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【摘要】 目的 探讨中国汉族人群系膜增生性肾炎与TCRCα基因+1592C/T多态性的相关关系。方法 用PCRRFLP法和PCR产物直接测序法鉴定基因型,采用病例对照的方法。结果 280例患者中,TCRCα+1592C/T存在三种基因型,CC基因型为多见,CC∶CT∶TT=213∶65∶2,IgA肾病组与192例正常对照组相比较,不论是基因型还是等位基因,均未发现差异有统计学意义(P>0.05)。结论 中国汉族人群中,系膜增生性肾炎可能与TCRCα基因+1592C/T的遗传易感性不相关,TCRCα基因+1592C/T可能不是系膜增生性肾炎的疾病传递不平衡连锁基因碱基位点。
【关键词】 系膜增生性肾炎;TCRCα;相关; 基因;多态性
文章编号:1003-1383(2010)04-0391-02 中图分类号:R 692.39 文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.005
T细胞受体(Tcell receptor,TCR)和补体在T细胞活化和抗原识别中起作用。系膜增生性肾炎是各类肾小球肾炎中最多见的病理类型,炎症与免疫是其主要病理生理机制。TCR基因由于直接相关最重要的免疫调节机制,是系膜增生性肾炎最重要候选基因之一。TCR保守域α链基因(TCRCα)编码TCRα链近膜端保守域的氨基酸,位于14号染色体14q11～14q12。TCRCα+1592C/T 位于TCRCα 基因片段第一外显子下游内含子区域。近年遗传学基础研究越来越表明,内含子在选择性剪接中扮演重要角色,一个基因可以因此而产生多种不同的蛋白质[1]。TCRCα+1592C/T与系膜增生性肾炎遗传易感性相关关系如何?此位点碱基变异的意义尚缺乏研究。为此,本研究采用病例对照研究的方法,探讨中国汉族人群中,系膜增生性肾炎与TCRCα基因+1592C/T多态性的相关关系。为进一步揭示TCRCα 在系膜增生性肾炎的遗传学机制中的意义提供资料。
对象和方法
1.对象 280例行肾活检为系膜增生性肾炎的原发肾小球肾炎的患者,均为我院1999～2009年收治的住院与门诊患者,男163例,女117例,平均年龄(27.8±17.5)岁,均系汉族人。以192例本地区汉族健康正常献血者,既往无肾脏病及其它系统性疾病病史的为正常对照组。诊断严格按WHO标准[2],采集血样。
2.基因组DNA提取 抽取外周抗凝血5 ml,采用QIAamp DNA kit抽提DNA,严格按照试剂盒说明书操作。
3.TCRCα+1592C/T内含子C/T基因型鉴定 PCR扩增含有(内含子C/T)单核苷酸多态性的TCRCα基因第一外显子下游内含子基因片段(chr14:2208739422088111),长718 bp。上游引物序列为5′TTCAAGCAGGGAAGGGACACC3′,下游引物序列为5′TCCAATGAGGCAGCGAGGCA3′(上海申友生物工程公司合成)。PCR反应条件:94 ℃预变性9 min,94 ℃变性35 s,57 ℃退火55 s,72 ℃延伸55 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR反应体积为30 μl。 以SDU内切(美国MBI公司)37 ℃消化PCR产物,20 g/L凝胶电泳分带,确定基因型。
4.PCR产物直接测序 取PCR产物10例测序。方法
为:纯化的DNA模板20 ng,BigDye terminator cycle sequen cing ready reaction kit mix 2 μl,测序引物(同PCR扩增引物)10 pmol/μl组成8 μl反应体系进行测序PCR。反应条件:98 ℃ 1 min,96 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,60 ℃ 4 min,25个循环。3 mol/L乙酸钠(pH 5.2)和无水乙醇沉淀扩增的DNA,再用体积分数为75%乙醇洗涤1次,然后加入18 μl模板变性剂TSR(template suppression reagent)。测序模板在95 ℃水浴5 min,立即置于冰水中5 min将其淬灭成单链,转移至测序管,在ABI3100 全自动序列分析仪上进行毛细管电泳测序[3]。
5.统计学处理采用HardyWeinberg平衡吻合度检验对照组群体代表性;计数资料的比较采用χ2或秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.TCRCα+1592C/T基因型 TCRCα基因内含子C/T多态性的PCR产物长度为718 bp,在扩增片段上有内含子C/T单核苷酸多态性,酶切后CC型为1条718片段(2、3、4、5、6、8、10),TT型产生461 bp、257 bp两条片段(1),CT型则为718 bp、461 bp、257 bp 3条片段(7、9、11)。见图1。该位点多态性经抽样测序鉴定,证实同电泳结果相同。
2.HardyWeinberg遗传平衡符合程度的χ2检验 经检验对照组TCRCα+1592C/T多态性的基因型频率符合遗传平衡定律(χ2 = 1.74, P=0.19>0.05),表明各基因频率已达到遗传平衡,具有群体代表性。
3.两组基因型、等位基因分布比较 不论是基因型还是等位基因,均未发现差异有统计学意义(P>0.05)。见表1。
讨论
遗传性因素在IgA肾病等以系膜增生为主的原发肾小球肾炎的病理发病机制中具有重要地位[4]。但其分子遗传学机制远未阐明。TCR基因位于人第14号染色体上,包括TCR可变区基因片段(V)、多样性基因片段(D)、连接基因片段(J)和保守域基因片段(C)片段,不同亚型的TCR分布于CD4、CD8、CD25等各种T淋巴细胞表面。TCR基因各片段具有众多的复杂的基因多态性。近年内含子的基因性状对遗传效应的贡献得到重视[1]。
病例对照结果显示:不论是基因型还是等位基因,均无统计学意义(P>0.05)。这提示TCRCα基因+1592C/T多态性可能与系膜增生性肾炎的遗传易感性不相关。研究发现,中国汉族人群TCRCα基因575A/G多态性可能与肾炎系膜增生、肉眼血尿的发生相关[3],TCRCα基因560C/T多态性可能与IgA肾病蛋白尿的发生及肾脏病理有一定关联性[5];TCRCα基因575A/G及TCRCα基因560C/T多态性均找到一些与肾脏病相关的关系,但对TCRCα基因+1592C/T多态性位点的基因变异,目前国际上尚无其他种族人群的研究作参考。近年有人利用家族中传递不平衡检验和单体型相对风险分析的研究方法,进一步证实了TCRCα基因多个单体型板块均与我国汉族人IgA肾病的遗传易感性密切相关,呈强连锁不平衡关系[6]。这表明地域与种族差异可以对基因特征产生很大的影响,进而对某种疾病可能起到遗传学意义上的作用。但TCRCα基因+1592C/T多态性作为第一外显子下游内含子区域的多个多态性位点之一,一方面,作为内含子,本身对基因的表型及转录起的作用可能比不上调控区及外显子区大;另一方面,此位点的碱基变异,因发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域,可能的确对整个稳定区基因片段的总体特性没什么大的影响。故推测TCRCα基因+1592C/T可能对TCRCα的转录、翻译影响力弱,进而不会与系膜增生性肾炎的发病风险有关联。
综上所述,广西汉族人群中,系膜增生性肾炎的发病易感性可能和TCRCα基因+1592C/T基因型或等位基因无相关关系,TCRCα基因+1592C/T可能不是系膜增生性肾炎的疾病传递不平衡连锁基因碱基位点。系膜增生性肾炎的临床、病理表现形式多种多样,而且TCRCα基因多态性位点众多,哪些位点是疾病连锁的重要碱基变异,仍需继续研究探讨。
参考文献
[1]Gudikote JP, Wilkinson MF.Tcell receptor sequences that elicit strong downregulation of premature termination codonbearing transcripts[J].EMBO J,2002,21(1～2):125-134.
[2]Churg J,Bernstein J,Glassock RJ. Renal disease classification and atlas of glomerulardisease[M].Second edition.New York: Ikagu Shoin,1995:45-47.
[3]薛 超,李幼姬,李彩霞,等. 中国汉族人群TCRCα基因575A/G多态性与IgA肾病临床病理相关分析[J].第四军医大学学报,2005,26(22):2079-2081.
[4]Maixnerová D, Merta M, Reiterová J, et al.The pathogenetic aspects and gene polymorphisms of IgA nephropathy[J].Prague Med Rep,2006,107(2):171-188.
[5]薛 超, 李幼姬,李彩霞,等. TCRCa560 C/T多态性与IgA肾病临床病理的关联分析[J].第四军医大学学报, 2005,26(10):897-900.
[6]Li R,Xue C,Li C,et al.TRAC variants associate with IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(6):1359-1367.
(收稿日期:2010-07-20 修回日期:2010-08-02)
(编辑:潘明志 英文审校:钟京梓)
【关键词】 系膜增生性肾炎;TCRCα;相关; 基因;多态性
文章编号:1003-1383(2010)04-0391-02 中图分类号:R 692.39 文献标识码:A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.005
T细胞受体(Tcell receptor,TCR)和补体在T细胞活化和抗原识别中起作用。系膜增生性肾炎是各类肾小球肾炎中最多见的病理类型,炎症与免疫是其主要病理生理机制。TCR基因由于直接相关最重要的免疫调节机制,是系膜增生性肾炎最重要候选基因之一。TCR保守域α链基因(TCRCα)编码TCRα链近膜端保守域的氨基酸,位于14号染色体14q11～14q12。TCRCα+1592C/T 位于TCRCα 基因片段第一外显子下游内含子区域。近年遗传学基础研究越来越表明,内含子在选择性剪接中扮演重要角色,一个基因可以因此而产生多种不同的蛋白质[1]。TCRCα+1592C/T与系膜增生性肾炎遗传易感性相关关系如何?此位点碱基变异的意义尚缺乏研究。为此,本研究采用病例对照研究的方法,探讨中国汉族人群中,系膜增生性肾炎与TCRCα基因+1592C/T多态性的相关关系。为进一步揭示TCRCα 在系膜增生性肾炎的遗传学机制中的意义提供资料。
对象和方法
1.对象 280例行肾活检为系膜增生性肾炎的原发肾小球肾炎的患者,均为我院1999～2009年收治的住院与门诊患者,男163例,女117例,平均年龄(27.8±17.5)岁,均系汉族人。以192例本地区汉族健康正常献血者,既往无肾脏病及其它系统性疾病病史的为正常对照组。诊断严格按WHO标准[2],采集血样。
2.基因组DNA提取 抽取外周抗凝血5 ml,采用QIAamp DNA kit抽提DNA,严格按照试剂盒说明书操作。
3.TCRCα+1592C/T内含子C/T基因型鉴定 PCR扩增含有(内含子C/T)单核苷酸多态性的TCRCα基因第一外显子下游内含子基因片段(chr14:2208739422088111),长718 bp。上游引物序列为5′TTCAAGCAGGGAAGGGACACC3′,下游引物序列为5′TCCAATGAGGCAGCGAGGCA3′(上海申友生物工程公司合成)。PCR反应条件:94 ℃预变性9 min,94 ℃变性35 s,57 ℃退火55 s,72 ℃延伸55 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR反应体积为30 μl。 以SDU内切(美国MBI公司)37 ℃消化PCR产物,20 g/L凝胶电泳分带,确定基因型。
4.PCR产物直接测序 取PCR产物10例测序。方法
为:纯化的DNA模板20 ng,BigDye terminator cycle sequen cing ready reaction kit mix 2 μl,测序引物(同PCR扩增引物)10 pmol/μl组成8 μl反应体系进行测序PCR。反应条件:98 ℃ 1 min,96 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,60 ℃ 4 min,25个循环。3 mol/L乙酸钠(pH 5.2)和无水乙醇沉淀扩增的DNA,再用体积分数为75%乙醇洗涤1次,然后加入18 μl模板变性剂TSR(template suppression reagent)。测序模板在95 ℃水浴5 min,立即置于冰水中5 min将其淬灭成单链,转移至测序管,在ABI3100 全自动序列分析仪上进行毛细管电泳测序[3]。
5.统计学处理采用HardyWeinberg平衡吻合度检验对照组群体代表性;计数资料的比较采用χ2或秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.TCRCα+1592C/T基因型 TCRCα基因内含子C/T多态性的PCR产物长度为718 bp,在扩增片段上有内含子C/T单核苷酸多态性,酶切后CC型为1条718片段(2、3、4、5、6、8、10),TT型产生461 bp、257 bp两条片段(1),CT型则为718 bp、461 bp、257 bp 3条片段(7、9、11)。见图1。该位点多态性经抽样测序鉴定,证实同电泳结果相同。
2.HardyWeinberg遗传平衡符合程度的χ2检验 经检验对照组TCRCα+1592C/T多态性的基因型频率符合遗传平衡定律(χ2 = 1.74, P=0.19>0.05),表明各基因频率已达到遗传平衡,具有群体代表性。
3.两组基因型、等位基因分布比较 不论是基因型还是等位基因,均未发现差异有统计学意义(P>0.05)。见表1。
讨论
遗传性因素在IgA肾病等以系膜增生为主的原发肾小球肾炎的病理发病机制中具有重要地位[4]。但其分子遗传学机制远未阐明。TCR基因位于人第14号染色体上,包括TCR可变区基因片段(V)、多样性基因片段(D)、连接基因片段(J)和保守域基因片段(C)片段,不同亚型的TCR分布于CD4、CD8、CD25等各种T淋巴细胞表面。TCR基因各片段具有众多的复杂的基因多态性。近年内含子的基因性状对遗传效应的贡献得到重视[1]。
病例对照结果显示:不论是基因型还是等位基因,均无统计学意义(P>0.05)。这提示TCRCα基因+1592C/T多态性可能与系膜增生性肾炎的遗传易感性不相关。研究发现,中国汉族人群TCRCα基因575A/G多态性可能与肾炎系膜增生、肉眼血尿的发生相关[3],TCRCα基因560C/T多态性可能与IgA肾病蛋白尿的发生及肾脏病理有一定关联性[5];TCRCα基因575A/G及TCRCα基因560C/T多态性均找到一些与肾脏病相关的关系,但对TCRCα基因+1592C/T多态性位点的基因变异,目前国际上尚无其他种族人群的研究作参考。近年有人利用家族中传递不平衡检验和单体型相对风险分析的研究方法,进一步证实了TCRCα基因多个单体型板块均与我国汉族人IgA肾病的遗传易感性密切相关,呈强连锁不平衡关系[6]。这表明地域与种族差异可以对基因特征产生很大的影响,进而对某种疾病可能起到遗传学意义上的作用。但TCRCα基因+1592C/T多态性作为第一外显子下游内含子区域的多个多态性位点之一,一方面,作为内含子,本身对基因的表型及转录起的作用可能比不上调控区及外显子区大;另一方面,此位点的碱基变异,因发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域,可能的确对整个稳定区基因片段的总体特性没什么大的影响。故推测TCRCα基因+1592C/T可能对TCRCα的转录、翻译影响力弱,进而不会与系膜增生性肾炎的发病风险有关联。
综上所述,广西汉族人群中,系膜增生性肾炎的发病易感性可能和TCRCα基因+1592C/T基因型或等位基因无相关关系,TCRCα基因+1592C/T可能不是系膜增生性肾炎的疾病传递不平衡连锁基因碱基位点。系膜增生性肾炎的临床、病理表现形式多种多样,而且TCRCα基因多态性位点众多,哪些位点是疾病连锁的重要碱基变异,仍需继续研究探讨。
参考文献
[1]Gudikote JP, Wilkinson MF.Tcell receptor sequences that elicit strong downregulation of premature termination codonbearing transcripts[J].EMBO J,2002,21(1～2):125-134.
[2]Churg J,Bernstein J,Glassock RJ. Renal disease classification and atlas of glomerulardisease[M].Second edition.New York: Ikagu Shoin,1995:45-47.
[3]薛 超,李幼姬,李彩霞,等. 中国汉族人群TCRCα基因575A/G多态性与IgA肾病临床病理相关分析[J].第四军医大学学报,2005,26(22):2079-2081.
[4]Maixnerová D, Merta M, Reiterová J, et al.The pathogenetic aspects and gene polymorphisms of IgA nephropathy[J].Prague Med Rep,2006,107(2):171-188.
[5]薛 超, 李幼姬,李彩霞,等. TCRCa560 C/T多态性与IgA肾病临床病理的关联分析[J].第四军医大学学报, 2005,26(10):897-900.
[6]Li R,Xue C,Li C,et al.TRAC variants associate with IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(6):1359-1367.
(收稿日期:2010-07-20 修回日期:2010-08-02)
(编辑:潘明志 英文审校:钟京梓)