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[摘要] 目的 探讨DC/CIK细胞治疗对白细胞、红细胞、血小板和淋巴细胞的影响。 方法 对接受DC/CIK细胞治疗的63例癌症患者的血细胞资料进行回顾性分析。结果 在第一疗程DC/CIK细胞治疗前和第二疗程DC/CIK细胞治疗后，63例患者的WBC、RBC、PT和LYM的数量变化无统计学意义（P>0.05）。 结论 DC/CIK细胞治疗几乎没有血液学毒副反应，临床应用安全。
[关键词] 树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞； 白细胞；红细胞；血小板；淋巴细胞
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）19-0016-03
在可以预见的将来，每年将有数以百万计的人诊断出癌症[1]。手术、放疗、化疗仍是主要的治疗方法，但死亡率很高[2]。与传统的手术、放疗、化疗相比，肿瘤免疫治疗毒副反应轻微，疗效较好，逐渐成为第四种治癌方法[3]。DC/CIK 细胞（dendritic cell，DC，树突状细胞/cytokine induced killer cell，CIK，细胞因子诱导的杀伤细胞）治疗是临床较为普遍应用的过继性细胞免疫治疗技术，抗肿瘤作用强大、还能降低肿瘤进展的风险、延长生存[4]。然而，作为一种新的细胞治疗技术，其对WBC、RBC、PT和LYM究竟有何影响，临床少有报道。为此，回顾性分析2011年1月～2012年6月期间接受DC/CIK细胞治疗的63例癌症患者的血细胞资料，探讨DC/CIK细胞治疗与WBC、RBC、PT和LYM的相互影响，以保障其临床应用的安全。
1 对象与方法
1.1 研究对象
63例晚期肿瘤患者均经过病理学或细胞学检查确诊。男44例，女19例。年龄21～72岁。鼻咽癌2例，肺癌36例，乳腺癌4例，食管癌1例，胃癌2例，结肠癌4例，直肠癌2例，肝癌4例，宫颈癌1例，肾癌3例，淋巴瘤2例，恶性黑色素瘤2例。
1.2 方法
1.2.1 DC/CIK细胞培养[5] 依据我院生物实验室的标准流程，在患者签字同意后，经上肢静脉抽取患者静脉血100 mL。随后，采用淋巴细胞分离液逐步分离出单个核细胞。反复用生理盐水洗涤单个核细胞3 次。将分离出的单个核细胞分别进行DC及CIK细胞的培养。①DC细胞培养：第一日，用含细胞因子IL-4、TNF的培养基培养DC细胞。每隔一天技术员采用半量换液一次。第十日，细胞培养成熟，此时再将CIK细胞混合，共同培养。②CIK细胞培养：第一日，用含细胞因子IFN-γ、抗CD3单抗等无血清生长培养基培养CIK细胞。24 h后加入含细胞因子IL-1和IL-2等无血清生长培养基。按要求需每2～3天更换培养基一次，并补加IL-2。第十日，CIK细胞与DC细胞共同培养。为了解有无微生物感染，在第十二日抽取样本进行细菌、霉菌检测。第十五日，DC/CIK细胞培养成熟。最后，将培养成熟的细胞平均分成6袋，每日一袋静脉回输给患者。
1.2.2 DC/CIK细胞回输 经外周静脉，患者每天静脉输注DC/CIK细胞一次，每次回输细胞的总数在（1.5～2.0）×109。我们规定6 d为一个疗程，每疗程细胞总数≥9×109。每个患者均接受2个疗程的治疗。
1.3 观察指标
所有患者在第一疗程DC/CIK细胞回输之前和第二疗程DC/CIK细胞回输之后，均进行血常规检查。WBC计数单位及正常值为（4.0～10.0）×109/L，RBC计数单位及正常值为男性（4.0～5.5）×1012/L、女性（3.5～5.0）×1012/L，PT计数单位及正常值为（100～300）×109/L，LYM计数单位及正常值为（0.8～2.0）×109/L。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用配对t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
DC/CIK细胞治疗前后，63例癌症患者WBC、RBC、PT和LYM等血细胞计数的变化无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1 63例患者接受DC/CIK细胞治疗前后血细胞计数的变化（x±s）
3 讨论
血液是流动于心血管内的液态组织，又称外周血，由RBC、WBC、PT和血浆组成[6]。各类血细胞均起源于造血干细胞[7]。
WBC为无色、有核的细胞，在血液中一般呈球形。WBC的主要功能是机体的防御和免疫功能[8，9]。WBC所具有的变形、游走、趋化、吞噬和分泌等特性是执行防御功能的生理基础[7]。近年文献报道，白细胞计数与癌症死亡率[10]、肺癌发病[11]等密切相关。由此可见，维持WBC在正常范围内变化，保持相对平衡，临床意义重大。本研究证实，63例癌症患者在DC/CIK细胞治疗前后白细胞计数的差异并无统计学意义（P>0.05），说明DC/CIK细胞治疗对WBC几乎没有细胞毒作用。
正常成熟RBC无核，呈双凹园碟形，其主要功能是运输氧气和二氧化碳[7]。RBC水平的高与低，必然导致人体生理病理学改变。如，RBC分布宽度增加与癌症死亡风险增加有关[12]；输注衰老的RBC有促进癌症进展的风险[13]；RBC减少可引起癌症患者贫血，严重影响抗癌治疗的进行。然而，DC/CIK细胞治疗并不抑制RBC，这就解释了DC/CIK细胞治疗前后RBC的差异并无统计学意义（P>0.05）的原因。
PT体积小，无细胞核，呈双面微凸的圆盘状。血小板维持血管壁的完整性，具有粘附、释放、聚集、收缩和吸附等生理特性，参与凝血和止血过程[7]。在某些病理情况下，血小板也与肿瘤转移、侵袭和进展相关[14]。我们的研究表明，DC/CIK细胞治疗前后PT的差异无统计学意义（P>0.05）。 LYM 分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer，NK）三类。T淋巴细胞和B淋巴细胞分别与细胞免疫和体液免疫有关，而NK细胞是机体天然免疫的重要执行者[7]。人体的免疫功能在抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。除此之外，循环T淋巴细胞和辅助性淋巴细胞计数可能还是预测肿瘤对放化疗疗效的有效标志物[15]。基于本研究的结果，我们没有发现DC/CIK细胞治疗前后LYM 的差异有统计学意义（P>0.05）。
CIK细胞是一群异质性且同时具有 T细胞和NK细胞表型的免疫效应细胞。在临床前试验和动物肿瘤模型中，CIK细胞表现出强大的抗肿瘤活性，增殖速度快，对多种肿瘤有杀伤作用[16]。DC细胞是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞[17]。它将肿瘤抗原提呈到T淋巴细胞，然后诱导特异性细胞毒性T细胞抵抗肿瘤抗原。CIK细胞能够直接杀伤肿瘤细胞，两种细胞联合应用可提高抗肿瘤效果[18]。DC/CIK细胞治疗安全有效，副作用十分轻微[19]。与此相反，抗肿瘤的放疗和化疗虽能治愈部分肿瘤患者，但因其重大的毒副反应，相当一部分患者不能耐受，因而拒绝放化疗或被迫中断放化疗，多数患者最终死于肿瘤进展。通过对本组63例癌症患者血细胞的分析发现，RBC、WBC、PT、LYM在DC/CIK细胞治疗前后的变化并无统计学差异，说明DC/CIK细胞治疗的安全性，也为日后大规模临床应用DC/CIK细胞治疗奠定了坚实的基础。
综上所述，DC/CIK细胞治疗几乎没有血液学毒副反应，其可能的原因是DC/CIK细胞治疗对正常骨髓及脾细胞无细胞毒活性[20]。DC/CIK细胞治疗特别适合手术、放疗、化疗后癌症患者的辅助治疗或因年老、体弱根本不能耐受放疗、化疗的癌症患者。
[参考文献]
[1] Coleman MP. Cancer survival：Global surveillance will stimulate health policy and improve equity[J]. Lancet，2014， 383（9916）：564-573.
[2] Ascierto PA，Addeo R，Cartenì G，et al. The role of immunotherapy in solid tumors：report from the Campania Society of Oncology Immunotherapy（SCITO） meeting， Naples 2014[J]. J Transl Med，2014，12（1）：291-305.
[3] DeVita VT，Rosenberg SA. Two hundred years of cancer research[J]. N Engl J Med，2012，366（23）：2207-2214.
[4] Gao D，Li C，Xie X，et al. Autologous tumor lysate-pulsed dendritic cell immunotherapy with cytokine-induced killer cells improves survival in gastric and colorectal cancer patients[J]. PLo S ONE，2014，9（4）：e93886-e93894.
[5] 安东建，柴琴，谭小浪. 树突状细胞/细胞因子诱导的杀伤细胞人体内逆转肺癌多耐药的临床研究[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2013，7（14）：6358-6361.
[6] 邹仲之，李继承. 组织学与胚胎学[M]. 第7版. 北京：人民卫生出版社，2008：31.
[7] 朱大年，吴博威，樊小力. 生理学[M]. 第7版. 北京：人民卫生出版社，2011：50-58.
[8] L■mmermann T，Germain RN. The multiple faces of leukocyte interstitial migration[J]. Semin Immunopathol，2014，36（2）：227-251.
[9] Farhangi MA，Keshavarz SA，Eshraghian M，et al. White blood cell count in women：Relation to inflammatory biomarkers，haematological profiles，visceral adiposity，and other cardiovascular risk factors[J]. J Health Popul Nutr，2013，31（1）：58-64.
[10] Blix K，Jensvoll H，Braekkan SK，et al. White blood cell count measured prior to cancer development is associated with future risk of venous thromboembolism-the tromsΦ study[J]. PLoS ONE，2013，8（9）：e73447-e73453.
[11] Sprague BL，Trentham-Dietz A，Klein BE，et al. Physical activity，white blood cell count，and lung cancer risk in a prospective cohort study[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17（10）：2714-2722. [12] Riedl J，Posch F，K■nigsbrügge O，et al. Red cell distribution width and other red blood cell parameters in patients with cancer：Association with risk of venous thromboembolism and mortality[J]. PLoS One，2014，9（10）：e111440 -e111453.
[13] Cata JP，Wang H，Gottumukkala V，et al. Inflammatory response，immunosuppression，and cancer recurrence after perioperative blood transfusions[J]. Br J Anaesth，2013， 110（5）：690-701.
[14] Menter DG，Tucker SC，Kopetz S，et al. Platelets and cancer：A casual or causal relationship：Revisited[J]. Cancer Metastasis Rev，2014，33（1）：231-269.
[15] Tada N，Kawai K，Tsuno NH，et al. Prediction of the preoperative chemoradiotherapy response for rectal cancer by peripheral blood lymphocyte subsets[J]. World J Surg Oncol，2015，13（1）：30-39.
[16] Schmeel FC，Schmeel LC，Gast SM，et al. Adoptive immunotherapy strategies with cytokine-induced killer （CIK）cells in the treatment of hematological malignancies[J]. Int J Mol Sci，2014，15（8）：14632-14648.
[17] Steinman RM，Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice[J]. J Immunol，2007，178（10）：5-25.
[18] Gao D，Li C，Xie X，et al. Autologous tumor lysate-pulsed dendritic cell immunotherapy with cytokine-induced killer cells improves survival in gastric and colorectal cancer patients[J]. PLoS One，2014，9（4）：e93886-e93894.
[19] Hontscha C，Borck Y，Zhou H，et al. Clinical trials on CIK cells：first report of the international registry on CIK cells （IRCC）[J]. J Cancer Res Clin Oncol，2011，137（2）：305-310.
[20] Jiang J，Wu C，Lu B. Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J]. Journal of Translational Me-dicine，2013，11（1）：83-87.
（收稿日期：2015-04-10）
[关键词] 树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞； 白细胞；红细胞；血小板；淋巴细胞
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）19-0016-03
在可以预见的将来，每年将有数以百万计的人诊断出癌症[1]。手术、放疗、化疗仍是主要的治疗方法，但死亡率很高[2]。与传统的手术、放疗、化疗相比，肿瘤免疫治疗毒副反应轻微，疗效较好，逐渐成为第四种治癌方法[3]。DC/CIK 细胞（dendritic cell，DC，树突状细胞/cytokine induced killer cell，CIK，细胞因子诱导的杀伤细胞）治疗是临床较为普遍应用的过继性细胞免疫治疗技术，抗肿瘤作用强大、还能降低肿瘤进展的风险、延长生存[4]。然而，作为一种新的细胞治疗技术，其对WBC、RBC、PT和LYM究竟有何影响，临床少有报道。为此，回顾性分析2011年1月～2012年6月期间接受DC/CIK细胞治疗的63例癌症患者的血细胞资料，探讨DC/CIK细胞治疗与WBC、RBC、PT和LYM的相互影响，以保障其临床应用的安全。
1 对象与方法
1.1 研究对象
63例晚期肿瘤患者均经过病理学或细胞学检查确诊。男44例，女19例。年龄21～72岁。鼻咽癌2例，肺癌36例，乳腺癌4例，食管癌1例，胃癌2例，结肠癌4例，直肠癌2例，肝癌4例，宫颈癌1例，肾癌3例，淋巴瘤2例，恶性黑色素瘤2例。
1.2 方法
1.2.1 DC/CIK细胞培养[5] 依据我院生物实验室的标准流程，在患者签字同意后，经上肢静脉抽取患者静脉血100 mL。随后，采用淋巴细胞分离液逐步分离出单个核细胞。反复用生理盐水洗涤单个核细胞3 次。将分离出的单个核细胞分别进行DC及CIK细胞的培养。①DC细胞培养：第一日，用含细胞因子IL-4、TNF的培养基培养DC细胞。每隔一天技术员采用半量换液一次。第十日，细胞培养成熟，此时再将CIK细胞混合，共同培养。②CIK细胞培养：第一日，用含细胞因子IFN-γ、抗CD3单抗等无血清生长培养基培养CIK细胞。24 h后加入含细胞因子IL-1和IL-2等无血清生长培养基。按要求需每2～3天更换培养基一次，并补加IL-2。第十日，CIK细胞与DC细胞共同培养。为了解有无微生物感染，在第十二日抽取样本进行细菌、霉菌检测。第十五日，DC/CIK细胞培养成熟。最后，将培养成熟的细胞平均分成6袋，每日一袋静脉回输给患者。
1.2.2 DC/CIK细胞回输 经外周静脉，患者每天静脉输注DC/CIK细胞一次，每次回输细胞的总数在（1.5～2.0）×109。我们规定6 d为一个疗程，每疗程细胞总数≥9×109。每个患者均接受2个疗程的治疗。
1.3 观察指标
所有患者在第一疗程DC/CIK细胞回输之前和第二疗程DC/CIK细胞回输之后，均进行血常规检查。WBC计数单位及正常值为（4.0～10.0）×109/L，RBC计数单位及正常值为男性（4.0～5.5）×1012/L、女性（3.5～5.0）×1012/L，PT计数单位及正常值为（100～300）×109/L，LYM计数单位及正常值为（0.8～2.0）×109/L。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用配对t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
DC/CIK细胞治疗前后，63例癌症患者WBC、RBC、PT和LYM等血细胞计数的变化无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1 63例患者接受DC/CIK细胞治疗前后血细胞计数的变化（x±s）
3 讨论
血液是流动于心血管内的液态组织，又称外周血，由RBC、WBC、PT和血浆组成[6]。各类血细胞均起源于造血干细胞[7]。
WBC为无色、有核的细胞，在血液中一般呈球形。WBC的主要功能是机体的防御和免疫功能[8，9]。WBC所具有的变形、游走、趋化、吞噬和分泌等特性是执行防御功能的生理基础[7]。近年文献报道，白细胞计数与癌症死亡率[10]、肺癌发病[11]等密切相关。由此可见，维持WBC在正常范围内变化，保持相对平衡，临床意义重大。本研究证实，63例癌症患者在DC/CIK细胞治疗前后白细胞计数的差异并无统计学意义（P>0.05），说明DC/CIK细胞治疗对WBC几乎没有细胞毒作用。
正常成熟RBC无核，呈双凹园碟形，其主要功能是运输氧气和二氧化碳[7]。RBC水平的高与低，必然导致人体生理病理学改变。如，RBC分布宽度增加与癌症死亡风险增加有关[12]；输注衰老的RBC有促进癌症进展的风险[13]；RBC减少可引起癌症患者贫血，严重影响抗癌治疗的进行。然而，DC/CIK细胞治疗并不抑制RBC，这就解释了DC/CIK细胞治疗前后RBC的差异并无统计学意义（P>0.05）的原因。
PT体积小，无细胞核，呈双面微凸的圆盘状。血小板维持血管壁的完整性，具有粘附、释放、聚集、收缩和吸附等生理特性，参与凝血和止血过程[7]。在某些病理情况下，血小板也与肿瘤转移、侵袭和进展相关[14]。我们的研究表明，DC/CIK细胞治疗前后PT的差异无统计学意义（P>0.05）。 LYM 分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer，NK）三类。T淋巴细胞和B淋巴细胞分别与细胞免疫和体液免疫有关，而NK细胞是机体天然免疫的重要执行者[7]。人体的免疫功能在抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。除此之外，循环T淋巴细胞和辅助性淋巴细胞计数可能还是预测肿瘤对放化疗疗效的有效标志物[15]。基于本研究的结果，我们没有发现DC/CIK细胞治疗前后LYM 的差异有统计学意义（P>0.05）。
CIK细胞是一群异质性且同时具有 T细胞和NK细胞表型的免疫效应细胞。在临床前试验和动物肿瘤模型中，CIK细胞表现出强大的抗肿瘤活性，增殖速度快，对多种肿瘤有杀伤作用[16]。DC细胞是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞[17]。它将肿瘤抗原提呈到T淋巴细胞，然后诱导特异性细胞毒性T细胞抵抗肿瘤抗原。CIK细胞能够直接杀伤肿瘤细胞，两种细胞联合应用可提高抗肿瘤效果[18]。DC/CIK细胞治疗安全有效，副作用十分轻微[19]。与此相反，抗肿瘤的放疗和化疗虽能治愈部分肿瘤患者，但因其重大的毒副反应，相当一部分患者不能耐受，因而拒绝放化疗或被迫中断放化疗，多数患者最终死于肿瘤进展。通过对本组63例癌症患者血细胞的分析发现，RBC、WBC、PT、LYM在DC/CIK细胞治疗前后的变化并无统计学差异，说明DC/CIK细胞治疗的安全性，也为日后大规模临床应用DC/CIK细胞治疗奠定了坚实的基础。
综上所述，DC/CIK细胞治疗几乎没有血液学毒副反应，其可能的原因是DC/CIK细胞治疗对正常骨髓及脾细胞无细胞毒活性[20]。DC/CIK细胞治疗特别适合手术、放疗、化疗后癌症患者的辅助治疗或因年老、体弱根本不能耐受放疗、化疗的癌症患者。
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[1] Coleman MP. Cancer survival：Global surveillance will stimulate health policy and improve equity[J]. Lancet，2014， 383（9916）：564-573.
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[9] Farhangi MA，Keshavarz SA，Eshraghian M，et al. White blood cell count in women：Relation to inflammatory biomarkers，haematological profiles，visceral adiposity，and other cardiovascular risk factors[J]. J Health Popul Nutr，2013，31（1）：58-64.
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[16] Schmeel FC，Schmeel LC，Gast SM，et al. Adoptive immunotherapy strategies with cytokine-induced killer （CIK）cells in the treatment of hematological malignancies[J]. Int J Mol Sci，2014，15（8）：14632-14648.
[17] Steinman RM，Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice[J]. J Immunol，2007，178（10）：5-25.
[18] Gao D，Li C，Xie X，et al. Autologous tumor lysate-pulsed dendritic cell immunotherapy with cytokine-induced killer cells improves survival in gastric and colorectal cancer patients[J]. PLoS One，2014，9（4）：e93886-e93894.
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（收稿日期：2015-04-10）