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【摘要】目的 建立消糖灵颗粒中黄芪的含量测定方法。方法 采用反相高效液相法进行黄芪中黄芪甲苷的含量测定,采用Kromasil C18色谱柱(200×4.6mm,5μ);以乙腈-水(32:68)为流动相,流速:1.0mL/min;柱温:40℃;采用蒸发光散射检测器:漂移管温度:105℃;载气流量:2.5L·min-1。结果 线性范围2.0-8.0μg,相关系数r=0.9995。平均回收率为102.5%(n=5),RSD=1.7%。结论 该方法为评价和控制消糖灵颗粒的质量提供了依据。
【关键词】消糖灵颗粒黄芪甲苷HPLC-ELSD含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)08-0-01
消糖灵颗粒主要由黄芪、人参、天花粉等十一味中药以及格列本脲组成,是从部颁标准中药成方制剂消糖灵片改剂型而来。具有益气养阴,清热泻火,益肾缩尿之功效,用于糖尿病。原制剂的质量控制相对简单,仅有薄层鉴别以及格列本脲的含量测定,不能完全反映制剂的质量及临床疗效,我们通过研究,对消糖灵颗粒中的中药黄芪进行含量测定,以评价和控制制剂的质量。
1 仪器与试药
Waters 600E型高效液相色谱泵,Alltech 2000型蒸发光散射检测器,Millennium32色谱工作站数据处理系统。乙腈(色谱纯),重蒸馏水(新鲜制备),其余试剂均为分析纯。黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所提供)。消糖灵颗粒由黑龙江中医药大学中医药研究院提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Kromasil C18柱(4.6×200mm,5μ);流动相:乙腈-水(32:68);柱温:40℃;流速,1.0ml/min。ELSD条件:漂移管温度:105℃;载气流量:2.5L·min-1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇溶解制成每1ml含黄芪甲苷0.40mg的溶液,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品约10g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚50ml回流提取3小时,弃去乙醚提取液,药渣及滤纸筒挥干乙醚,加甲醇60ml回流提取约8小时,至提取液近无色,将甲醇提取液蒸干,残渣加水20ml微热使溶解,用水饱和的正丁醇提取5次(30,20,20,20,20ml),合并正丁醇层,用氨试液洗2次,每次30ml,弃去氨试液,正丁醇层用正丁醇饱和的水20ml洗一次,分取正丁醇层,蒸干,残渣加甲醇溶解并定容于10ml量瓶中,摇匀,以0.45μm滤膜滤过,即得。
2.4 线性范围
分别精密吸取上述对照品溶液5、8、10、15、20μL,注入液相色谱仪,以峰面积的自然对数值为纵坐标,以进样量(μg)的自然对数值为横坐标进行线性回归,其回归方程为:Y=1.6102X+12.1543(r=0.999 5)。表明黄芪甲苷在2.0-8.0μg范围内线性关系良好。因该标准曲线不过原点,所以样品采用外标两点法测定。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液连续进样5次,每次5μl,RSD=0.6%。
2.6 稳定性试验
供试品溶液制备完成后,分别在0、2、8、12、24小时进样记录色谱图及峰面积值,并计算含量值,结果供试品溶液稳定性良好,RSD=1.3%(n=5)。
2.7 重现性试验
取同一批样品按“供试品溶液的制备”项下制备5份供试液,分别进样测定,计算含量,RSD=1.5%(n=5)。
2.8 加样回收率试验
取已知含量(0.3512mg·g-1)的消糖灵颗粒约5g,共5份,精密称定,每份精密加入黄芪甲苷对照品1.8mg, 按“供试品溶液的制备”项下处理并测定,计算平均回收率为102.5%,RSD=1.7%(n=5)。
2.9 样品测定
分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl及供试品溶液15μl,注入液相色谱仪中,将峰面积及浓度均取自然对数后用外标两点法计算,求出供试品浓度的自然对数,再转换成供试品的含量即得。样品含量测定结果见表1,对照品及供试品色谱图见图1。
3 讨论
(1)因黄芪甲苷紫外吸收较差,是末端吸收,若用紫外检测器检测,则其灵敏度低,干扰较大,重现性较差,尤其对于复方制剂,测定其含量更加困难。薄层扫描法的稳定性和重现性相对较差,且操作繁琐。近几年来,HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量的文献[1]有报道,其灵敏度、稳定性及重现性均能符合含量测定的要求。本试验即参考了文献中的条件,考察了蒸发光检测器的漂移管温度和雾化器气体流量对黄芪甲苷的响应值的影响,选择了最优的温度和载气氮气的流速。
黄芪甲苷在黄芪药材中含量较少,黄芪中另含其衍生物及乙酰化物。在制备供试品溶液过程中,碱处理后黄芪甲苷的含量高于非碱处理,其原因可能是因为碱液处理过程使黄芪甲苷的衍生物及乙酰化物水解所致。
参考文献
[1]赵灵芝,朱丹尼,严永清.HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].药物分析杂志,1999,19(6);403.
作者单位:
1.黑龙江中医药大学附属第一医院150040
2.黑龙江中医药大学2007级高校教师在职硕士研究生150040
3.黑龙江中医药大学中医药研究院150040
【关键词】消糖灵颗粒黄芪甲苷HPLC-ELSD含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)08-0-01
消糖灵颗粒主要由黄芪、人参、天花粉等十一味中药以及格列本脲组成,是从部颁标准中药成方制剂消糖灵片改剂型而来。具有益气养阴,清热泻火,益肾缩尿之功效,用于糖尿病。原制剂的质量控制相对简单,仅有薄层鉴别以及格列本脲的含量测定,不能完全反映制剂的质量及临床疗效,我们通过研究,对消糖灵颗粒中的中药黄芪进行含量测定,以评价和控制制剂的质量。
1 仪器与试药
Waters 600E型高效液相色谱泵,Alltech 2000型蒸发光散射检测器,Millennium32色谱工作站数据处理系统。乙腈(色谱纯),重蒸馏水(新鲜制备),其余试剂均为分析纯。黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所提供)。消糖灵颗粒由黑龙江中医药大学中医药研究院提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Kromasil C18柱(4.6×200mm,5μ);流动相:乙腈-水(32:68);柱温:40℃;流速,1.0ml/min。ELSD条件:漂移管温度:105℃;载气流量:2.5L·min-1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇溶解制成每1ml含黄芪甲苷0.40mg的溶液,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品约10g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚50ml回流提取3小时,弃去乙醚提取液,药渣及滤纸筒挥干乙醚,加甲醇60ml回流提取约8小时,至提取液近无色,将甲醇提取液蒸干,残渣加水20ml微热使溶解,用水饱和的正丁醇提取5次(30,20,20,20,20ml),合并正丁醇层,用氨试液洗2次,每次30ml,弃去氨试液,正丁醇层用正丁醇饱和的水20ml洗一次,分取正丁醇层,蒸干,残渣加甲醇溶解并定容于10ml量瓶中,摇匀,以0.45μm滤膜滤过,即得。
2.4 线性范围
分别精密吸取上述对照品溶液5、8、10、15、20μL,注入液相色谱仪,以峰面积的自然对数值为纵坐标,以进样量(μg)的自然对数值为横坐标进行线性回归,其回归方程为:Y=1.6102X+12.1543(r=0.999 5)。表明黄芪甲苷在2.0-8.0μg范围内线性关系良好。因该标准曲线不过原点,所以样品采用外标两点法测定。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液连续进样5次,每次5μl,RSD=0.6%。
2.6 稳定性试验
供试品溶液制备完成后,分别在0、2、8、12、24小时进样记录色谱图及峰面积值,并计算含量值,结果供试品溶液稳定性良好,RSD=1.3%(n=5)。
2.7 重现性试验
取同一批样品按“供试品溶液的制备”项下制备5份供试液,分别进样测定,计算含量,RSD=1.5%(n=5)。
2.8 加样回收率试验
取已知含量(0.3512mg·g-1)的消糖灵颗粒约5g,共5份,精密称定,每份精密加入黄芪甲苷对照品1.8mg, 按“供试品溶液的制备”项下处理并测定,计算平均回收率为102.5%,RSD=1.7%(n=5)。
2.9 样品测定
分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl及供试品溶液15μl,注入液相色谱仪中,将峰面积及浓度均取自然对数后用外标两点法计算,求出供试品浓度的自然对数,再转换成供试品的含量即得。样品含量测定结果见表1,对照品及供试品色谱图见图1。
3 讨论
(1)因黄芪甲苷紫外吸收较差,是末端吸收,若用紫外检测器检测,则其灵敏度低,干扰较大,重现性较差,尤其对于复方制剂,测定其含量更加困难。薄层扫描法的稳定性和重现性相对较差,且操作繁琐。近几年来,HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量的文献[1]有报道,其灵敏度、稳定性及重现性均能符合含量测定的要求。本试验即参考了文献中的条件,考察了蒸发光检测器的漂移管温度和雾化器气体流量对黄芪甲苷的响应值的影响,选择了最优的温度和载气氮气的流速。
黄芪甲苷在黄芪药材中含量较少,黄芪中另含其衍生物及乙酰化物。在制备供试品溶液过程中,碱处理后黄芪甲苷的含量高于非碱处理,其原因可能是因为碱液处理过程使黄芪甲苷的衍生物及乙酰化物水解所致。
参考文献
[1]赵灵芝,朱丹尼,严永清.HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].药物分析杂志,1999,19(6);403.
作者单位:
1.黑龙江中医药大学附属第一医院150040
2.黑龙江中医药大学2007级高校教师在职硕士研究生150040
3.黑龙江中医药大学中医药研究院150040