论文部分内容阅读
[摘要] 目的 观察类风湿关节炎患者血清和关节滑液中Ghrelin和TNF-α水平，探讨二者在RA关节滑膜炎性病变中的免疫调节作用。 方法 采用酶免疫分析方法检测36例活动期RA患者与36例正常对照人群血清和关节滑液中Ghrelin和TNF-α水平，分析二者的相关性。 结果 活动期RA患者血清Ghrelin水平显著低于正常对照组（P＜0.05），而TNF-α水平明显高于正常对照组（P＜0.01）；RA患者血清中Ghrelin与TNF-α水平无显著相关性（r=0.364，P＞0.05）。活动期RA患者关节滑液Ghrelin和TNF-α水平均显著高于血清（P＜0.05），并且Ghrelin与TNF-α水平呈负相关（r=0.819，P＜0.05）。 结论 RA患者血清中Ghrelin水平降低，TNF-α水平升高；关节滑液中Ghrelin和TNF-α水平高于血清，且滑液中Ghrelin与TNF-α呈显著负相关。提示Ghrelin可能与TNF-α共同参与RA的发病过程。
[关键词] 类风湿关节炎；血清；滑膜液；Ghrelin；肿瘤坏死因子-α
[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）08-18-03
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及关节的慢性炎症性疾病，以炎症、关节滑膜增生和免疫功能异常为主要病理生理特征。RA病变呈持续性、反复发作性，造成关节进行性破坏，出现不同程度的功能障碍。RA的病因和发病机制迄今尚不明了，亦无针对性治疗措施。近来的研究表明，自身免疫和非特异性炎症反应是导致RA关节软骨和骨质破坏的重要因素。Ghrelin是内源性增食欲肽，可调节摄食行为和能量代谢；Ghrelin具有抗炎作用，可下调促炎症性细胞因子，在多种炎症性疾病包括RA中其水平可发生变化[1-3]。TNF-α是炎症发生和发展的关键性细胞因子，近10多年来TNF-α拮抗剂作为抗炎症性药物已用于RA患者的治疗[4]。Gonzalez-Gay的研究发现，给重度RA患者静脉灌注抗TNF-α单抗（infliximab）后血清Ghrelin水平显著升高，说明阻断TNF-α可促进机体内Ghrelin的分泌，TNF-α和Ghrelin在炎症反应中具有相互调节作用[5]。本研究拟检测RA患者血清和关节滑液中TNF-α和Ghrelin水平的变化，并分析两者之间的相关性，为进一步探讨RA的发病机制和治疗策略提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择第四军医大学唐都医院风湿免疫科收治的36例活动期RA患者，临床诊断均符合美国风湿病学会1987修订的RA分类诊断标准，其中男11例，女25例，平均年龄（48±12）岁，这些患者均无其他慢性病史，未接受过激素或免疫抑制剂治疗。健康对照组36例为本院健康体检者，男12例，女24例，平均年龄（42±11）岁。
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集 RA组与正常组均于清晨8：00～9：00，空腹采取肘静脉血5 mL，注入试管待凝固后，4℃ 3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-70℃冰箱保存待测。另对RA患者均接受膝关节外上方为穿刺点，用无菌注射器收集关节滑液4 mL。于2 000 r/min离心10 min，收集上清液，保存于-70℃冰箱保存待测。上述所有操作均在征得患者同意后实施。
1.2.2 血清和关节滑液Ghrelin水平测定 Ghrelin检测EIA试剂盒购自ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories）公司，EIA法检测的具体操作步骤按试剂盒说明书进行，主要程序如下：（1）空白孔内依次滴加标准品、血清或滑液样品100 µL；（2）标准品或样品孔中加入酶标记液50 µL，37℃孵育反应60 min；（3）洗板机清洗5次；（4）在标准品或样品孔中加入底物A、B液各50 µL，37℃避光孵育反应15 min；（5）每孔加入终止液50 µL，终止反应；（6）混匀，用酶标仪检测各孔的A值（450 nm滤色片）。
1.3 统计学分析
实验数据均用（）表示，两组间比较采用t检验；相关性检验采用Pearson分析法。采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，Ρ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清和关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平
Ghrelin与TNF-α水平检测结果如表1所示，活动期RA患者血清Ghrelin水平显著低于正常对照组（P＜0.05），而TNF-α水平明显高于正常对照组（P＜0.01）；活动期RA患者关节滑液Ghrelin和TNF-α水平均显著高于血清 （P＜0.05）。
2.2 RA患者血清与关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平的相关性分析
RA患者关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平呈负相关（r=0.819，P＜0.05）；而RA患者血清中Ghrelin与TNF-α水平相关性不显著（r=0.364，P＞0.05）。
3 讨论
慢性关节滑膜炎症是RA的重要病理学特征，这种免疫性炎症反应导致受累关节软骨和骨的破坏，多种细胞因子参与了关节滑膜的炎症反应，这些因子相互干扰、相互作用。Ghrelin是日本学者Kojima等[6]首先从胃黏膜分离纯化的第一个生长激素促分泌剂受体的内源性配体，是一种含28个氨基酸的肽类激素。其主要功能是通过垂体生长激素促分泌剂受体刺激生长激素分泌，调节摄食行为和维持机体能量稳态。近来的研究表明，Ghrelin可调节炎症和免疫反应，在炎症反应中Ghrelin可下调促炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α），包括RA在内的多种炎症性疾病中其水平可发生变化[1-5]。TNF-α是炎症发生和发展的关键性促炎性细胞因子，TNF-α拮抗剂作为抗炎症性药物已用于RA患者的治疗[4-5， 7-8]。在免疫系统和代谢调节中TNF-α和Ghrelin的相互作用，外源性Ghrelin抑制LPS诱导的巨噬细胞TNF-α生成；TNF注射后小鼠血浆Ghrelin水平下降、并引起食欲降低，而同时注射Ghrelin可逆转TNF-α的效应，这提示抑制TNF-α可增加体内Ghrelin分泌，促进摄食和改善营养状况。先天性心脏病患儿血浆Ghrelin升高、并且与TNF-α水平呈正相关[9-11]。
本研究结果显示，活动期RA患者血清中Ghrelin水平降低、TNF-α水平升高；首次观察了RA患者关节滑液中Ghrelin水平，发现膝关节滑液中Ghrelin和TNF-α水平高于血清，且滑液中Ghrelin与TNF-α呈显著负相关，这提示Ghrelin可能与TNF-α相互作用、共同参与RA的发生和发展进程。由于本研究未能获取正常对照组的关节滑液，因而无法比较RA患者和正常人群关节滑液中Ghrelin的差异。进一步的研究应在RA动物模型上探讨关节滑液中Ghrelin与炎症性细胞因子的关系，以阐明Ghrelin在RA发生、发展中的作用及其病理生理学机制。
关于RA患者血循环中Ghrelin水平变化的研究结果尚存在一定争议。Otero等[1]首先报道，RA患者血浆Ghrelin水平较正常对照明显降低；而在福氏完全佐剂诱发的关节炎（AA）模型大鼠，7d时AA组大鼠血浆Ghrelin水平显著低于对照组、15 d时恢复至对照组水平。Granado等[12]观察了GHRP-2（一种Ghrelin激动剂）对大鼠AA的抗炎效应，发现AA大鼠血清Ghrelin水平升高，给予GHRP-2（100µg/kg）腹腔注射8 d后AA大鼠症状和患肢肿胀程度改善、降低关节炎评分和血清IL-6水平。而Koca等[13]的研究表明，RA患者血清总Ghrelin水平低于Behcet’s病患者和正常对照组，各组间酰基化Ghrelin水平差异无统计学意义；血清Ghrelin水平与RA患者的临床和实验室指标无显著相关性。在ANCA-相关性脉管炎患者治疗前血清Ghrelin水平是治疗后的2倍，并且Ghrelin水平与疾病活动指标（包括C-反应蛋白）有关[14]。这些研究结果的不一致可能与所选病例、实验条件和营养状况等因素有关。抗TNF-α单抗（infflixmab）静脉灌注120min后重度RA患者血清中Ghrelin水平显著升高，并且伴有P-选择素水平降低，说明阻断TNF-α可促进机体内Ghrelin的分泌，从另一个层面证明Ghrelin可抑制促炎因子的合成与分泌[5]。青少年特发性关节炎患者血浆Ghrelin水平较对照组显著降低，给予抗TNF-α治疗后Ghrelin恢复至对照水平，并且患者Ghrelin水平变化与机体营养状态、能量平衡和食欲等因素无明显相关性，提示Ghrelin可能独立于其他指标参与RA的发病，并与TNF-α共同调节RA的发生与发展。深入研究Ghrelin在RA发生中的作用及其与TNF-α的相互作用机制，有助于阐明类风湿关节炎发病的病理机制，为开发以Ghrelin为靶点的药物治疗骨关节炎症性疾病提供理论基础。
[参考文献]
[1] Otero M，Nogueiras R，Lago F，et al.Chronic inflammation modulates ghrelin levels in humans and rats[J].Rheumatology，2004，43：306-310.
[2] Hattori N.Expression regulation and biological actions of growth hormone（GH）and ghrelin in the immune system[J].Growth Hormone & IGF Research，2009，97（5）：531-636.
[3] Dixit VD，Taub DD.Ghrelin and immunity：a young player in old field[J].Exp Gerontol，2005，40：900-910.
[4] Furst DE，Keystone EC，Kirkham B，et al.Update consensus statement on biological agents for the treatment of rheumatic disease[J].Ann Rheum Dis，2008，67（Suppl 3）：1112-1115.
[5] Gonzalez-Gay MA，Garcia-Unzueta MT，Berja A，et al.Anti-tumor necrosis factor α therapy modulates ghrelin in patients with severe rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2008，67：1644-1646.
[6] Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature，1999，402（6762）：656-660.
[7] Magiera M，Kopec-Medrek M，Widuchowska M，et al.Serum ghrelin in female patients with rheumatoid arthritis during treatment with infliximab[J].Rheumatol Int， 2011，Dec 24，[Epub ahead of print] DOI 10.1007/S00296-011-2262-7.
[8] Karagiozoglou-Lampoudi T，Trachana M，Agakidis C，et al.Ghrelin levels in patients with juvenile idiopathic arthritis：relation to anti-tumor necrosis factor treatment and disease activity[J].Matab Clin Exp，2011， 60：1359-1362.
[9] Yilmaz E，Ustundag B，Sen Y，et al.The level of ghrelin，TNF-α and IL-6 in children with cyanotic and acyanotic congenital heart disease[J].Mediators Inflamm，2007，2007：32403.
[10] Waseem T，Duxbury M，Ito H，et al.Exogenous ghrelin modulates release of pro- and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct signaling pathway[J].Surgery，2008，143：334-342.
[11] Endo M，Masaki T，Seik M，et al.Involvement of stomach ghrelin and hypothalamic neuropeptides in tumor necrosis factor-alpha-induced hypophagia in mice[J].Regul Pept，2007，140：94-100.
[12] Granado M，Priego T，Martin AI，et al.Anti-inflammatory effect of the ghrelin agonist growth hormone-releasing peptide-2 （GHRP-2） in arthritic rats[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，288：E486-E492.
[13] Koca SS，Ozgen M，Aydin S，et al.Ghrelin and obestatin levels in rheumatoid arthritis[J]. Inflammation，2008，31（5）：329-334.
[14] Kumpers P，Horm R，Brabant G，et al.Serum lepitn and ghrelin correlate with disease activity in ANCA-associated vasculitis[J].Rheumatology，2008，47：484-487.
（收稿日期：2012-03-01）
[关键词] 类风湿关节炎；血清；滑膜液；Ghrelin；肿瘤坏死因子-α
[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）08-18-03
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及关节的慢性炎症性疾病，以炎症、关节滑膜增生和免疫功能异常为主要病理生理特征。RA病变呈持续性、反复发作性，造成关节进行性破坏，出现不同程度的功能障碍。RA的病因和发病机制迄今尚不明了，亦无针对性治疗措施。近来的研究表明，自身免疫和非特异性炎症反应是导致RA关节软骨和骨质破坏的重要因素。Ghrelin是内源性增食欲肽，可调节摄食行为和能量代谢；Ghrelin具有抗炎作用，可下调促炎症性细胞因子，在多种炎症性疾病包括RA中其水平可发生变化[1-3]。TNF-α是炎症发生和发展的关键性细胞因子，近10多年来TNF-α拮抗剂作为抗炎症性药物已用于RA患者的治疗[4]。Gonzalez-Gay的研究发现，给重度RA患者静脉灌注抗TNF-α单抗（infliximab）后血清Ghrelin水平显著升高，说明阻断TNF-α可促进机体内Ghrelin的分泌，TNF-α和Ghrelin在炎症反应中具有相互调节作用[5]。本研究拟检测RA患者血清和关节滑液中TNF-α和Ghrelin水平的变化，并分析两者之间的相关性，为进一步探讨RA的发病机制和治疗策略提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择第四军医大学唐都医院风湿免疫科收治的36例活动期RA患者，临床诊断均符合美国风湿病学会1987修订的RA分类诊断标准，其中男11例，女25例，平均年龄（48±12）岁，这些患者均无其他慢性病史，未接受过激素或免疫抑制剂治疗。健康对照组36例为本院健康体检者，男12例，女24例，平均年龄（42±11）岁。
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集 RA组与正常组均于清晨8：00～9：00，空腹采取肘静脉血5 mL，注入试管待凝固后，4℃ 3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-70℃冰箱保存待测。另对RA患者均接受膝关节外上方为穿刺点，用无菌注射器收集关节滑液4 mL。于2 000 r/min离心10 min，收集上清液，保存于-70℃冰箱保存待测。上述所有操作均在征得患者同意后实施。
1.2.2 血清和关节滑液Ghrelin水平测定 Ghrelin检测EIA试剂盒购自ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories）公司，EIA法检测的具体操作步骤按试剂盒说明书进行，主要程序如下：（1）空白孔内依次滴加标准品、血清或滑液样品100 µL；（2）标准品或样品孔中加入酶标记液50 µL，37℃孵育反应60 min；（3）洗板机清洗5次；（4）在标准品或样品孔中加入底物A、B液各50 µL，37℃避光孵育反应15 min；（5）每孔加入终止液50 µL，终止反应；（6）混匀，用酶标仪检测各孔的A值（450 nm滤色片）。
1.3 统计学分析
实验数据均用（）表示，两组间比较采用t检验；相关性检验采用Pearson分析法。采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，Ρ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清和关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平
Ghrelin与TNF-α水平检测结果如表1所示，活动期RA患者血清Ghrelin水平显著低于正常对照组（P＜0.05），而TNF-α水平明显高于正常对照组（P＜0.01）；活动期RA患者关节滑液Ghrelin和TNF-α水平均显著高于血清 （P＜0.05）。
2.2 RA患者血清与关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平的相关性分析
RA患者关节滑液中Ghrelin与TNF-α水平呈负相关（r=0.819，P＜0.05）；而RA患者血清中Ghrelin与TNF-α水平相关性不显著（r=0.364，P＞0.05）。
3 讨论
慢性关节滑膜炎症是RA的重要病理学特征，这种免疫性炎症反应导致受累关节软骨和骨的破坏，多种细胞因子参与了关节滑膜的炎症反应，这些因子相互干扰、相互作用。Ghrelin是日本学者Kojima等[6]首先从胃黏膜分离纯化的第一个生长激素促分泌剂受体的内源性配体，是一种含28个氨基酸的肽类激素。其主要功能是通过垂体生长激素促分泌剂受体刺激生长激素分泌，调节摄食行为和维持机体能量稳态。近来的研究表明，Ghrelin可调节炎症和免疫反应，在炎症反应中Ghrelin可下调促炎症性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α），包括RA在内的多种炎症性疾病中其水平可发生变化[1-5]。TNF-α是炎症发生和发展的关键性促炎性细胞因子，TNF-α拮抗剂作为抗炎症性药物已用于RA患者的治疗[4-5， 7-8]。在免疫系统和代谢调节中TNF-α和Ghrelin的相互作用，外源性Ghrelin抑制LPS诱导的巨噬细胞TNF-α生成；TNF注射后小鼠血浆Ghrelin水平下降、并引起食欲降低，而同时注射Ghrelin可逆转TNF-α的效应，这提示抑制TNF-α可增加体内Ghrelin分泌，促进摄食和改善营养状况。先天性心脏病患儿血浆Ghrelin升高、并且与TNF-α水平呈正相关[9-11]。
本研究结果显示，活动期RA患者血清中Ghrelin水平降低、TNF-α水平升高；首次观察了RA患者关节滑液中Ghrelin水平，发现膝关节滑液中Ghrelin和TNF-α水平高于血清，且滑液中Ghrelin与TNF-α呈显著负相关，这提示Ghrelin可能与TNF-α相互作用、共同参与RA的发生和发展进程。由于本研究未能获取正常对照组的关节滑液，因而无法比较RA患者和正常人群关节滑液中Ghrelin的差异。进一步的研究应在RA动物模型上探讨关节滑液中Ghrelin与炎症性细胞因子的关系，以阐明Ghrelin在RA发生、发展中的作用及其病理生理学机制。
关于RA患者血循环中Ghrelin水平变化的研究结果尚存在一定争议。Otero等[1]首先报道，RA患者血浆Ghrelin水平较正常对照明显降低；而在福氏完全佐剂诱发的关节炎（AA）模型大鼠，7d时AA组大鼠血浆Ghrelin水平显著低于对照组、15 d时恢复至对照组水平。Granado等[12]观察了GHRP-2（一种Ghrelin激动剂）对大鼠AA的抗炎效应，发现AA大鼠血清Ghrelin水平升高，给予GHRP-2（100µg/kg）腹腔注射8 d后AA大鼠症状和患肢肿胀程度改善、降低关节炎评分和血清IL-6水平。而Koca等[13]的研究表明，RA患者血清总Ghrelin水平低于Behcet’s病患者和正常对照组，各组间酰基化Ghrelin水平差异无统计学意义；血清Ghrelin水平与RA患者的临床和实验室指标无显著相关性。在ANCA-相关性脉管炎患者治疗前血清Ghrelin水平是治疗后的2倍，并且Ghrelin水平与疾病活动指标（包括C-反应蛋白）有关[14]。这些研究结果的不一致可能与所选病例、实验条件和营养状况等因素有关。抗TNF-α单抗（infflixmab）静脉灌注120min后重度RA患者血清中Ghrelin水平显著升高，并且伴有P-选择素水平降低，说明阻断TNF-α可促进机体内Ghrelin的分泌，从另一个层面证明Ghrelin可抑制促炎因子的合成与分泌[5]。青少年特发性关节炎患者血浆Ghrelin水平较对照组显著降低，给予抗TNF-α治疗后Ghrelin恢复至对照水平，并且患者Ghrelin水平变化与机体营养状态、能量平衡和食欲等因素无明显相关性，提示Ghrelin可能独立于其他指标参与RA的发病，并与TNF-α共同调节RA的发生与发展。深入研究Ghrelin在RA发生中的作用及其与TNF-α的相互作用机制，有助于阐明类风湿关节炎发病的病理机制，为开发以Ghrelin为靶点的药物治疗骨关节炎症性疾病提供理论基础。
[参考文献]
[1] Otero M，Nogueiras R，Lago F，et al.Chronic inflammation modulates ghrelin levels in humans and rats[J].Rheumatology，2004，43：306-310.
[2] Hattori N.Expression regulation and biological actions of growth hormone（GH）and ghrelin in the immune system[J].Growth Hormone & IGF Research，2009，97（5）：531-636.
[3] Dixit VD，Taub DD.Ghrelin and immunity：a young player in old field[J].Exp Gerontol，2005，40：900-910.
[4] Furst DE，Keystone EC，Kirkham B，et al.Update consensus statement on biological agents for the treatment of rheumatic disease[J].Ann Rheum Dis，2008，67（Suppl 3）：1112-1115.
[5] Gonzalez-Gay MA，Garcia-Unzueta MT，Berja A，et al.Anti-tumor necrosis factor α therapy modulates ghrelin in patients with severe rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2008，67：1644-1646.
[6] Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature，1999，402（6762）：656-660.
[7] Magiera M，Kopec-Medrek M，Widuchowska M，et al.Serum ghrelin in female patients with rheumatoid arthritis during treatment with infliximab[J].Rheumatol Int， 2011，Dec 24，[Epub ahead of print] DOI 10.1007/S00296-011-2262-7.
[8] Karagiozoglou-Lampoudi T，Trachana M，Agakidis C，et al.Ghrelin levels in patients with juvenile idiopathic arthritis：relation to anti-tumor necrosis factor treatment and disease activity[J].Matab Clin Exp，2011， 60：1359-1362.
[9] Yilmaz E，Ustundag B，Sen Y，et al.The level of ghrelin，TNF-α and IL-6 in children with cyanotic and acyanotic congenital heart disease[J].Mediators Inflamm，2007，2007：32403.
[10] Waseem T，Duxbury M，Ito H，et al.Exogenous ghrelin modulates release of pro- and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct signaling pathway[J].Surgery，2008，143：334-342.
[11] Endo M，Masaki T，Seik M，et al.Involvement of stomach ghrelin and hypothalamic neuropeptides in tumor necrosis factor-alpha-induced hypophagia in mice[J].Regul Pept，2007，140：94-100.
[12] Granado M，Priego T，Martin AI，et al.Anti-inflammatory effect of the ghrelin agonist growth hormone-releasing peptide-2 （GHRP-2） in arthritic rats[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，288：E486-E492.
[13] Koca SS，Ozgen M，Aydin S，et al.Ghrelin and obestatin levels in rheumatoid arthritis[J]. Inflammation，2008，31（5）：329-334.
[14] Kumpers P，Horm R，Brabant G，et al.Serum lepitn and ghrelin correlate with disease activity in ANCA-associated vasculitis[J].Rheumatology，2008，47：484-487.
（收稿日期：2012-03-01）