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目的建立一套能够同时检测禽流感病毒H7N9经典毒株和新型变异毒株的多重荧光定量PCR方法。方法以禽流感病毒H7N9亚型HA保守基因、HA裂解位点和NA基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,建立三重荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性和敏感性验证。结果参考GenBank收录毒株序列设计引物;探针分别选用ROX、FAM、VIC为荧光基团;阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点;试剂盒特异性好不受其他亚型流感病毒以及常见禽类病毒的干扰;灵敏度可以达到100~101个EID50。结论该研究建立的荧光PCR检测方法敏感特异,能够用于禽流感病毒H7N9毒株检测。