究内容之一，且本文尚未对YC-19的产孢特性进行详尽研究，仅对分生孢子致死温度和温度对孢子萌发的影响进行了研究，对适合菌丝生长的培养基进行筛选的同时，初步检测了产孢量，发现CMA最适合狗尾草平脐蠕孢菌的产孢，培养15 d后，有大量孢子产生，其他培养基都不易产生孢子或不产生孢子。至于温度，pH值，光照及碳氮源对狗尾草平脐蠕孢菌产孢的影响，需要进一步研究。
参考文献
[1] 符家豪， 颜春梅. 海南椰子[J]. 特种经济动植物， 2000（3）： 40.
[2] 王永壮， 覃伟权. 海南椰子主要病虫害及其防治[J]. 热带农业科学， 2005， 87（5）： 59-62.
[3] 牛晓庆， 陈良秋， 付登强， 等. 油茶叶枯病菌的鉴定及生物学特性研究[J]. 热带作物学报， 2013， 3（2）： 1-7.
[4] 方中达. 植病研究法第三版[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[5] 曹文波， 郑璐璐， 谢文海. 一种提取植物基因组DNA的方法-改良尿素法[J]. 华中师范大学学报， 2008， 42（3）： 448-451.
[6] 唐启义， 冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]. 北京： 科学出版社， 2002.
[7] Dimuthu S M， Lei Cai， Eric H C， et al. A phylogenetic and taxonomic re-evaluation of the Bipolaris-Cochliobolus-Curvularia Complex[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 131-144.
[8] Bhaskaran R， Karthikeyan A R. Leaf blight disease of coconut palm[J]. Indian Coconut Journal， 2007， 10（2）： 2-5.
[9] Kamalakannan A， ValluvaparidasanV， Rabindran R， et al. First report of Bipolaris leaf blight of coconut（Cocos nucifera）caused by Bipolaris incurvata in mainland India[J]. Plant pathology， 2006， 55（4）： 579.
[10] 赵杏利， 邓 晖， 牛永春. 一种狗尾草病原真菌的鉴定及菌株致病性研究[J]. 菌物学报， 2010， 29（2）： 172-177.
关键词 椰子；平脐蠕孢；生物学特性
中图分类号 S435. 61 文献标识码 A
Abstract In October 2012， a new leaf spot disease was observed on coconut seedlings in Wenchang， Hainan province. Based on microscopic observation， the conidiophores were slightly flexuous or straight， produced curved， spindle-shaped or fusiform， septate conidia with 5 to 9 pseuedo-septa. Thus， the pathogen belong to Bipolari. sp. Furthermore， the result of ITS sequence analysis revealed 99% sequence similarity with B. setariae. The results of biological characteristics showed that CAM and PDA medium were the best for the mycelial growth of pathogen. Temperature ranged from 20 to 30 ℃ were optimum for its mycelia growth， and conidia germinated best on 30 ℃. pH ranged from 4 to 11 was optimum for its mycelia growth. The mycelia grew best on media with sucrose as C source. Peptone nitrate and was the best nitrogen sources for mycelial growth and the（NH4）2HPO4 nitrate was the second. Continuous light was the best for mycelial growth. The lethal temperature was 56 ℃， 15 minutes for hypha growth and conidiospore.
Key words Cocos nucifera L.； Bipolaris.sp； Biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.023
椰子（Cocos nucifera L.）属于棕榈科椰子属，是热带地区主要的木本油料作物之一，综合利用经济效益高，故享有“宝树”之称， 具有极其重要的观赏价值[1]。在海南、广西、广东、云南、四川、福建及台湾等省（区）均有种植，其中主要集中在海南省，种植面积已达到约14万hm2[2]。随着海南国际旅游岛建设步伐的加快，椰子的需求量日益增加、供不应求，其经济价值也逐年提升，致使椰子种植面积不断扩大，但随之而来的椰子树的病害也日趋严重，制约了椰子产业化的发展。
2012年10月，笔者在海南省文昌市椰子研究所椰子种植苗圃发现了一种新的叶斑病，该病主要为害椰子叶，严重影响长势并降低观赏价值。该病主要危害2～6龄椰子幼苗，严重时病斑扩大至叶尖，整片叶子枯萎死亡。本实验开展该病害的病原菌鉴定和生物学特性研究，为进一步开展该病害的防治工作提供了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 椰子品种和平脐蠕孢叶斑病病样 病样来源：椰子平脐蠕孢叶斑病病样采自海南省文昌市椰子研究所；接种材料：椰子大观园椰子叶，椰子品种为海南本地高种。
1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），椰叶琼脂培养基（CLAM），椰子肉培养基（CMAM），查氏琼脂培养基（Czapek），理查德琼脂培养基（Richard），燕麦片琼脂培养基（OMAM）玉米培琼脂培养基（CAM），详细配方见参考牛晓庆等[3]文献。
1.1.3 供试试剂 Taq酶、dNTPs、胶回收试剂盒（Gel Extraction Mini Kit W5221）等购自天跟生化科技（北京）有限公司，引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGA
ACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA
TGC-3′）由上海生工生物工程股份有限公司（上海生工）合成；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离与致病性测定 按常规分离方法分离和纯化病原菌[4]。取在玉米培养基上培养15 d的病原菌，加10～15 mL无菌水，用无菌刀片刮取菌丝，2层滤纸过滤菌丝，将孢子浓度调为105（个/mL）。洗净的椰子叶片以叶脉为界，两边均用灭菌针头刺6～7个伤口，取100 uL孢子液涂抹一边，另一边涂等量无菌水为对照，3次重复。叶片放置于25 ℃培养箱。逐日观察发病情况。根据再分离菌株菌落特征以及分生孢子形状，与最初分离的菌株进行比较以确认分离物的致病性。 1.2.2 病原菌鉴定 （1）病原菌形态观察。打取生长7 d、大小6 mm×6 mm的病原菌菌丝块，置于铺有润湿滤纸的干净培养皿上，于25 ℃保湿培养，7 d后观察分生孢子梗的形态；病原菌在玉米培养基上培养14 d后，观察孢子形态并测量其大小，所用设备为倒置生物显微镜（Leica DMIL）及其配备的系统软件Leica Application Suite 3.80。
（2）ITS序列分析。采用尿素法提取菌丝基因组DNA[5]。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。PCR反应混合液总体积为 25 μL：包括2 μL 10×PCR反应缓冲液，2.5 mmol/L的dNTPs 1.0 μL，引物各0.5 μL，5 U/μL的Taq酶0.5 μL，模板2.0 μL，双蒸水补足到25 μL，混匀。PCR反应程序按参考牛晓庆等[3]文献进行。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收，回收产物送往上海生工用引物为ITS1和ITS4进行测序，然后将所获序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上进行比较分析。
1.2.3 病原菌生物学特性研究 将病原菌在PDA平板上培养7 d，打取直径为6 mm的菌饼，接种于培养基平板（Φ=9 cm）中央进行培养，其中培养基设PDA、CLAM、CMAM、Richard、CAM、OMAM、Czape等7个处理；温度设5、10、15、20、25、30、35 ℃等7个处理，pH值设2、3、4、5、6、7、8、9、10、11等10个处理，光照设完全黑暗、完全光照和光暗交替（光照和黑暗各12 h）3个处理。碳氮源分别设葡萄糖、阿拉伯树胶粉、乳糖、甘露醇、甘油、果糖和蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵等处理（参照Czapek培养基的配方，用等量的碳源或氮源置换其中的蔗糖或硝酸钠），以不加碳源或氮氮为对照。各处理均重复6次，培养7 d 后用十字交叉法测量菌落直径，所得数据用DPS数据分析软件进行处理[6]。
参照（1）的方法制备菌块，放入装有无菌水的试管内，分别于40、45 、50、55、56、57 ℃处理15 min。将处理后的菌块接种PDA平板上，25 ℃培养4 d后观察生长情况。
制备病菌浓度为105（个/mL）的孢子液。取1～2滴滴加于干净凹载玻片上，分别在5、10、15、20、25、30、35 ℃培养6 h，取出镜检孢子萌发情况，以芽管长度超过分生孢子直径的一半视为萌发[4]。每个处理不少于10个视野，100个孢子，计算孢子萌发率，用DPS软件进行分析。取0.5 mL孢子液，分别于40、45、50、52、55、56、57 ℃处理15 min，后涂布在PDA培养基平板上，25 ℃培养4 d后观察萌发情况。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离及致病性测定
从椰子叶病斑病健交界处分离纯化得到一菌株，将菌株编号为YC-19。该病原菌主要侵染幼龄椰子，发病初期，在椰子叶片上产生褐色水渍状病斑，病斑形状椭圆至圆形或不规则形，周围有浅黄色晕圈（图1）。严重时病斑褐色面积扩大，有黑褐色晕圈出现，最外围仍是浅黄色晕圈，病部向叶尖扩展，导致叶尖枯萎至灰褐色最终导致整个叶片灰色死亡（图2）。接种菌丝块10 d后，接种位点出现和田间类似的症状（图3）。接种所用的孢子浓度为3.1×105个/mL。从接种后发病病斑上重新分离获得了病原物，其培养性状和分生孢子形态与最初分离物一致，表明这菌株YC-19为该病的致病菌。
2.2 病原菌鉴定
2.2.1 病原菌形态学鉴定 病原菌YC-19在CMA培养基上，菌落初期是灰白色，菌丝轮纹状扩展，随着培养时间增加，菌落变为灰黑色（图4）。显微观察表明分生孢子表面光滑，褐色，稍弯曲或长梭形弯曲，两端钝圆（图5），脐点位于基细胞内，平截（图6），略突出，有5～9个假隔膜，分生孢子大小为39～86 μm×9～16 μm。分生孢子梗单生，直立或稍弯曲，宽5～11 μm（图7），根据以上描述特征，并参考Dimuthu[7]文献将椰子叶枯病的病原鉴定为平脐蠕孢真菌（Bipolaris sp.）。
2.2.2 分子鉴定 电泳结果表明扩增片段大小约为0.5 kb，测序结果表明所获序列为532 nt。序列已提交GenBank数据库，登录号为KJ605157。分析表明该序列与4株狗尾草平脐蠕孢菌Bipolaris setariae的ITS序列（HE792936.1，JX462256，GUO73108.1，FJ606786.1）具有99%的同源性。
2.3 病原菌生物学特性研究
2.3.1 培养基对菌落生长的影响 培养结果表明，YC-19在供试的8种培养基上均能生长，在CAM和PDA平板上生长最快，7 d后菌落直径分别为（74.1±1.24）和（69.6±1.32）mm（图8）。
2.3.2 温度对菌落生长的影响 从图9可以看出，适合病原菌YC-19生长的温度范围是20～30 ℃，在25 ℃时生长速度最快，菌落直径为（87.1±0.48）mm，与其他温度下的菌落直径有显著差异；低于10 ℃或高于40 ℃都不能生长。表明YC-19菌丝生长的最适温度为25 ℃；在5～30 ℃内，孢子萌发率呈递增趋势，30 ℃时达到最高，为84%，30 ℃以后，孢子萌发率下降，40 ℃时，仅为8%。
2.3.3 pH值对菌落生长的影响 在pH为4～11的PDA培养基平板上，病原菌YC-19均能正常生长，且菌丝生长良好，10 d后几乎长满整个平板（图10）。
2.3.4 碳源对菌丝生长的影响 碳源对YC-19菌落生长有较明显影响。在果糖、乳糖、葡萄糖、阿拉伯树胶粉、甘露醇为碳源的培养基上，菌落直径均大于缺碳对照，只有甘油为碳源时菌落直径小于对照。蔗糖为碳源时，菌落直径为（73.6±2.46）mm，最适合YC-19的生长；其次为葡萄糖，阿拉伯树胶粉和果糖，菌落直径分别为（47.5±1.51）mm，（45.7±1.03）mm和（43.6±1.24）mm菌丝生长较旺盛；甘油作为碳源时菌落直径最小，分别为（28.7±1.83）mm，且菌丝长势不好（图11）。 2.3.5 氮源对菌落生长的影响 氮源对YC-19的菌丝生长没有明显影响。蛋白胨作为氮源时，YC-19的菌落直径达（62.3±2.44）mm；其次为磷酸氢二铵，菌落直径为（61.0±1.97）mm，且菌丝生长茂盛；硝酸钾作为氮源时，菌落直径仅为（35.2±0.54）mm， 表明供试氮源中蛋白胨是YC-19菌丝生长的最适氮源，其次为磷酸氢二铵（图12）。
2.3.6 光照对菌落生长的影响 光照条件对YC-19菌落生长影响较大，表明菌丝生长光照要求比较严格。光照和光暗交替及完全黑暗条件下的菌落直径差异显著，其中黑暗条件下的菌落直径仅（22.8±2.31）mm，而光照条件下，菌落直径高达（57.5±2.73）mm。光暗交替条件下的菌落直径介于二者之间（图13）。
2.3.7 菌丝和分生孢子致死温度测定 对不同温度处理过的菌块培养结果表明，经过57 ℃处理15 min后，菌丝块失去生长能力，分生孢子经56 ℃以上温度处理15 min后，孢子即完全丧失了萌发能力，致死温度和时间分别为56 ℃，15 min（图14）。
3 讨论与结论
本文对新发现的一种椰子叶部病害病原YC-19进行了形态学和分子生物学鉴定，最终将其归为狗尾草平脐蠕孢菌（Bipolaris setariae），并对其生物学特性进行了初步研究。结果表明，最适合菌丝生长的培养基是CMA培养基；该病原菌菌丝生长适宜温度为20～30 ℃，最适温度是25 ℃，10 ℃以下，40 ℃以上停止生长；在CMA培养基上分生孢子的最适萌发温度是30 ℃，其次为25 ℃；菌丝和分生孢子的致死温度和时间为56 ℃，15 min；该病菌的适宜pH值为4～11，范围较广，酸或碱的条件下几乎不影响菌丝的生长。最适合菌丝生长的碳源和氮源分别是蔗糖和蛋白胨，除了甘油会抑制菌丝生长外，对碳氮源的要求也不严格，说明该菌具有很强的环境适应性。
该病原菌主要侵染幼龄椰子，发病初期，在椰子叶片上产生褐色病斑，病斑形状椭圆至圆形或不规则形，周围有浅黄色晕圈，严重时病斑褐色面积扩大，有黑褐色晕圈出现，最外围仍是浅黄色晕圈，与椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis palmarum）引起的症状不同。灰斑病发病初期叶片出现橙黄色圆点，后扩展成灰色条斑，病斑中心有黑色小颗粒[8]，而该病菌引起的病斑中心无明显病征；该病菌引起的病症与Bipolaris incurvata引起的椰子枯萎病菌相似，但Bipolaris incurvata分生孢子为8～13个假隔膜，大小为100～150×19～22 μm，与B. setariae分生孢子5～9个假隔膜，大小为39～86 μm×9～16 μm不同[9]。依据以上所述该新病害的发病特点及对病原的鉴定结果，根据病原菌属名而将该病害命为平脐蠕孢叶斑病。狗尾草平脐蠕孢菌寄主范围比较广，其寄主除本文所报道的椰子外，还有禾本科杂草，如牛筋草（Eleusine indica L.） Gaertn，马唐（Digitaria sanguinalis L.）Scop，小麦（Triticum aestivum L.），谷子（Setaria italica L.），玉米（Zea mays L.）等[10]。该菌其是否侵染其他热带油料作物的叶片或果实是后续的研究内容之一，且本文尚未对YC-19的产孢特性进行详尽研究，仅对分生孢子致死温度和温度对孢子萌发的影响进行了研究，对适合菌丝生长的培养基进行筛选的同时，初步检测了产孢量，发现CMA最适合狗尾草平脐蠕孢菌的产孢，培养15 d后，有大量孢子产生，其他培养基都不易产生孢子或不产生孢子。至于温度，pH值，光照及碳氮源对狗尾草平脐蠕孢菌产孢的影响，需要进一步研究。
参考文献
[1] 符家豪， 颜春梅. 海南椰子[J]. 特种经济动植物， 2000（3）： 40.
[2] 王永壮， 覃伟权. 海南椰子主要病虫害及其防治[J]. 热带农业科学， 2005， 87（5）： 59-62.
[3] 牛晓庆， 陈良秋， 付登强， 等. 油茶叶枯病菌的鉴定及生物学特性研究[J]. 热带作物学报， 2013， 3（2）： 1-7.
[4] 方中达. 植病研究法第三版[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[5] 曹文波， 郑璐璐， 谢文海. 一种提取植物基因组DNA的方法-改良尿素法[J]. 华中师范大学学报， 2008， 42（3）： 448-451.
[6] 唐启义， 冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]. 北京： 科学出版社， 2002.
[7] Dimuthu S M， Lei Cai， Eric H C， et al. A phylogenetic and taxonomic re-evaluation of the Bipolaris-Cochliobolus-Curvularia Complex[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 131-144.
[8] Bhaskaran R， Karthikeyan A R. Leaf blight disease of coconut palm[J]. Indian Coconut Journal， 2007， 10（2）： 2-5.
[9] Kamalakannan A， ValluvaparidasanV， Rabindran R， et al. First report of Bipolaris leaf blight of coconut（Cocos nucifera）caused by Bipolaris incurvata in mainland India[J]. Plant pathology， 2006， 55（4）： 579.
[10] 赵杏利， 邓 晖， 牛永春. 一种狗尾草病原真菌的鉴定及菌株致病性研究[J]. 菌物学报， 2010， 29（2）： 172-177.