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[摘 要]用阳离子交换柱的HPLC法同时测定注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠中氨苄西林和氯唑西林的含量。色谱条件：采用Hypersil SCX柱，磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH值为6.0）∶乙腈（90∶10）为流动相，检测波长225nm。氨苄西林和氯唑西 林分别在45～134和44～131μg/ml范围内呈良好的线性关系，日内RSD分别为0.5%和0.6%，回收率分别为99.9%和100.0%，含量测定结果与国家药品标准方法所得结果相符。
[关键词]高效液相色谱 阳离子交换柱 氨苄西林 氯唑西林 含量测定
中图分类号：F407.44 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）26-165-01
注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠是氨苄西林钠和氯唑西林钠按活性成分含量1∶1组成的复方制剂。氨苄西林/氯唑西林为广谱结合型抗生素，前者对革兰阳性和阴性菌均具有良好的杀伤作用，但不能抵御β内酰胺酶对其的破坏；后者可对β内酰胺酶产生抑制作用，对产青霉素酶和不产青霉素酶的菌株均有效，两者联合应用可相互补充各自的抗菌谱，产生协同作用，提高整体的抗菌效力。目前国内已有数家药厂根据国家药品标准[1]生产本品。由于氨苄西林和氯唑西林的疏水性相差较大，在通常的反相色谱系统[1]中，氨苄西林的容量因子约为1，与有关物质的分离较差；氯唑西林的容量因子约为30，使得分析时间很长。本文建立采用阳离子交换柱的HPLC法可同时测定注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠中的氨苄西林和氯唑西林的含量，该法可在不足10min时间内有效分离氨苄西林、氯唑西林及其主要杂质。
1 仪器与试药
美国Agilent 1100型HPLC仪；色谱柱：英国Hypersil SCX（200mm×46mm，5μm）；氨苄西林和氯唑西林对照品均购自中国药品生物制品检定所；注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠由上海新先鋒药业有限公司提供；磷酸和磷酸氢二铵均为分析纯，乙腈为HPLC级，水为蒸馏水。
2 色谱条件
流动相为磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH值为6.0）∶乙腈（90∶10）；流速10ml/min；柱温25℃；检测波长225nm；进样体积20μl。
3 方法与结果
对照品溶液 取氨苄西林和氯唑西林对照品各20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。供试品溶液 取供试品50mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。系统适用性溶液 称取供试品约50mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，室温（约25℃）放置24h，即得。氨苄西林峰和氯唑西林峰的理论板数分别约为 3500和3000，拖尾因子分别为1.0和1.1，两者间的分离度约为4.0。
3.1 线性与范围 取氨苄西林和氯唑西林对照品各20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取此液7.5、6.0、 5.0、4.0和2.5ml，分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下分别进样分析。以面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，回归方 程分别为：氨苄西林 A=16.47C+7.6 r=1.0000氯唑西林 A=45.85C+10.7 r=1.0000氨苄西林和氯唑西林分别在45～134和44～131μg/ml范围内呈良好的线性关系。
3.2 检测限和定量限氨苄西林和氯唑西林的检测限按信噪比3∶1计均为0.1μg/ml，定量限按信噪比10∶1计均为0.3μg/ml。
3.3 精密度 取同一批供试品，配制成6份溶液，分别进样分析，氨苄西林和氯唑西林含量的平均值分别为44.67%（RSD=0.5%，n=6）和44.38%（RSD=0.6%，n=6）。
3.4 耐用性 另选用2支相同品牌填料的色谱柱实验，均可得满意的色谱图。
3.5 回收率 精密量取同一份供试品溶液10ml，分别置20ml量瓶中，精密量取并加入对照品贮备液5ml，加水稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下进样分析。 测得氨苄西林和氯唑西林的平均回收率分别为99.9%（RSD=0.4%，n=6）和100.0%（RSD=0.5%，n=6）。
3.6 样品测定采用国家药品标准方法[1]对同一批供试品进行测定，测得氨苄西林和氯唑西林的含量分别为44.30%（n=3）和44.91%（n=3），与本文方法的测定结果一致。
4 讨论
离子交换HPLC法是建立在多重保留机理（如反相和离子交换）上的，一般可提供独特的色谱选择性，同时又具有简便和重现性好的特点[2]。本研究选用以硅胶为基质的强阳离子交换柱――Hypersil SCX柱进行实验。研究结果显示，缓冲液中磷酸氢二铵的浓度为0.01mol/L，pH值由5.0逐渐增至7.0时，氯唑西林的保留值显著减少，氨苄西林的保留值仅稍减弱；缓冲液pH值为6.0时，缓冲液中磷酸氢二铵的浓度由0.01mol/L逐渐增至0.025mol/L，氯唑西林的保留值显著增加，氨苄西林的保留值仅稍增强。显然，由于“盐析”效应，组分的保留随着离子强度的增加而增强，表现出类似于化合物在疏水相互作用色谱中的色谱行为。鉴于两组分在本色谱系统中的色谱行为与通常的离子交换色谱行为相反，即盐或缓冲液浓度的增加反而导 致组分保留的增强，故可以推断，Hypersil SCX填料在本色谱系统中主要表现为疏水或反相色谱行为的特征。选择缓冲液中磷酸氢二铵的浓度为0.01mol/L，pH值为6.0时，可在不足10min的分析时间内有效地分离氨苄西林、氯唑西林及其主要杂质。本色谱系统尚可用于类似品种如注射用阿莫西林钠/双氯西林钠的含量测定，唯流动相需稍作调整为磷酸盐缓冲液（0.005mol/L磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH值为6.4）∶乙腈（90∶10），同样可在不足10min的分析时间内有效地分离阿莫西林、双氯西林及其主要杂质。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局. 国家药品标准WS10001（HD0620）2002.注射用氨苄西林钠氯唑西林钠[S]. 2002：7，88
[2] Snyder L R，Kirkland JJ，Glajch J L. Practical HPLC Method Development [M]，2nd ed. New York：John Wiley & Sons，Inc.，1997，a：341；b：345
[关键词]高效液相色谱 阳离子交换柱 氨苄西林 氯唑西林 含量测定
中图分类号：F407.44 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）26-165-01
注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠是氨苄西林钠和氯唑西林钠按活性成分含量1∶1组成的复方制剂。氨苄西林/氯唑西林为广谱结合型抗生素，前者对革兰阳性和阴性菌均具有良好的杀伤作用，但不能抵御β内酰胺酶对其的破坏；后者可对β内酰胺酶产生抑制作用，对产青霉素酶和不产青霉素酶的菌株均有效，两者联合应用可相互补充各自的抗菌谱，产生协同作用，提高整体的抗菌效力。目前国内已有数家药厂根据国家药品标准[1]生产本品。由于氨苄西林和氯唑西林的疏水性相差较大，在通常的反相色谱系统[1]中，氨苄西林的容量因子约为1，与有关物质的分离较差；氯唑西林的容量因子约为30，使得分析时间很长。本文建立采用阳离子交换柱的HPLC法可同时测定注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠中的氨苄西林和氯唑西林的含量，该法可在不足10min时间内有效分离氨苄西林、氯唑西林及其主要杂质。
1 仪器与试药
美国Agilent 1100型HPLC仪；色谱柱：英国Hypersil SCX（200mm×46mm，5μm）；氨苄西林和氯唑西林对照品均购自中国药品生物制品检定所；注射用氨苄西林钠/氯唑西林钠由上海新先鋒药业有限公司提供；磷酸和磷酸氢二铵均为分析纯，乙腈为HPLC级，水为蒸馏水。
2 色谱条件
流动相为磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH值为6.0）∶乙腈（90∶10）；流速10ml/min；柱温25℃；检测波长225nm；进样体积20μl。
3 方法与结果
对照品溶液 取氨苄西林和氯唑西林对照品各20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。供试品溶液 取供试品50mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。系统适用性溶液 称取供试品约50mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，室温（约25℃）放置24h，即得。氨苄西林峰和氯唑西林峰的理论板数分别约为 3500和3000，拖尾因子分别为1.0和1.1，两者间的分离度约为4.0。
3.1 线性与范围 取氨苄西林和氯唑西林对照品各20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取此液7.5、6.0、 5.0、4.0和2.5ml，分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下分别进样分析。以面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，回归方 程分别为：氨苄西林 A=16.47C+7.6 r=1.0000氯唑西林 A=45.85C+10.7 r=1.0000氨苄西林和氯唑西林分别在45～134和44～131μg/ml范围内呈良好的线性关系。
3.2 检测限和定量限氨苄西林和氯唑西林的检测限按信噪比3∶1计均为0.1μg/ml，定量限按信噪比10∶1计均为0.3μg/ml。
3.3 精密度 取同一批供试品，配制成6份溶液，分别进样分析，氨苄西林和氯唑西林含量的平均值分别为44.67%（RSD=0.5%，n=6）和44.38%（RSD=0.6%，n=6）。
3.4 耐用性 另选用2支相同品牌填料的色谱柱实验，均可得满意的色谱图。
3.5 回收率 精密量取同一份供试品溶液10ml，分别置20ml量瓶中，精密量取并加入对照品贮备液5ml，加水稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下进样分析。 测得氨苄西林和氯唑西林的平均回收率分别为99.9%（RSD=0.4%，n=6）和100.0%（RSD=0.5%，n=6）。
3.6 样品测定采用国家药品标准方法[1]对同一批供试品进行测定，测得氨苄西林和氯唑西林的含量分别为44.30%（n=3）和44.91%（n=3），与本文方法的测定结果一致。
4 讨论
离子交换HPLC法是建立在多重保留机理（如反相和离子交换）上的，一般可提供独特的色谱选择性，同时又具有简便和重现性好的特点[2]。本研究选用以硅胶为基质的强阳离子交换柱――Hypersil SCX柱进行实验。研究结果显示，缓冲液中磷酸氢二铵的浓度为0.01mol/L，pH值由5.0逐渐增至7.0时，氯唑西林的保留值显著减少，氨苄西林的保留值仅稍减弱；缓冲液pH值为6.0时，缓冲液中磷酸氢二铵的浓度由0.01mol/L逐渐增至0.025mol/L，氯唑西林的保留值显著增加，氨苄西林的保留值仅稍增强。显然，由于“盐析”效应，组分的保留随着离子强度的增加而增强，表现出类似于化合物在疏水相互作用色谱中的色谱行为。鉴于两组分在本色谱系统中的色谱行为与通常的离子交换色谱行为相反，即盐或缓冲液浓度的增加反而导 致组分保留的增强，故可以推断，Hypersil SCX填料在本色谱系统中主要表现为疏水或反相色谱行为的特征。选择缓冲液中磷酸氢二铵的浓度为0.01mol/L，pH值为6.0时，可在不足10min的分析时间内有效地分离氨苄西林、氯唑西林及其主要杂质。本色谱系统尚可用于类似品种如注射用阿莫西林钠/双氯西林钠的含量测定，唯流动相需稍作调整为磷酸盐缓冲液（0.005mol/L磷酸氢二铵溶液，用磷酸调节pH值为6.4）∶乙腈（90∶10），同样可在不足10min的分析时间内有效地分离阿莫西林、双氯西林及其主要杂质。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局. 国家药品标准WS10001（HD0620）2002.注射用氨苄西林钠氯唑西林钠[S]. 2002：7，88
[2] Snyder L R，Kirkland JJ，Glajch J L. Practical HPLC Method Development [M]，2nd ed. New York：John Wiley & Sons，Inc.，1997，a：341；b：345