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摘要[目的]对柑橘皮中的橙皮苷提取工艺进行优化，并且分析其抗菌活性。[方法]采用单因素试验和正交试验，对利用超声波辅助乙醇溶液法提取柑橘皮中橙皮苷的工艺进行优化，并且采用平板法检测提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。[结果]获得的最佳工艺条件为：浓度 50%乙醇碱性溶液，pH 11，提取时间30 min，料液比1∶30（g/ml）。在此条件下，橙皮苷的提取率为2.76%。抑菌试验显示，橙皮苷在0.15%～0.50%的浓度下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的抑菌效果。[结论]获得超声波辅助，氢氧化钠乙醇溶液法提取橙皮苷的最佳工艺，橙皮苷抑菌效果无种属特异性，具有广谱的抑菌活性。
关键词橙皮苷；提取工艺；抑菌
中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）31-033-02
Study on Extraction of Hesperidin from Ponkan Peel and Analysis of Its Bacteriostatic Activity
ZHANG Qihuan1， YAN Xin2， XU Wei1， SHAO Rong1 et al
（1. School of Marine and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051； 2. School of Chemical and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051）
Abstract[Objective] To optimize the extracted technology of hesperidin from ponkan peel and analyze its bacteriostatic activity. [Method] The ultrasonicassisted ethanol extraction of hesperidin was optimized by orthogonal test and the bacteriostatic activity against E.coli and Staphylococcus aureus were investigated using plate method. [Result] The optimal ethanol concentration， pH， extraction time and ratio of material to extractant was 50%， 11， 30 min and 1∶30 （g/ml）， respectively. The extraction ration was 2.76%. Bacteriostatic experiments showed that the hesperidin possess perfect bacteriostatic activity against E.coli and S.aureus at concentration of 0.15%-0.5%. [Conclusion] The optimal extraction technology of hesperidin was obtained form ponkan peel. Meanwhile， the bacteriostatic activity of hesperidin was broad and nonspecies related.
Key wordsHesperidin； Extraction technology； Bacteriostatic activity
橙皮苷（Hesperidin，Hsd），又名橙皮甙、陳皮甙，是一种广泛存在于柠檬、橘、柑和甜橙等的果肉和果皮中的一种天然黄酮类化合物，纯品为白色微小针状晶体，分子式C18H34O15，分子量610.57，熔点258～262 ℃，易溶于吡啶、稀碱溶液，微溶于甲醇和热冰醋酸，几乎不溶于乙醚、丙酮、苯和氯仿[1]。
橙皮苷具有抗炎、止痛[2]、免疫抑制[3]及抗癌[4]等活性，已被用于多种疾病的预防与治疗，在食品、医药等领域具有广阔的应用、开发前景[5-6]，尤其是其抗癌活性已得到众多研究者的重视。研究表明，橙皮苷可以同时作用于多个细胞信号通路蛋白，如通过活化caspases，Bcl2（Bcell lymphoma 2）和Bax（Bcl2 assocaited X protein）诱导癌细胞凋亡，还可以通过调节COX2（cyclooxygenase2）、MMP2（matrix metalloproteinase2）和MMP9抑制肿瘤的血管生成、代谢[7]。
目前，橙皮苷的提取方法主要有溶剂提取法[8-9]、碱提酸沉法[10]、微波法[11]和超声波法[12]等。但是，由于提取工艺、原料来源及评价指标的不同，产物的提取率也不尽相同。寻找一种简单、经济、有效的橙皮苷提取工艺对于综合利用橙皮、减少资源浪费和环境污染具有重要的意义。因此，笔者探讨了超声波辅助乙醇溶液法提取橙皮苷的工艺条件，并且分析了橙皮苷的抑菌活性，为橙皮苷的产业化应用提供重要的参考。
1材料与方法
1.1仪器与设备AUY220型电子分析天平，日本岛津股份有线公司；B220型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；DHG9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；UV752N紫型外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。 1.2材料与试剂新鲜柑橘，市售，取皮，置于70 ℃烘箱中干燥；橙皮苷标准品（分析纯），购于上海金穗生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.3方法
1.3.1标准曲线的绘制。精确称取橙皮苷标准品12 mg，用含0.1%NaOH的75%乙醇充分溶解且定容至50 ml，为溶液1。取30 ml溶液1，定容至50 ml，为溶液2；再取40 ml溶液2，定容至50 ml，为溶液3；然后取40 ml溶液3，定容至50 ml，为溶液4；取40 ml溶液4，定容至50 ml，为溶液5；最后配制成浓度为0.023 6～0.072 0 mg/ml的标准液。在362 nm处测定吸光值，并且绘制标准曲线，得到的回归方程为y=23.58x-0.209，R2=0.975。
1.3.2橙皮苷提取工艺流程及条件优化。橙皮苷的提取工艺流程见图1。按照该工艺流程固定固液比、乙醇浓度、提取时间、pH和乙醇浓度，分别研究各提取条件对橙皮苷提取率的影响。在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验，对料液比、乙醇浓度、pH和提取时间等因素对橙皮苷提取率的影响。
1.3.3橙皮苷含量及提取率的测定。取100～200 μl提取液于10 ml试管中，加入碱性乙醇溶液，定容至10 ml，测定样品，并且以碱性乙醇为空白，在362 nm处测定其吸光值。根据标准曲线方程，计算橙皮苷的含量、提取率。橙皮苷的提取率计算公式为：
X（%）=C×201 000×0.5×100%
式中，稀释后的橙皮苷溶液的浓度（μg/ml）。
1.4抑菌试验分别用PBS将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌配制成OD600为0.1的菌液。取0.2 ml大肠杆菌、金黄色葡萄球菌液，加入到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，立即用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。将浸渍过橘皮苷溶液（0.15%、0.30%和0.50%橙皮苷PBS溶液）的滤纸圆片风干，放到每个涂有菌液的平板上，在每个培养皿中放4个纸片。每个浓度重复3个培养皿。细菌在37 ℃下培养48 h，测定抑菌圈直径大小，确定抑菌效果。
2结果与分析
2.1橙皮苷提取的单因素试验
2.1.1料液比对橙皮苷提取率的影响。取0.5 g橙皮粉，在固定提取时间为30 min、pH为10、超声功率为200 W的条件下，考察料液比对橙皮苷提取的影响。从图2可以看出，当料液比为20～30 mg/mg時，橙皮苷提取率随料液比的增加而增加；当料液比>30 mg/mg时，提取率增加并不明显。因此，确定最佳的料液比为1∶30。
2.1.2乙醇浓度对橙皮苷提取率的影响。从图3可以看出，当乙醇浓度为60%时，橙皮苷提取率达到最高。这主要是由于橙皮苷含有酚羟基，极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。
2.1.3提取时间对橙皮苷提取率的影响。从图4可以看出，当浸提时间在30 min左右时，提取率较高，当浸提时间小于30 min或大于30 min时，产率都较低。其原因可能是橘皮苷分子中的酚性轻基在碱液作用下逐渐从橘皮中溶解出来，浸泡时间太短橘皮苷溶解不充分，而浸泡时间过长部分橘皮苷分解，体现橘皮苷在水中的不稳定性。
2.1.4pH对橙皮苷提取率的影响。从图5可以看出，当pH 9～12时，橙皮苷的提取率随溶液pH的增加而逐渐提高，在pH 12时橙皮苷的提取率最高。这可能是由于橙皮苷易溶于碱性溶液，碱性乙醇提取剂更有利于橙皮苷溶解，当达到橙皮苷的最适宜溶解条件时，橙皮苷的提取率明显提高。当溶液pH 12～13时，橙皮苷的提取率趋于平稳且略微下降，并且产生有刺激性气味的气体。这可能是由于在强碱性提取环境下，橙皮苷的某些化学结构发生变化，使得橙皮苷变性，提取率下降。
2.2橙皮苷提取的正交试验在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，优化提取时间、pH、料液比和乙醇浓度4个因素，确定最佳提取条件。正交试验设计如表1所示。
由表2可知，影响橘皮中橙皮苷提取率的因素依次是提取时间、乙醇浓度、溶液pH、料液比。其中，提取时间是影响橙皮苷提取率的主要因素。通过正交试验，确定橘皮中橙皮苷提取的最佳工艺条件为A2B1C2D2，即料液比为1∶40，乙
关键词橙皮苷；提取工艺；抑菌
中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）31-033-02
Study on Extraction of Hesperidin from Ponkan Peel and Analysis of Its Bacteriostatic Activity
ZHANG Qihuan1， YAN Xin2， XU Wei1， SHAO Rong1 et al
（1. School of Marine and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051； 2. School of Chemical and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng， Jiangsu 224051）
Abstract[Objective] To optimize the extracted technology of hesperidin from ponkan peel and analyze its bacteriostatic activity. [Method] The ultrasonicassisted ethanol extraction of hesperidin was optimized by orthogonal test and the bacteriostatic activity against E.coli and Staphylococcus aureus were investigated using plate method. [Result] The optimal ethanol concentration， pH， extraction time and ratio of material to extractant was 50%， 11， 30 min and 1∶30 （g/ml）， respectively. The extraction ration was 2.76%. Bacteriostatic experiments showed that the hesperidin possess perfect bacteriostatic activity against E.coli and S.aureus at concentration of 0.15%-0.5%. [Conclusion] The optimal extraction technology of hesperidin was obtained form ponkan peel. Meanwhile， the bacteriostatic activity of hesperidin was broad and nonspecies related.
Key wordsHesperidin； Extraction technology； Bacteriostatic activity
橙皮苷（Hesperidin，Hsd），又名橙皮甙、陳皮甙，是一种广泛存在于柠檬、橘、柑和甜橙等的果肉和果皮中的一种天然黄酮类化合物，纯品为白色微小针状晶体，分子式C18H34O15，分子量610.57，熔点258～262 ℃，易溶于吡啶、稀碱溶液，微溶于甲醇和热冰醋酸，几乎不溶于乙醚、丙酮、苯和氯仿[1]。
橙皮苷具有抗炎、止痛[2]、免疫抑制[3]及抗癌[4]等活性，已被用于多种疾病的预防与治疗，在食品、医药等领域具有广阔的应用、开发前景[5-6]，尤其是其抗癌活性已得到众多研究者的重视。研究表明，橙皮苷可以同时作用于多个细胞信号通路蛋白，如通过活化caspases，Bcl2（Bcell lymphoma 2）和Bax（Bcl2 assocaited X protein）诱导癌细胞凋亡，还可以通过调节COX2（cyclooxygenase2）、MMP2（matrix metalloproteinase2）和MMP9抑制肿瘤的血管生成、代谢[7]。
目前，橙皮苷的提取方法主要有溶剂提取法[8-9]、碱提酸沉法[10]、微波法[11]和超声波法[12]等。但是，由于提取工艺、原料来源及评价指标的不同，产物的提取率也不尽相同。寻找一种简单、经济、有效的橙皮苷提取工艺对于综合利用橙皮、减少资源浪费和环境污染具有重要的意义。因此，笔者探讨了超声波辅助乙醇溶液法提取橙皮苷的工艺条件，并且分析了橙皮苷的抑菌活性，为橙皮苷的产业化应用提供重要的参考。
1材料与方法
1.1仪器与设备AUY220型电子分析天平，日本岛津股份有线公司；B220型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；DHG9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；UV752N紫型外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。 1.2材料与试剂新鲜柑橘，市售，取皮，置于70 ℃烘箱中干燥；橙皮苷标准品（分析纯），购于上海金穗生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.3方法
1.3.1标准曲线的绘制。精确称取橙皮苷标准品12 mg，用含0.1%NaOH的75%乙醇充分溶解且定容至50 ml，为溶液1。取30 ml溶液1，定容至50 ml，为溶液2；再取40 ml溶液2，定容至50 ml，为溶液3；然后取40 ml溶液3，定容至50 ml，为溶液4；取40 ml溶液4，定容至50 ml，为溶液5；最后配制成浓度为0.023 6～0.072 0 mg/ml的标准液。在362 nm处测定吸光值，并且绘制标准曲线，得到的回归方程为y=23.58x-0.209，R2=0.975。
1.3.2橙皮苷提取工艺流程及条件优化。橙皮苷的提取工艺流程见图1。按照该工艺流程固定固液比、乙醇浓度、提取时间、pH和乙醇浓度，分别研究各提取条件对橙皮苷提取率的影响。在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验，对料液比、乙醇浓度、pH和提取时间等因素对橙皮苷提取率的影响。
1.3.3橙皮苷含量及提取率的测定。取100～200 μl提取液于10 ml试管中，加入碱性乙醇溶液，定容至10 ml，测定样品，并且以碱性乙醇为空白，在362 nm处测定其吸光值。根据标准曲线方程，计算橙皮苷的含量、提取率。橙皮苷的提取率计算公式为：
X（%）=C×201 000×0.5×100%
式中，稀释后的橙皮苷溶液的浓度（μg/ml）。
1.4抑菌试验分别用PBS将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌配制成OD600为0.1的菌液。取0.2 ml大肠杆菌、金黄色葡萄球菌液，加入到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，立即用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。将浸渍过橘皮苷溶液（0.15%、0.30%和0.50%橙皮苷PBS溶液）的滤纸圆片风干，放到每个涂有菌液的平板上，在每个培养皿中放4个纸片。每个浓度重复3个培养皿。细菌在37 ℃下培养48 h，测定抑菌圈直径大小，确定抑菌效果。
2结果与分析
2.1橙皮苷提取的单因素试验
2.1.1料液比对橙皮苷提取率的影响。取0.5 g橙皮粉，在固定提取时间为30 min、pH为10、超声功率为200 W的条件下，考察料液比对橙皮苷提取的影响。从图2可以看出，当料液比为20～30 mg/mg時，橙皮苷提取率随料液比的增加而增加；当料液比>30 mg/mg时，提取率增加并不明显。因此，确定最佳的料液比为1∶30。
2.1.2乙醇浓度对橙皮苷提取率的影响。从图3可以看出，当乙醇浓度为60%时，橙皮苷提取率达到最高。这主要是由于橙皮苷含有酚羟基，极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。
2.1.3提取时间对橙皮苷提取率的影响。从图4可以看出，当浸提时间在30 min左右时，提取率较高，当浸提时间小于30 min或大于30 min时，产率都较低。其原因可能是橘皮苷分子中的酚性轻基在碱液作用下逐渐从橘皮中溶解出来，浸泡时间太短橘皮苷溶解不充分，而浸泡时间过长部分橘皮苷分解，体现橘皮苷在水中的不稳定性。
2.1.4pH对橙皮苷提取率的影响。从图5可以看出，当pH 9～12时，橙皮苷的提取率随溶液pH的增加而逐渐提高，在pH 12时橙皮苷的提取率最高。这可能是由于橙皮苷易溶于碱性溶液，碱性乙醇提取剂更有利于橙皮苷溶解，当达到橙皮苷的最适宜溶解条件时，橙皮苷的提取率明显提高。当溶液pH 12～13时，橙皮苷的提取率趋于平稳且略微下降，并且产生有刺激性气味的气体。这可能是由于在强碱性提取环境下，橙皮苷的某些化学结构发生变化，使得橙皮苷变性，提取率下降。
2.2橙皮苷提取的正交试验在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，优化提取时间、pH、料液比和乙醇浓度4个因素，确定最佳提取条件。正交试验设计如表1所示。
由表2可知，影响橘皮中橙皮苷提取率的因素依次是提取时间、乙醇浓度、溶液pH、料液比。其中，提取时间是影响橙皮苷提取率的主要因素。通过正交试验，确定橘皮中橙皮苷提取的最佳工艺条件为A2B1C2D2，即料液比为1∶40，乙