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摘 要：本文以聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯-磁性纳米凝胶作为作为转基因载体，考察了其对细胞的毒性作用及期基因转染的性能，为磁性纳米凝胶在生物医学领域的应有提供了一条新途径。
关键词：磁性纳米凝胶 聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 转基因载体 安全性评价
将外源基因导入真核细胞的方法大体可分为两大类：病毒感染法和非病毒转染法。病毒载体效率高，是目前基因治疗的主要手段，但病毒载体存在携带基因长度有限、可能引起免疫反应与细胞毒性等问题[1]。由于磁性纳米颗粒具有较好的生物相容性、磁靶向性等优势，非病毒载体在靶向药物、磁共振成像等领域获得较广泛的应用[2]。研究发现，磁性纳米颗粒能给携带外源DNA进入细胞，可作为一种新的转基因载体应用于外源基因的导入[3]。在前期制备了聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（PDEA）磁性纳米凝胶的基础上，我们考察了该纳米凝胶对细胞的毒性作用，并以常用的两种质粒（pEGFP-N1、pRL-TK）考察PDEA-磁性纳米凝胶作为转基因载体的应用情况。
一、实验部分
1.PDEA-磁性纳米凝胶对pRL-TK质粒的吸附及保护研究
取5μg pRL-TK质粒于干净离心管中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，再加入适量TE缓冲液至终体积为20μL，置入摇床孵育10min。取5μL加样进行琼脂糖凝胶电泳（1%），进行EB染色，考察PDEA-磁性纳米凝胶结合质粒DNA情况。取 100 μL 磁性纳米凝胶-DNA复合物（含PDEA-磁性纳米凝胶1.0mg， DNA 25μg），加入Deoxyribonuclease I （DNase I）（1 U/μg of DNA），37℃孵育2h，反应完毕，加入6 μL 乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic acid， EDTA） 溶液（0.25M， pH 8.0）灭活DNase I，然后向溶液中加入12 μL 十二烷基磺酸纳（sodium dodecyl sulfate， SDS， 15%）溶液，孵育10 min，然后，向纳米颗粒中加入20μL 7%的肝素（heparin）溶液，孵育1h，使未被降解的DNA从PDEA-磁性纳米凝胶表面解离下来。将混合溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，以考察质粒DNA被DNase降解情况。
2.细胞毒性及基因转染研究
HepG2细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的空气中培养，培养液选用1640，其中含有10%的牛血清（FBS），5%的双抗（青-链霉素）。
应用胰酶将HepG2细胞消化，加入适量新鲜1640培养液，调整细胞密度为1×105 cell/ml，取细胞悬液铺96孔板（200μL/孔），至细胞融合度80～90%时，吸弃细胞培养液，并立即加入200μL含不同PDEA-磁性纳米凝胶的新鲜1640培养液，继续培养不同时间后，加入0.5%的MTT，37℃培养4h。终止培养，小心吸弃孔内培养液，加入150 μL DMSO，置摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，应用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。
取0.2 μg 质粒pEGFP-N1于200 μL 无血清1640培养液中，加入5μg PDEA-磁性纳米凝胶，轻轻混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，使质粒充分吸附在PDEA-磁性纳米凝胶表面。将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养，24h后，小心弃去培养液，加PBS清洗一次，将未进入细胞的纳米颗粒清洗掉，再加入200新鲜的1640培养液，应用倒置相差（荧光）显微镜观察荧光蛋白的表达情况。
取0.2 μg 质粒pRL-TK于200 μL无血清1640培养液中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养24h。以预冷的PBS洗涤细胞，加入100μl细胞裂解液PLB（Passive lysis buffer），温和摇动15min，使细胞被动裂解。将20μl细胞裂解液与100μl Stop&GloTM试剂混合，激活pRL-TK中的Renilla（海肾）萤光素酶，并立即检测萤光素酶的活力。
二、结果与讨论
1.质粒DNA在PDEA-磁性纳米凝胶表面的吸附及保护作用
由于PDEA修饰在磁性纳米颗粒表面，使纳米颗粒表面带有正电荷，从而可以结合质粒DNA。如果质粒DNA结合在PDEA-磁性纳米凝胶表面后，由于磁纳米颗粒比较大，从而改变质粒DNA在琼脂糖中的电泳图谱[4]。由图1 可以看出，当5μg质粒DNA与80μg PDEA-磁性纳米凝胶结合后，不再出现电泳条带，说明质粒DNA已完全结合在纳米颗粒表面。
目前，限制DNA体内运送的一个重要的难题就是DNA容易被体内的核酸酶降解[5]，而研究证实，将DNA与载体结合后，可以在一定程度上保护DNA。在这里，我们也考察了PDEA-磁性纳米凝胶对DNA的保护作用。我们发现，质粒DNA包裹在磁性纳米凝胶表面，可以部分的保护DNA免于核酸酶的降解。裸的质粒在核酸酶暴露后，被酶降解，在电泳图上没有显示出明显的条带。而与磁性纳米凝胶结合的质粒没有被酶完全降解，从而在电泳图上仍可见到清晰的条带，而且随着磁纳米凝胶与DNA比例的升高，对质粒DNA的保护作用越明显。这表明，与磁性纳米凝胶的结合可以保护DNA免受核酸酶的降解，对于在体液中运输具有重要意义[6]。
2.PDEA-磁性纳米凝胶对HepG2细胞的毒性作用
我们应用MTT法考察了PDEA-磁性纳米凝胶HepG2细胞的毒性作用。我们发现，在短时间暴露的情况下（2 h），PDEA-磁性纳米凝胶对HepG2细胞的毒性较弱，在浓度大于250μg/mL后才会对细胞造成明显的杀伤作用；在暴露12 h的情况下，在浓度大于200μg/mL时会对细胞造成明显的杀伤作用；在暴露24h的，在浓度大于100μg/mL时会对细胞造成明显的杀伤作用。 3.PDEA-磁性纳米凝胶转染pEGFP-N1质粒
为了考察PDEA-磁性纳米凝胶能否携带基因进入细胞，我们应用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein， EGFP）质粒pEGFP-N1结合在PDEA-磁性纳米凝胶表面，考察PDEA-磁性纳米凝胶能否携带质粒pEGFP-N1进入细胞。结果发现，在对照组中，没有绿色荧光蛋白的表达，而在实验组中，有明显的绿荧光蛋白的表达，表明PDEA-磁性纳米能够携带质粒pEGFP-N1进入细胞，并在细胞内成功表达成为绿色荧光蛋白。
为了定量考察PDEA-磁性纳米凝胶转基因的性能，以及与市售TansFastTM 转染试剂的比较情况，我们将0.2 μg pRL-TK质粒与不同量的PDEA-磁性纳米凝胶混合后，考察转染情况，结果如图2所示。我们发现，与只加0.2μg质粒pRL-TK相比，加入PDEA-磁性纳米凝胶后可明显增强质粒转入HepG2细胞的能力，在加入50μg PDEA-磁性纳米凝胶后达到最高值，大于50μg的转染效率略有下降。这可能是由于PDEA-磁性纳米凝胶含量较多，反而使DNA不能完全从PDEA-磁性纳米凝胶表面释放出来。通过比较发现，PDEA-磁性纳米凝胶的转基因效果已达到商用转染试剂盒的水平，为其作为非病毒转基因载体提供了一条新思路。
参考文献
[1] Qiu JD， Xiong M， Liang RP， Peng HP， Liu F. Synthesis and characterization of ferrocene modified Fe3O4@Au magnetic nanogel and its application. Biosen Bioele， 2009， 24（8）： 2649-2653.
[2] Shubayev VI， Pisanic TR. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Adv Drug Deliv Rev， 2009， 61（6）： 467-477.
[3] McCarthy JR， Kelly KA， Sun EY， Weissleder R. Multifunctional magnetic nanoparticles for targeted delivery. Nanom Nanot Biol Medi， 2010， 6： 64-69
[4] Park IK， Ng CP， Wang J， Chu B， Yuan C， Zhang S， Pun SH. Determination of nanoparticle vehicle unpackaging by MR imaging of a T2 magnetic relaxation switch. Biomaterials， 2008， 29： 724-732.
[5] Dang JM， Leong KW. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews， 2006， 58： 487- 499.
[6] Liu C， Yu W， Chen Z， Zhang J， Zhang N. Enhanced gene transfection efficiency in CD13-positive vascular endothelial cells with targeted poly（lactic acid） -poly（ethylene glycol） nanoparticles through caveolae-mediated endocytosis. J Contr Release， 2011， 151（2）： 162-175.
作者简介：顾相伶（1974-），男，汉，山东省宁阳县人，博士，副教授，从事生物医用高分子材料的制备与应用研究。
关键词：磁性纳米凝胶 聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 转基因载体 安全性评价
将外源基因导入真核细胞的方法大体可分为两大类：病毒感染法和非病毒转染法。病毒载体效率高，是目前基因治疗的主要手段，但病毒载体存在携带基因长度有限、可能引起免疫反应与细胞毒性等问题[1]。由于磁性纳米颗粒具有较好的生物相容性、磁靶向性等优势，非病毒载体在靶向药物、磁共振成像等领域获得较广泛的应用[2]。研究发现，磁性纳米颗粒能给携带外源DNA进入细胞，可作为一种新的转基因载体应用于外源基因的导入[3]。在前期制备了聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（PDEA）磁性纳米凝胶的基础上，我们考察了该纳米凝胶对细胞的毒性作用，并以常用的两种质粒（pEGFP-N1、pRL-TK）考察PDEA-磁性纳米凝胶作为转基因载体的应用情况。
一、实验部分
1.PDEA-磁性纳米凝胶对pRL-TK质粒的吸附及保护研究
取5μg pRL-TK质粒于干净离心管中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，再加入适量TE缓冲液至终体积为20μL，置入摇床孵育10min。取5μL加样进行琼脂糖凝胶电泳（1%），进行EB染色，考察PDEA-磁性纳米凝胶结合质粒DNA情况。取 100 μL 磁性纳米凝胶-DNA复合物（含PDEA-磁性纳米凝胶1.0mg， DNA 25μg），加入Deoxyribonuclease I （DNase I）（1 U/μg of DNA），37℃孵育2h，反应完毕，加入6 μL 乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic acid， EDTA） 溶液（0.25M， pH 8.0）灭活DNase I，然后向溶液中加入12 μL 十二烷基磺酸纳（sodium dodecyl sulfate， SDS， 15%）溶液，孵育10 min，然后，向纳米颗粒中加入20μL 7%的肝素（heparin）溶液，孵育1h，使未被降解的DNA从PDEA-磁性纳米凝胶表面解离下来。将混合溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，以考察质粒DNA被DNase降解情况。
2.细胞毒性及基因转染研究
HepG2细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的空气中培养，培养液选用1640，其中含有10%的牛血清（FBS），5%的双抗（青-链霉素）。
应用胰酶将HepG2细胞消化，加入适量新鲜1640培养液，调整细胞密度为1×105 cell/ml，取细胞悬液铺96孔板（200μL/孔），至细胞融合度80～90%时，吸弃细胞培养液，并立即加入200μL含不同PDEA-磁性纳米凝胶的新鲜1640培养液，继续培养不同时间后，加入0.5%的MTT，37℃培养4h。终止培养，小心吸弃孔内培养液，加入150 μL DMSO，置摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，应用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。
取0.2 μg 质粒pEGFP-N1于200 μL 无血清1640培养液中，加入5μg PDEA-磁性纳米凝胶，轻轻混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，使质粒充分吸附在PDEA-磁性纳米凝胶表面。将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养，24h后，小心弃去培养液，加PBS清洗一次，将未进入细胞的纳米颗粒清洗掉，再加入200新鲜的1640培养液，应用倒置相差（荧光）显微镜观察荧光蛋白的表达情况。
取0.2 μg 质粒pRL-TK于200 μL无血清1640培养液中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养24h。以预冷的PBS洗涤细胞，加入100μl细胞裂解液PLB（Passive lysis buffer），温和摇动15min，使细胞被动裂解。将20μl细胞裂解液与100μl Stop&GloTM试剂混合，激活pRL-TK中的Renilla（海肾）萤光素酶，并立即检测萤光素酶的活力。
二、结果与讨论
1.质粒DNA在PDEA-磁性纳米凝胶表面的吸附及保护作用
由于PDEA修饰在磁性纳米颗粒表面，使纳米颗粒表面带有正电荷，从而可以结合质粒DNA。如果质粒DNA结合在PDEA-磁性纳米凝胶表面后，由于磁纳米颗粒比较大，从而改变质粒DNA在琼脂糖中的电泳图谱[4]。由图1 可以看出，当5μg质粒DNA与80μg PDEA-磁性纳米凝胶结合后，不再出现电泳条带，说明质粒DNA已完全结合在纳米颗粒表面。
目前，限制DNA体内运送的一个重要的难题就是DNA容易被体内的核酸酶降解[5]，而研究证实，将DNA与载体结合后，可以在一定程度上保护DNA。在这里，我们也考察了PDEA-磁性纳米凝胶对DNA的保护作用。我们发现，质粒DNA包裹在磁性纳米凝胶表面，可以部分的保护DNA免于核酸酶的降解。裸的质粒在核酸酶暴露后，被酶降解，在电泳图上没有显示出明显的条带。而与磁性纳米凝胶结合的质粒没有被酶完全降解，从而在电泳图上仍可见到清晰的条带，而且随着磁纳米凝胶与DNA比例的升高，对质粒DNA的保护作用越明显。这表明，与磁性纳米凝胶的结合可以保护DNA免受核酸酶的降解，对于在体液中运输具有重要意义[6]。
2.PDEA-磁性纳米凝胶对HepG2细胞的毒性作用
我们应用MTT法考察了PDEA-磁性纳米凝胶HepG2细胞的毒性作用。我们发现，在短时间暴露的情况下（2 h），PDEA-磁性纳米凝胶对HepG2细胞的毒性较弱，在浓度大于250μg/mL后才会对细胞造成明显的杀伤作用；在暴露12 h的情况下，在浓度大于200μg/mL时会对细胞造成明显的杀伤作用；在暴露24h的，在浓度大于100μg/mL时会对细胞造成明显的杀伤作用。 3.PDEA-磁性纳米凝胶转染pEGFP-N1质粒
为了考察PDEA-磁性纳米凝胶能否携带基因进入细胞，我们应用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein， EGFP）质粒pEGFP-N1结合在PDEA-磁性纳米凝胶表面，考察PDEA-磁性纳米凝胶能否携带质粒pEGFP-N1进入细胞。结果发现，在对照组中，没有绿色荧光蛋白的表达，而在实验组中，有明显的绿荧光蛋白的表达，表明PDEA-磁性纳米能够携带质粒pEGFP-N1进入细胞，并在细胞内成功表达成为绿色荧光蛋白。
为了定量考察PDEA-磁性纳米凝胶转基因的性能，以及与市售TansFastTM 转染试剂的比较情况，我们将0.2 μg pRL-TK质粒与不同量的PDEA-磁性纳米凝胶混合后，考察转染情况，结果如图2所示。我们发现，与只加0.2μg质粒pRL-TK相比，加入PDEA-磁性纳米凝胶后可明显增强质粒转入HepG2细胞的能力，在加入50μg PDEA-磁性纳米凝胶后达到最高值，大于50μg的转染效率略有下降。这可能是由于PDEA-磁性纳米凝胶含量较多，反而使DNA不能完全从PDEA-磁性纳米凝胶表面释放出来。通过比较发现，PDEA-磁性纳米凝胶的转基因效果已达到商用转染试剂盒的水平，为其作为非病毒转基因载体提供了一条新思路。
参考文献
[1] Qiu JD， Xiong M， Liang RP， Peng HP， Liu F. Synthesis and characterization of ferrocene modified Fe3O4@Au magnetic nanogel and its application. Biosen Bioele， 2009， 24（8）： 2649-2653.
[2] Shubayev VI， Pisanic TR. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Adv Drug Deliv Rev， 2009， 61（6）： 467-477.
[3] McCarthy JR， Kelly KA， Sun EY， Weissleder R. Multifunctional magnetic nanoparticles for targeted delivery. Nanom Nanot Biol Medi， 2010， 6： 64-69
[4] Park IK， Ng CP， Wang J， Chu B， Yuan C， Zhang S， Pun SH. Determination of nanoparticle vehicle unpackaging by MR imaging of a T2 magnetic relaxation switch. Biomaterials， 2008， 29： 724-732.
[5] Dang JM， Leong KW. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews， 2006， 58： 487- 499.
[6] Liu C， Yu W， Chen Z， Zhang J， Zhang N. Enhanced gene transfection efficiency in CD13-positive vascular endothelial cells with targeted poly（lactic acid） -poly（ethylene glycol） nanoparticles through caveolae-mediated endocytosis. J Contr Release， 2011， 151（2）： 162-175.
作者简介：顾相伶（1974-），男，汉，山东省宁阳县人，博士，副教授，从事生物医用高分子材料的制备与应用研究。