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【摘 要】建立反相高效液相色谱法测定牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量。方法：采用奥泰公司 C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35），检测波长为284nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。盐酸黄柏碱在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。盐酸黄柏碱平均回收率分别为99.5%。结论：本法简便、准确，可用于牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量测定。
【关键词】牛黄益金片；含量；测定
牛黄益金片为浅黄色至棕黄色的片。牛黄益金片由黄柏、硼砂、玄明粉、牛黄、薄荷脑、薄荷油组成。牛黄益金片具有清热利咽，消肿止痛的功效。牛黄益金片常用于急、慢性咽炎。黄柏为芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮。《本草图经》记载：“檗木，黄檗也，今处处有之，以蜀中者为佳。五月六月采皮，去皱粗暴干用。其根名檀桓。”黄柏有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效。黄柏具有降血压、抗菌、抗炎、抗癌、抗溃疡、抗氧化、解热作用、抗痛风、抗病毒等作用[1-5]。黄柏常用于湿热痢疾、泄泻、淋浊、带下、盗汗、痈疽疮毒、皮肤湿疹等。本文采用高效液相色谱法对牛黄益金片剂中的盐酸黄柏碱的进行了含量测定。
1.仪器与试药
1.1仪器
SLGH超深度高精度恒温槽（南京顺流仪器有限公司）；Molchem化工行业用超纯水设备（上海摩勒科学仪器有限公司）；MicroSmart高速微量离心机（北京昊诺斯科技有限公司）；CC-100分析型色谱柱温箱（成都纳杰科技有限公司）；RE-3000A旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）；US6180DH数显型超声波清洗器（北京优晟联合科技有限公司）； SP-756P紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；Smartline 高效液相色谱系统（北京创新通恒科技有限公司）；BSA124S电子分析天平（东莞康润仪器设备有限公司）。
1.2色谱柱
奥泰公司C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品
盐酸黄柏碱 购自中国药品生物制品检定所。
1.4试剂
甲醇（广州博氧化工有限公司）、乙腈（厦门润科化工科技有限公司）、磷酸（广州太三忆化工有限公司）、十二烷基磺酸钠（济南鑫诺化工有限公司）、三乙胺（济南鑫诺化工有限公司）。
1.5试药
牛黄益金片剂。
2.测定方法确定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[6-7]。流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35），检测波长：284nm，流速：1.0m·min-1。柱温：35℃。理论板数按盐酸黄柏碱峰计算应不得低于3000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取盐酸黄柏碱对照品适量，置容量瓶中，加甲醇制成每1mL含20ug的溶液，即得。
2.3提取方法确定
2.3.1提取溶媒的选择
在供试品溶液制备中，分别选用了75%甲醇、乙醇、甲醇进行热回流提取，结果表明甲醇分离效果、峰形及含量为最好，所以选择甲醇进行热回流提取。
2.3.2提取时间的选择
取供试品适量，用甲醇提取，热回流提取分别提取30、60、90分钟，制备供试品溶液，含量结果表明：三种提取时间结果无明显差异，为保证提取完全并缩短处理时间，采用热回流提取30分钟。
2.3.3供试品溶液的制备
取牛黄益金片，研细，精密称定，加入甲醇60mL，热回流提取30分钟，过滤，水浴蒸干，残渣用5ml流动相溶解，滤过。取续滤液，即得。
2.4专属性试验
依照处方取硼砂、玄明粉、牛黄、薄荷脑、薄荷油，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照2.3.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依色谱条件测定，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5精密度试验
精密称取盐酸黄柏碱对照品适量，加甲醇使溶解，制成浓度为20ug·mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.76%，表明本方法精密度良好。
2.6对照品的线性考察
精密称取盐酸黄柏碱对照品10.0mg，置25ml容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，盐酸黄柏碱在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.7重现性试验
称取同一批的牛黄益金片剂样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.85%，结果表明此方法的重现性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的盐酸黄柏碱对照品，上述方法进行测定，计算回收率，平均回收率分别为99.5%，RSD为0.53%。
2.9样品稳定性试验
取同一批牛黄益金片剂样品，按2.3.3项下的供试品制备方法制备供试品，将供试品置室温下放置，分别于第0、2、4、6、8、10小时，精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪中，记录色谱图。测定牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的RSD=0.65%。结果表明供试品10小时内稳定。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定牛黄益金片剂三批样品中盐酸黄柏碱的含量，结果三批样品的含量分别为0.17mg/g、0.16mg/g、0.16mg/g。
3.讨论
分别考察，乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶30：40），甲醇-水-冰醋酸（13∶86∶1），乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35），甲醇-水-冰醋酸（34∶65∶1）不同比例的流动相，结果以乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用，乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35）为流动相。本实验表明此方法可用于牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量测定。牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量为每片不低于0.15mg/g。
【参考文献】
[1]王跃华，徐文俊，何俊蓉，朱剑宏，孙雁霞.川黄柏离体培养及药用成分的抑菌试验研究[J].中国中药杂志，2004（10）.
[2]刘春平，赵淑肖，陈强，南国荣，王凤荣，四荣联，王刚生.盐酸小檗碱抗5种皮肤癣菌实验观察[J].临床皮肤科杂志，2005（01）.
[3]王飞，郭力，杨奎，杜微祥，蒲旭峰.加味三妙胶囊及黄柏对前列腺渗透作用的实验观察[J].成都医药，2003（01）.
[4]杨澄，朱继孝，王颖，温尧林，孔令东.盐制对黄柏抗痛风作用的影响[J].中国中药杂志，2005（02）.
[5]郭志坚，郭书好，何康明，刘慧琼，潘珊珊.黄柏叶中黄酮醇甙含量测定及其抑菌实验[J].暨南大学学报（自然科学与医学版），2002（05）.
[6]陈天朝，翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究，2011（04）.
[7]张莉，潘超.高效液相色谱法同时测定二妙丸中盐酸小檗碱和黄柏碱的含量[J].中国新药杂志，2011（22）.
【关键词】牛黄益金片；含量；测定
牛黄益金片为浅黄色至棕黄色的片。牛黄益金片由黄柏、硼砂、玄明粉、牛黄、薄荷脑、薄荷油组成。牛黄益金片具有清热利咽，消肿止痛的功效。牛黄益金片常用于急、慢性咽炎。黄柏为芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮。《本草图经》记载：“檗木，黄檗也，今处处有之，以蜀中者为佳。五月六月采皮，去皱粗暴干用。其根名檀桓。”黄柏有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效。黄柏具有降血压、抗菌、抗炎、抗癌、抗溃疡、抗氧化、解热作用、抗痛风、抗病毒等作用[1-5]。黄柏常用于湿热痢疾、泄泻、淋浊、带下、盗汗、痈疽疮毒、皮肤湿疹等。本文采用高效液相色谱法对牛黄益金片剂中的盐酸黄柏碱的进行了含量测定。
1.仪器与试药
1.1仪器
SLGH超深度高精度恒温槽（南京顺流仪器有限公司）；Molchem化工行业用超纯水设备（上海摩勒科学仪器有限公司）；MicroSmart高速微量离心机（北京昊诺斯科技有限公司）；CC-100分析型色谱柱温箱（成都纳杰科技有限公司）；RE-3000A旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）；US6180DH数显型超声波清洗器（北京优晟联合科技有限公司）； SP-756P紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；Smartline 高效液相色谱系统（北京创新通恒科技有限公司）；BSA124S电子分析天平（东莞康润仪器设备有限公司）。
1.2色谱柱
奥泰公司C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。
1.3对照品
盐酸黄柏碱 购自中国药品生物制品检定所。
1.4试剂
甲醇（广州博氧化工有限公司）、乙腈（厦门润科化工科技有限公司）、磷酸（广州太三忆化工有限公司）、十二烷基磺酸钠（济南鑫诺化工有限公司）、三乙胺（济南鑫诺化工有限公司）。
1.5试药
牛黄益金片剂。
2.测定方法确定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[6-7]。流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35），检测波长：284nm，流速：1.0m·min-1。柱温：35℃。理论板数按盐酸黄柏碱峰计算应不得低于3000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取盐酸黄柏碱对照品适量，置容量瓶中，加甲醇制成每1mL含20ug的溶液，即得。
2.3提取方法确定
2.3.1提取溶媒的选择
在供试品溶液制备中，分别选用了75%甲醇、乙醇、甲醇进行热回流提取，结果表明甲醇分离效果、峰形及含量为最好，所以选择甲醇进行热回流提取。
2.3.2提取时间的选择
取供试品适量，用甲醇提取，热回流提取分别提取30、60、90分钟，制备供试品溶液，含量结果表明：三种提取时间结果无明显差异，为保证提取完全并缩短处理时间，采用热回流提取30分钟。
2.3.3供试品溶液的制备
取牛黄益金片，研细，精密称定，加入甲醇60mL，热回流提取30分钟，过滤，水浴蒸干，残渣用5ml流动相溶解，滤过。取续滤液，即得。
2.4专属性试验
依照处方取硼砂、玄明粉、牛黄、薄荷脑、薄荷油，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照2.3.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依色谱条件测定，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5精密度试验
精密称取盐酸黄柏碱对照品适量，加甲醇使溶解，制成浓度为20ug·mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.76%，表明本方法精密度良好。
2.6对照品的线性考察
精密称取盐酸黄柏碱对照品10.0mg，置25ml容量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，盐酸黄柏碱在8～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.7重现性试验
称取同一批的牛黄益金片剂样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.85%，结果表明此方法的重现性良好。
2.8准确度试验
精密称取已知含量的样品6份，分别加入一定量的盐酸黄柏碱对照品，上述方法进行测定，计算回收率，平均回收率分别为99.5%，RSD为0.53%。
2.9样品稳定性试验
取同一批牛黄益金片剂样品，按2.3.3项下的供试品制备方法制备供试品，将供试品置室温下放置，分别于第0、2、4、6、8、10小时，精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪中，记录色谱图。测定牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的RSD=0.65%。结果表明供试品10小时内稳定。
2.10样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定牛黄益金片剂三批样品中盐酸黄柏碱的含量，结果三批样品的含量分别为0.17mg/g、0.16mg/g、0.16mg/g。
3.讨论
分别考察，乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶30：40），甲醇-水-冰醋酸（13∶86∶1），乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35），甲醇-水-冰醋酸（34∶65∶1）不同比例的流动相，结果以乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用，乙腈-0.1%磷酸水溶液-0.01%十二烷基磺酸钠水溶液（30∶35：35）为流动相。本实验表明此方法可用于牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量测定。牛黄益金片剂中盐酸黄柏碱的含量为每片不低于0.15mg/g。
【参考文献】
[1]王跃华，徐文俊，何俊蓉，朱剑宏，孙雁霞.川黄柏离体培养及药用成分的抑菌试验研究[J].中国中药杂志，2004（10）.
[2]刘春平，赵淑肖，陈强，南国荣，王凤荣，四荣联，王刚生.盐酸小檗碱抗5种皮肤癣菌实验观察[J].临床皮肤科杂志，2005（01）.
[3]王飞，郭力，杨奎，杜微祥，蒲旭峰.加味三妙胶囊及黄柏对前列腺渗透作用的实验观察[J].成都医药，2003（01）.
[4]杨澄，朱继孝，王颖，温尧林，孔令东.盐制对黄柏抗痛风作用的影响[J].中国中药杂志，2005（02）.
[5]郭志坚，郭书好，何康明，刘慧琼，潘珊珊.黄柏叶中黄酮醇甙含量测定及其抑菌实验[J].暨南大学学报（自然科学与医学版），2002（05）.
[6]陈天朝，翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究，2011（04）.
[7]张莉，潘超.高效液相色谱法同时测定二妙丸中盐酸小檗碱和黄柏碱的含量[J].中国新药杂志，2011（22）.