【摘 要】
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本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,
【机 构】
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四川大学生命科学学院医学细胞生物学教研室; 哈佛大学医学院;
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(No.30371307)资助~~
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本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-IcDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35cDNA,重叠PCR法连接2个片段,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVECTM-TOPO载体上,对新构建的IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定;脂质体法转染CHO/DG44细胞;RT-PCR检测转染结果,采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞,对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)的加压筛选,ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清,免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆;SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。
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