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摘 要 基于红肉蜜柚RNA-seq数据库，筛选出50个ABC转运蛋白家族基因，其中包含11条PDR型基因。对11条柚PDR基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的AtPDR11基因同源性最高，达69.25%，利用RT-PCR技术克隆得到CmPDR11-2的ORF序列。该序列长度为4 371 bp，编码一个含有1 456个氨基酸的蛋白质，分子量165.138 03 ku，该蛋白属于稳定的亲水性蛋白，无信号肽，具有12个跨膜结构，定位于细胞膜。实时荧光定量PCR结果表明，草甘膦除草剂胁迫处理条件下，1～15 d处理组柚叶的CmPDR11-2基因相对表达量呈整体上升趋势，且均高于对照组，反应迅速且持久，这表明CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。
关键词 红肉蜜柚；PDR；CmPDR11-2；克隆；实时荧光定量PCR
中图分类号 S682 文献标识码 A
Abstract Based on the RNA-seq database of ‘Hongrou miyou’50 ABC transporter family genes were screened， including 11 PDR type genes. The nomenclature and bioinformatics analysis of 11 pomelo PDR genes were carried out. Homology analysis showed that the amino acid sequence encoded by CmPDR11-2 had the highest homology （69.25%） with the AtPDR11 gene that transports paraquat herbicides in Arabidopsis. The ORF of PDR gene was named as CmPDR11-2， which was a full-length of 4 371 bp， encoding a 1 456 amino acids with molecular weight 165.138 03 ku. The protein was stably hydrophilic， without signal peptide， with 12 transmembrane structure located in cell membrane. The results of real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that under the condition of glyphosate herbicide stress， the relative expression of CmPDR11-2 in the leaves treated with glyphosate for 1–15 days showed an overall upward trend， both of which were higher than the control， and the reaction was rapid and durable. This indicated that the expression of CmPDR11-2 gene was related to ‘Hong rou mi you’ glyphosate tolerance.
Keywords Citrus maxima ‘Hongrou miyou’； PDR； CmPDR11-2； cloning； real-time fluorescence quantitative PCR
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.012
植物ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters— ABC转运蛋白），是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族[1]，存在于植物细胞的质膜、液泡、线粒体和过氧化物酶体中[2]，参与植物细胞生命活动的多种过程，影响产量和品质形成[3]。根据HAGO系统（基于越橘转录组测序的PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析）命名法，植物ABC转运蛋白基因分为八大亚族：ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCH[4]，不過目前在植物中未发现ABCH亚家族成员[5]，在拟南芥中，Kang等[6]将更简单的ABC转运蛋白命名为细菌型的ABCI家族。其中ABCG是最大的亚族，包含WBC（White-brown complex homologue）和PDR（Pleiotropic drug resistance）2种类型[7]。水生植物浮萍SpTUR2是第一个被鉴定的PDR基因[8]，随后研究人员分别在拟南芥中鉴定出15个PDR转运蛋白基因，水稻中鉴定出23个[9]，越橘中鉴定出21个[10]，近年来随着基因克隆技术的发展，小麦、苜蓿和大豆等PDR基因也被克隆和鉴定出[11-14]。研究发现，PDR蛋白家族在植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和气孔的功能调节等一系列过程中都发挥作用，因而备受人们关注[15]。
我国是世界上柚类生产面积最大的国家，柚子营养价值丰富，品种多，可以迎合不同人的口味需求，具有重要的农业价值和经济价值。杂草是柑橘类果树种植过程中的大敌，因杂草造成的减产一般达10%～20%，严重时达50%以上[16]。面对疯长的杂草，化学除草剂如草甘膦因其方便、省事、省工，成为许多柑橘果农的首选。草甘膦能直接杀死杂草的根系，但如果长期施用除草剂，会降低土壤有效Fe和Zn的含量，并抑制柑橘对Fe和Zn的吸收。草甘膦在清除杂草的同时，也影响到了柑橘树体的生长，主要表现为抑制蛋白质的合成[17]，而且若由于操作不当或喷药时产生大量的药雾随风漂移，可由果树叶片直接吸收并传导到根系，造成果树伤根及土壤污染板结，根系吸水吸肥能力减弱甚至消失，出现严重败根黄叶，甚至枯死[18]。所以为保证果实产量和品质，在柚子生产过程中，应尽量降低草甘膦造成的不良影响。 在拟南芥已鉴定的15个PDR转运蛋白中，发现AtPDR11可以运输百草枯除草剂[19]。2010和2012年分别有研究表明ABC转运蛋白家族与草甘膦抗性相关[20-21]。依据本实验室建立的红肉蜜柚汁胞不同发育期的RNA-seq数据库，筛选出11条PDR转运蛋白基因，对这11条柚PDR基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明，CmPDR11-2编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，达69.25%，草甘膦和百草枯都是灭生性除草剂，均只有接触绿色组织后才有杀伤作用，两者都能干扰叶绿素的合成和影响植物光合作用[22-23]，故推测CmPDR11-2有可能具有转运草甘膦除草剂的功能。本研究利用RT-PCR技术从红肉蜜柚叶片中克隆得到CmPDR11-2的ORF序列，采用实时荧光定量技术检测草甘膦除草剂胁迫下CmPDR11-2在柚叶中的表达特性，以深入探究PDR转运蛋白在蜜柚的外源毒素的解毒过程中的作用，对利用蜜柚中ABC转运蛋白家族基因进行耐草甘膦除草剂的品质改良具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为福建农林大学园艺学院田间实验室种植的八年生的红肉蜜柚的叶片。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 选取长势一致、外形接近的2株红肉蜜柚植株，再分别选取长势一致的主枝，对其中一株叶片喷洒纯净水，以做对照；另一株喷洒草甘膦。使用量为叶面开始滴水为止。为了营造胁迫环境，草甘膦使用量为正常生产用药的两倍，并加入1%的吐温20。取处理前和处理后1、2、4、8 d和直至外观出现明显差异的第15 d共6次样品，每个时间点取3个生物重复，洗净表面后液氮速冻，存于80 ℃冰箱。
1.2.2 柚PDR基因的筛选 基于本实验室拥有的红肉蜜柚汁胞不同发育期的RNA-seq数据库，通过在KEGG Orthology中关键字ATP-binding cassette筛选，得到77条目的基因，接着，将这77条目的基因在NCBI和甜橙库BLAST后，最终筛选到50条ABC转运蛋白基因。其中ABCA亚族2条、ABCB亚族10条、ABCC亚族9条、ABCD亚族2条、ABCG亚族22条、ABCE亚族1条、ABCF亚族3条、ABCI亚族1条。其中在ABCG亚族中有11条目的PDR基因。
为进一步确定所获得的11条序列是否确为PDR基因，在拟南芥信息资源库（http：//www.-arabidopsis.org/）下载拟南芥15条PDR的蛋白序列，然后使用SMART和NCBI对获得的蛋白序列进行保守结构域分析，以其为模板，继续分析柚PDR的保守结构域，然后利用MEGA 5.2软件进行系统进化树的构建，并将柚11条PDR基因与甜橙、拟南芥数据库进行序列比对，最后结合系统进化树对其进行命名。
1.2.3 柚 PDR 基因的生物信息学分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对11条柚PDR基因编码区进行蛋白质基本理化性质进行分析；利用Plant-mPLoc（http：//www.?csbio.?sjtu.?????-edu.cn/bioinf/plant-multi/）对其进行蛋白质亚细胞定位预测；利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.?dtu.?-dk/services/SignalP/）进行信号肽预测；利用（http：//www.?cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对其进行蛋白质跨膜结构预测；在拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/）查找并下载AtPDR11的氨基酸序列，利用NCBI-ORFfinder （https：// www.????ncbi.?nlm.nih.?gov/orffin?der/）查找并下载11条柚PDR基因的最大ORF的氨基酸序列，并利用DNAMAN 8软件分别与AtPDR11进行比对。
1.2.4 总RNA提取与cDNA第一条链的合成 RNA提取使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒，购于北京百泰克生物技术有限公司。分别提取0、1、2、4、8、15 d的对照组和处理组的叶片的RNA。依照试剂盒说明书操作。
用于RT-PCR的逆转录使用TRANS生物公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒
用于qPCR的逆转录使用Takara生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒。依照试剂盒说明书操作。
1.2.5 CmPDR11-2的引物设计与合成 以红肉蜜柚转录组测序数据中GLEAN10014435为模板，利用Primer Premier 5软件设计引物克隆CmPDR 11-2全编码区。引物序列为CmPDR11-2-F： 5′- ATGAGTATTAGAGTGGCAGATGATCTAGCAAG-3′，CmPDR11-2-R：5′-TTATCTCCTTTGGAA?G-TTGTTGATGGCATAG-3′。委托华大基因公司合成。
利用Beacon Designer 8软件设计引物。再利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.?gov/ tools/primer-blast/）进行引物特异性分析、UNA?Fold（http：//www.idtdna.com/UNAFold）对目标序列进行二级结构分析、Beacon Free Edition（http：// www.premierbiosoft.com/）对引物二级结构进行分析。最后筛选出的定量引物需要满足引物特异性好，目标序列无二级结构，引物无二级结构或者自由能低。CmPDR11-2-F’：5′-CTC?ATG?ACTG-CCACCATCGC-3′，CmPDR11-2-R′：5′-GGCTGCC-CTTTCACGGTAGT-3′。委托华大基因公司合成。 1.2.6 CmPDR11-2的克隆 以红肉蜜柚叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25 μL，其中10×TransTaq HiFi BufferⅡ2.5 μL，dNTPs（10 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板1 μL，TransTaq HiFi DNA polymerase 0.5 μL，加水至终体积25 μL。反应程序为：94 ℃預变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR反应结束后电泳检测，将目的片段回收、连接、转化、测序。
1.2.7 草甘膦胁迫下CmPDR11-2基因表达分析 定量PCR使用Takara生物公司的SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），反应体系为15 μL：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，水3.2 μL。模板为0、1、2、4、8、15 d时对照组和草甘膦处理组的植株叶片的cDNA。反应条件：95 ℃ 30 s（预变性过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环（PCR反应过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s（溶解曲线分析过程）。在耶拿Qtower2.2荧光定量仪上进行qPCR，每个样品进行3个技术重复。内参基因为β-Actin[24]，Actin-F：5-AGAACTATGAACTGCCTGATGGC-3，Actin- R：5-GCTTGGAGCAAGTGCTGTGATT-3。利用2CT法对CmPDR11-2在柚叶中的表达进行 分析。
2 结果与分析
2.1 柚PDR基因的筛选分析
结构域分析结果显示，拟南芥PDR基因和柚PDR基因均具有AAA+类型的ATPase的结构，均属于ABC转运蛋白家族。拟南芥15条PDR基因和柚11条PDR基因的系统进化树如图1所示，结果表明柚PDR基因家族与拟南芥PDR基因家族亲缘关系很近，也进一步验证了我们筛选的结果的正确性。
柚11条PDR基因与甜橙、拟南芥数据库进行核苷酸序列比对，每条序列拟南芥比对结果以分值从高到低列出，整理得出比对分值较高的拟南芥基因有AtPDR1、AtPDR3、AtPDR6、AtPDR7、AtPDR8、AtPDR9、AtPDR11、AtPDR12、AtPDR14等共9个，这9个基因均属于拟南芥PDR型转运
蛋白家族基因。在与甜橙比对结果中发现，除CmPDR12-1与甜橙基因一致度相对较低，为82%外，其他基因与比对的甜橙基因一致度均高达100%。最终确定这11条柚PDR基因筛选正确。并对柚11条PDR基因进行命名（表1）。
2.2 柚PDR基因生物信息分析结果
蛋白质基本理化性质预测分析显示（表2），柚PDR基因编码区序列长度为3 660～4 515 bp，编码1 219～1 504个氨基酸，编码蛋白分子量为137.731 58～170.472 48 ku，理论等电点为6.55～ 8.99，有两个不稳定蛋白CmPDR9和CmPDR11-3，其余稳定，总平均亲水性除CmPDR9和CmPDR1外皆为正值，推测CmPDR9和CmPDR1为亲水性蛋白，其余为疏水性蛋白。信号肽预测结果显示柚11条PDR基因均不包含信号肽；跨膜结构预测结果显示11条PDR基因均具有10个以上跨膜区；亚细胞定位预测结果显示11条PDR基因均定位于细胞膜。与AtPDR11氨基酸序列比对结果显示同源性最高的是CmPDR11-2，为69.25%；最低的是CmPDR9，为45.04%。
2.3 CmPDR11-2基因克隆
CmPDR11-2克隆产物为一条约4 400 bp的亮带（图2），将其连入blunt-zero克隆载体，菌液验证后送铂尚生物公司测序，测序结果与红肉蜜柚转录本GLEAN10014435基因编码区序列完全一致，说明已经完全获得了目的基因，该基因全长为4 371 bp。
2.4 草甘膦胁迫下CmPDR11-2表达分析
处理前和处理后15 d时对照组和处理组叶子外观进行比较，处理前两组叶片外观正常，处理后15 d时，对照组叶片外观依然正常，处理组叶片明显发黄，对比明显（图3）。
实时荧光定量结果（图4）显示草甘膦处理后1～15 d，对照组CmPDR11-2基因相对表达量基本不变，处理组CmPDR11-2基因相对表达量成整体上升的趋势，且处理前对照组和处理组基因相对表达量几乎相等；草甘膦处理后第1天，处理组的基因相对表达量约为对照组的2.3倍，差异极显著；第2～4天，处理组基因相对表达量约为对照组的4倍，差异极显著；第8天，处理组的基因相对表达量约为对照组的5.7倍，差异极显著；第15天，即外观呈现明显差异时，处理组基因相对表达量约为对照组的8倍，差异极显著。
在草甘膦胁迫处理后1 d时，处理组与对照组就呈现极显著差异，说明CmPDR11-2参与草甘膦胁迫响应，且反应迅速；至外观出现明显差异时，CmPDR11-2的相对表达量持续上升，说明该基因在参与草甘膦胁迫响应时，反应持久，这表明CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。
3 讨论
ABCG亚族是NBD-TMD反向序列结构域类型的转运子，包括PDR和WBC两种类型，在目前发现的PDR基因只存在于真菌和植物中，并且是ABC转运蛋白家族中最多的一种类型。当植物长期处于生物或非生物胁迫时，能够形成多种组成型或诱导型防御反应来适应环境变化来维持生存。植物PDR转运蛋白能够通过转运次生代谢物质参与到植物诱导型防御反应中，从而降低胁迫环境对植物造成的不利影响。随着基因组测序技术的提高，植物中越来越多的PDR基因被发现与克隆，但几乎都集中在模式植物如拟南芥或者水稻，且大部分功能还未阐明。目前，红肉蜜柚基 因组测序工作已经完成，但是关于ABC转运蛋白家族的研究还处在起步阶段，本研究依据红肉蜜柚基因组数据库发掘出11条蜜柚PDR亚族基因，为蜜柚ABC转运蛋白家族的研究提供新思路，也可弥补在植物界对于ABC转运蛋白家族的研究都几乎集中在模式植物的不足。
本研究通过CmPDR11-2基因的克隆及对草甘膦胁迫响应表达规律分析，发现CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。Tani等[25]发现外界环境能影响小蓬草草甘膦耐受型和草甘膦敏感型的关键ABC（EPSPS1、M10和M11）基因的表达，35 ℃、光照条件下，草甘膦耐受型植株的EPSPS1、M10和M11基因的表达量在不同浓度草甘膦胁迫下均高于草甘膦敏感型植株内的表达量，其中EPSPS1在草甘膦1倍浓度、M10于8倍浓度、M11于1和8倍浓度下时差异最显著，而在35 ℃、黑暗条件下时，EPSPS1、M10和M11基因表达量明显降低，且差异不明显，24 ℃、光照条件下时的结果与35 ℃、光照条件下非常相似，可见光照可影响ABC基因响应草甘膦胁迫的机制。在拟南芥中，AtPDR11可以运输百草枯除草剂，百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，CmPDR11-2在柚11条PDR基因中与AtPDR11同源性最高，达69.25%，综上，CmPDR11-2的耐草甘膦性很可能与光照条件有关。
但是本研究中处理组柚叶内CmPDR11-2表达量何时回落正常表达水平应进一步研究，且为了试验的完善性，应设置光照和黑暗条件，分别对不同浓度草甘膦胁迫下对照组和处理组柚叶内CmPDR11-2的表达量情况进行分析。
参考文献
[1] Martinoia E， Klein M， Geisler M， et al. Multifunctionality of plant ABC transporters-more than just detoxifiers[J]. Planta， 2002， 214（3）： 345-355.
[2] 邵若玄， 沈忆坷， 周文彬， 等. 植物ATP结合盒（ABC）转运蛋白研究进展[J]. 浙江农林大学学报， 2013， 30（5）： 761-768.
[3] Rea P A. P1ant ATP-binding cassette transporters[J]. Annual Review of Plant Biology， 2007， 58： 347-375.
[4] Verrier P J， Bird D， Burla B， et al. Plant ABC proteins-a unified nomenclature and updated inventory[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（4）： 151-159.
[5] 王晓珠， 孙万梅， 马义峰， 等. 拟南芥ABC转运蛋白研究进展[J]. 植物生理学报， 2017， 53 （2）： 133-144.
[6] Kang J， Park J， Choi H， et al. Plant ABC transporters[J/OL]. The Arabidopsis Book， 2011， 9： e0153[2017-12-01]. http：//doi.org/10.1199/tab.0153.
[7] Nuruzzaman M， Zhang R， Cao H Z， et al. Plant pleiotropic drug resistance transporters： transport mechanism， gene expression， and function[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2014， 56（8）： 729-740.
[8] Van den Brule S， Müller A， Fleming A J， et al. The ABC transporter SpTUR2 confers resistance to the antifungal diterpene sclareol[J]. The Plant Journal， 2002， 30（6）： 649- 662.
[9] Schulz B， Kolukisaoglu H U. Genomics of plant ABC transporters： the alphabet of photosynthetic life forms or just holes in membranes[J]. FEBS Letters， 2006， 580（4）： 1 010-1 016.
[10] 刘红弟， 陈 丽， 康立敏， 等. 基于转录组测序的越橘PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析[J]. 吉林农业大学学报， 2015， 37（6）： 674-681.
[11] Stukkens Y， Bultreys A， Grec S， et al. NpPDR1， a pleiotropic drug resistance-type ATP-binding cassette transporter from Nicotiana plumbaginifolia， plays a major role in plant pathogen defense[J]. Plant Physiology， 2005， 139（1）： 341-352.
[12] 尚 毅， 肖 進， 马璐琳， 等. 小麦中一个PDR型ABC转运蛋白基因的克隆和特征分析[J]. 科学通报， 2009， 54（17）： 2 500-2 507. [13] Jasinski M， Banasiak J， Radom M， et al. Full-size ABC transporters from the ABCG subfamily in medicago truncatula[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2009， 22（8）： 921-931.
[14] Eichhorn H， Klinghammer M， Becht P， et al. Isolation of a novel ABC-transporter gene from soybean induced by salicylic acid[J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（10）： 2 193-2 201.
[15] 谢小芳， 陈志伟， 吴为人. 植物PDR蛋白家族的进化分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2012， 31（6）： 617-623.
[16] 马永林， 覃建林， 马跃峰， 等. 几种除草剂对柑橘园入侵性杂草假臭草防除效果[J]. 农药， 2013， 52（6）： 444-446.
[17] 廖聪学， 欧 毅， 谢永红. 几种除草剂对土壤养分供应和柑橘植株吸收的影响[J]. 西南园艺， 2004， 32（2）： 17-19.
[18] 王兆振， 毕亚玲， 丛 聪， 等. 除草剂对作物的药害研究[J]. 农药科学与管理. 2013， 34（5）： 68-73.
[19] Xi J， Xu P， Xiang C B. Loss of AtPDR11， a plasma membrane-localized ABC transporter， confers paraquat tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal： for Cell and Molecular Biology， 2012， 69（5）： 782-791.
[20] Peng Y， Abercrombie L L G， Yuan J S， et al. Characterization of the horseweed （Conyza canadensis） transcriptome using GS-FLX 454 pyrosequencing and its application for expression analysis of candidate non-target herbicide resistance genes[J]. Pest Management Science， 2010， 66（10）： 1 053-1 062.
[21] Nol N， Tsikou D， Eid M， et al. Shikimate leaf disc assay for early detection of glyphosate resistance in Conyza canadensis and relative transcript levels of EPSPS and ABC transporter genes[J]. Weed Research， 2012， 52（3）： 233-241.
[22] 張 冬， 张 宇， 王 萌. 草甘膦对植物生理影响的研究进展[J]. 热带农业科学， 2016， 36（9）： 55-61.
[23] 万 盼， 熊兴政， 黄小辉. 2种农药胁迫对油桐幼苗叶绿素荧光特性及生长的影响[J]. 林业科学， 2016， 52（7）： 22-29.
[24] Wang X Y， Wang P， Qi Y P， et al. Effects of granulation on organicacid metabolism and its relation to mineral elements in Citrus grandis juice sacs[J]. Food Chemistry， 2014， 145： 984-990.
[25] Tani E， Chachalis D， Travlos I S， et al. Environmental conditions in?uence induction of key ABC-transporter genes affecting glyphosate resistance mechanism in Conyza canadensis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016， 17（4）： 342.
关键词 红肉蜜柚；PDR；CmPDR11-2；克隆；实时荧光定量PCR
中图分类号 S682 文献标识码 A
Abstract Based on the RNA-seq database of ‘Hongrou miyou’50 ABC transporter family genes were screened， including 11 PDR type genes. The nomenclature and bioinformatics analysis of 11 pomelo PDR genes were carried out. Homology analysis showed that the amino acid sequence encoded by CmPDR11-2 had the highest homology （69.25%） with the AtPDR11 gene that transports paraquat herbicides in Arabidopsis. The ORF of PDR gene was named as CmPDR11-2， which was a full-length of 4 371 bp， encoding a 1 456 amino acids with molecular weight 165.138 03 ku. The protein was stably hydrophilic， without signal peptide， with 12 transmembrane structure located in cell membrane. The results of real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that under the condition of glyphosate herbicide stress， the relative expression of CmPDR11-2 in the leaves treated with glyphosate for 1–15 days showed an overall upward trend， both of which were higher than the control， and the reaction was rapid and durable. This indicated that the expression of CmPDR11-2 gene was related to ‘Hong rou mi you’ glyphosate tolerance.
Keywords Citrus maxima ‘Hongrou miyou’； PDR； CmPDR11-2； cloning； real-time fluorescence quantitative PCR
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.012
植物ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters— ABC转运蛋白），是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族[1]，存在于植物细胞的质膜、液泡、线粒体和过氧化物酶体中[2]，参与植物细胞生命活动的多种过程，影响产量和品质形成[3]。根据HAGO系统（基于越橘转录组测序的PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析）命名法，植物ABC转运蛋白基因分为八大亚族：ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCH[4]，不過目前在植物中未发现ABCH亚家族成员[5]，在拟南芥中，Kang等[6]将更简单的ABC转运蛋白命名为细菌型的ABCI家族。其中ABCG是最大的亚族，包含WBC（White-brown complex homologue）和PDR（Pleiotropic drug resistance）2种类型[7]。水生植物浮萍SpTUR2是第一个被鉴定的PDR基因[8]，随后研究人员分别在拟南芥中鉴定出15个PDR转运蛋白基因，水稻中鉴定出23个[9]，越橘中鉴定出21个[10]，近年来随着基因克隆技术的发展，小麦、苜蓿和大豆等PDR基因也被克隆和鉴定出[11-14]。研究发现，PDR蛋白家族在植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和气孔的功能调节等一系列过程中都发挥作用，因而备受人们关注[15]。
我国是世界上柚类生产面积最大的国家，柚子营养价值丰富，品种多，可以迎合不同人的口味需求，具有重要的农业价值和经济价值。杂草是柑橘类果树种植过程中的大敌，因杂草造成的减产一般达10%～20%，严重时达50%以上[16]。面对疯长的杂草，化学除草剂如草甘膦因其方便、省事、省工，成为许多柑橘果农的首选。草甘膦能直接杀死杂草的根系，但如果长期施用除草剂，会降低土壤有效Fe和Zn的含量，并抑制柑橘对Fe和Zn的吸收。草甘膦在清除杂草的同时，也影响到了柑橘树体的生长，主要表现为抑制蛋白质的合成[17]，而且若由于操作不当或喷药时产生大量的药雾随风漂移，可由果树叶片直接吸收并传导到根系，造成果树伤根及土壤污染板结，根系吸水吸肥能力减弱甚至消失，出现严重败根黄叶，甚至枯死[18]。所以为保证果实产量和品质，在柚子生产过程中，应尽量降低草甘膦造成的不良影响。 在拟南芥已鉴定的15个PDR转运蛋白中，发现AtPDR11可以运输百草枯除草剂[19]。2010和2012年分别有研究表明ABC转运蛋白家族与草甘膦抗性相关[20-21]。依据本实验室建立的红肉蜜柚汁胞不同发育期的RNA-seq数据库，筛选出11条PDR转运蛋白基因，对这11条柚PDR基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明，CmPDR11-2编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，达69.25%，草甘膦和百草枯都是灭生性除草剂，均只有接触绿色组织后才有杀伤作用，两者都能干扰叶绿素的合成和影响植物光合作用[22-23]，故推测CmPDR11-2有可能具有转运草甘膦除草剂的功能。本研究利用RT-PCR技术从红肉蜜柚叶片中克隆得到CmPDR11-2的ORF序列，采用实时荧光定量技术检测草甘膦除草剂胁迫下CmPDR11-2在柚叶中的表达特性，以深入探究PDR转运蛋白在蜜柚的外源毒素的解毒过程中的作用，对利用蜜柚中ABC转运蛋白家族基因进行耐草甘膦除草剂的品质改良具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为福建农林大学园艺学院田间实验室种植的八年生的红肉蜜柚的叶片。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 选取长势一致、外形接近的2株红肉蜜柚植株，再分别选取长势一致的主枝，对其中一株叶片喷洒纯净水，以做对照；另一株喷洒草甘膦。使用量为叶面开始滴水为止。为了营造胁迫环境，草甘膦使用量为正常生产用药的两倍，并加入1%的吐温20。取处理前和处理后1、2、4、8 d和直至外观出现明显差异的第15 d共6次样品，每个时间点取3个生物重复，洗净表面后液氮速冻，存于80 ℃冰箱。
1.2.2 柚PDR基因的筛选 基于本实验室拥有的红肉蜜柚汁胞不同发育期的RNA-seq数据库，通过在KEGG Orthology中关键字ATP-binding cassette筛选，得到77条目的基因，接着，将这77条目的基因在NCBI和甜橙库BLAST后，最终筛选到50条ABC转运蛋白基因。其中ABCA亚族2条、ABCB亚族10条、ABCC亚族9条、ABCD亚族2条、ABCG亚族22条、ABCE亚族1条、ABCF亚族3条、ABCI亚族1条。其中在ABCG亚族中有11条目的PDR基因。
为进一步确定所获得的11条序列是否确为PDR基因，在拟南芥信息资源库（http：//www.-arabidopsis.org/）下载拟南芥15条PDR的蛋白序列，然后使用SMART和NCBI对获得的蛋白序列进行保守结构域分析，以其为模板，继续分析柚PDR的保守结构域，然后利用MEGA 5.2软件进行系统进化树的构建，并将柚11条PDR基因与甜橙、拟南芥数据库进行序列比对，最后结合系统进化树对其进行命名。
1.2.3 柚 PDR 基因的生物信息学分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对11条柚PDR基因编码区进行蛋白质基本理化性质进行分析；利用Plant-mPLoc（http：//www.?csbio.?sjtu.?????-edu.cn/bioinf/plant-multi/）对其进行蛋白质亚细胞定位预测；利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.?dtu.?-dk/services/SignalP/）进行信号肽预测；利用（http：//www.?cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对其进行蛋白质跨膜结构预测；在拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/）查找并下载AtPDR11的氨基酸序列，利用NCBI-ORFfinder （https：// www.????ncbi.?nlm.nih.?gov/orffin?der/）查找并下载11条柚PDR基因的最大ORF的氨基酸序列，并利用DNAMAN 8软件分别与AtPDR11进行比对。
1.2.4 总RNA提取与cDNA第一条链的合成 RNA提取使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒，购于北京百泰克生物技术有限公司。分别提取0、1、2、4、8、15 d的对照组和处理组的叶片的RNA。依照试剂盒说明书操作。
用于RT-PCR的逆转录使用TRANS生物公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒
用于qPCR的逆转录使用Takara生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒。依照试剂盒说明书操作。
1.2.5 CmPDR11-2的引物设计与合成 以红肉蜜柚转录组测序数据中GLEAN10014435为模板，利用Primer Premier 5软件设计引物克隆CmPDR 11-2全编码区。引物序列为CmPDR11-2-F： 5′- ATGAGTATTAGAGTGGCAGATGATCTAGCAAG-3′，CmPDR11-2-R：5′-TTATCTCCTTTGGAA?G-TTGTTGATGGCATAG-3′。委托华大基因公司合成。
利用Beacon Designer 8软件设计引物。再利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.?gov/ tools/primer-blast/）进行引物特异性分析、UNA?Fold（http：//www.idtdna.com/UNAFold）对目标序列进行二级结构分析、Beacon Free Edition（http：// www.premierbiosoft.com/）对引物二级结构进行分析。最后筛选出的定量引物需要满足引物特异性好，目标序列无二级结构，引物无二级结构或者自由能低。CmPDR11-2-F’：5′-CTC?ATG?ACTG-CCACCATCGC-3′，CmPDR11-2-R′：5′-GGCTGCC-CTTTCACGGTAGT-3′。委托华大基因公司合成。 1.2.6 CmPDR11-2的克隆 以红肉蜜柚叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25 μL，其中10×TransTaq HiFi BufferⅡ2.5 μL，dNTPs（10 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板1 μL，TransTaq HiFi DNA polymerase 0.5 μL，加水至终体积25 μL。反应程序为：94 ℃預变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR反应结束后电泳检测，将目的片段回收、连接、转化、测序。
1.2.7 草甘膦胁迫下CmPDR11-2基因表达分析 定量PCR使用Takara生物公司的SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），反应体系为15 μL：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，水3.2 μL。模板为0、1、2、4、8、15 d时对照组和草甘膦处理组的植株叶片的cDNA。反应条件：95 ℃ 30 s（预变性过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环（PCR反应过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s（溶解曲线分析过程）。在耶拿Qtower2.2荧光定量仪上进行qPCR，每个样品进行3个技术重复。内参基因为β-Actin[24]，Actin-F：5-AGAACTATGAACTGCCTGATGGC-3，Actin- R：5-GCTTGGAGCAAGTGCTGTGATT-3。利用2CT法对CmPDR11-2在柚叶中的表达进行 分析。
2 结果与分析
2.1 柚PDR基因的筛选分析
结构域分析结果显示，拟南芥PDR基因和柚PDR基因均具有AAA+类型的ATPase的结构，均属于ABC转运蛋白家族。拟南芥15条PDR基因和柚11条PDR基因的系统进化树如图1所示，结果表明柚PDR基因家族与拟南芥PDR基因家族亲缘关系很近，也进一步验证了我们筛选的结果的正确性。
柚11条PDR基因与甜橙、拟南芥数据库进行核苷酸序列比对，每条序列拟南芥比对结果以分值从高到低列出，整理得出比对分值较高的拟南芥基因有AtPDR1、AtPDR3、AtPDR6、AtPDR7、AtPDR8、AtPDR9、AtPDR11、AtPDR12、AtPDR14等共9个，这9个基因均属于拟南芥PDR型转运
蛋白家族基因。在与甜橙比对结果中发现，除CmPDR12-1与甜橙基因一致度相对较低，为82%外，其他基因与比对的甜橙基因一致度均高达100%。最终确定这11条柚PDR基因筛选正确。并对柚11条PDR基因进行命名（表1）。
2.2 柚PDR基因生物信息分析结果
蛋白质基本理化性质预测分析显示（表2），柚PDR基因编码区序列长度为3 660～4 515 bp，编码1 219～1 504个氨基酸，编码蛋白分子量为137.731 58～170.472 48 ku，理论等电点为6.55～ 8.99，有两个不稳定蛋白CmPDR9和CmPDR11-3，其余稳定，总平均亲水性除CmPDR9和CmPDR1外皆为正值，推测CmPDR9和CmPDR1为亲水性蛋白，其余为疏水性蛋白。信号肽预测结果显示柚11条PDR基因均不包含信号肽；跨膜结构预测结果显示11条PDR基因均具有10个以上跨膜区；亚细胞定位预测结果显示11条PDR基因均定位于细胞膜。与AtPDR11氨基酸序列比对结果显示同源性最高的是CmPDR11-2，为69.25%；最低的是CmPDR9，为45.04%。
2.3 CmPDR11-2基因克隆
CmPDR11-2克隆产物为一条约4 400 bp的亮带（图2），将其连入blunt-zero克隆载体，菌液验证后送铂尚生物公司测序，测序结果与红肉蜜柚转录本GLEAN10014435基因编码区序列完全一致，说明已经完全获得了目的基因，该基因全长为4 371 bp。
2.4 草甘膦胁迫下CmPDR11-2表达分析
处理前和处理后15 d时对照组和处理组叶子外观进行比较，处理前两组叶片外观正常，处理后15 d时，对照组叶片外观依然正常，处理组叶片明显发黄，对比明显（图3）。
实时荧光定量结果（图4）显示草甘膦处理后1～15 d，对照组CmPDR11-2基因相对表达量基本不变，处理组CmPDR11-2基因相对表达量成整体上升的趋势，且处理前对照组和处理组基因相对表达量几乎相等；草甘膦处理后第1天，处理组的基因相对表达量约为对照组的2.3倍，差异极显著；第2～4天，处理组基因相对表达量约为对照组的4倍，差异极显著；第8天，处理组的基因相对表达量约为对照组的5.7倍，差异极显著；第15天，即外观呈现明显差异时，处理组基因相对表达量约为对照组的8倍，差异极显著。
在草甘膦胁迫处理后1 d时，处理组与对照组就呈现极显著差异，说明CmPDR11-2参与草甘膦胁迫响应，且反应迅速；至外观出现明显差异时，CmPDR11-2的相对表达量持续上升，说明该基因在参与草甘膦胁迫响应时，反应持久，这表明CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。
3 讨论
ABCG亚族是NBD-TMD反向序列结构域类型的转运子，包括PDR和WBC两种类型，在目前发现的PDR基因只存在于真菌和植物中，并且是ABC转运蛋白家族中最多的一种类型。当植物长期处于生物或非生物胁迫时，能够形成多种组成型或诱导型防御反应来适应环境变化来维持生存。植物PDR转运蛋白能够通过转运次生代谢物质参与到植物诱导型防御反应中，从而降低胁迫环境对植物造成的不利影响。随着基因组测序技术的提高，植物中越来越多的PDR基因被发现与克隆，但几乎都集中在模式植物如拟南芥或者水稻，且大部分功能还未阐明。目前，红肉蜜柚基 因组测序工作已经完成，但是关于ABC转运蛋白家族的研究还处在起步阶段，本研究依据红肉蜜柚基因组数据库发掘出11条蜜柚PDR亚族基因，为蜜柚ABC转运蛋白家族的研究提供新思路，也可弥补在植物界对于ABC转运蛋白家族的研究都几乎集中在模式植物的不足。
本研究通过CmPDR11-2基因的克隆及对草甘膦胁迫响应表达规律分析，发现CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。Tani等[25]发现外界环境能影响小蓬草草甘膦耐受型和草甘膦敏感型的关键ABC（EPSPS1、M10和M11）基因的表达，35 ℃、光照条件下，草甘膦耐受型植株的EPSPS1、M10和M11基因的表达量在不同浓度草甘膦胁迫下均高于草甘膦敏感型植株内的表达量，其中EPSPS1在草甘膦1倍浓度、M10于8倍浓度、M11于1和8倍浓度下时差异最显著，而在35 ℃、黑暗条件下时，EPSPS1、M10和M11基因表达量明显降低，且差异不明显，24 ℃、光照条件下时的结果与35 ℃、光照条件下非常相似，可见光照可影响ABC基因响应草甘膦胁迫的机制。在拟南芥中，AtPDR11可以运输百草枯除草剂，百草枯为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，对叶绿体层膜破坏力极强，使光合作用和叶绿素合成很快中止，CmPDR11-2在柚11条PDR基因中与AtPDR11同源性最高，达69.25%，综上，CmPDR11-2的耐草甘膦性很可能与光照条件有关。
但是本研究中处理组柚叶内CmPDR11-2表达量何时回落正常表达水平应进一步研究，且为了试验的完善性，应设置光照和黑暗条件，分别对不同浓度草甘膦胁迫下对照组和处理组柚叶内CmPDR11-2的表达量情况进行分析。
参考文献
[1] Martinoia E， Klein M， Geisler M， et al. Multifunctionality of plant ABC transporters-more than just detoxifiers[J]. Planta， 2002， 214（3）： 345-355.
[2] 邵若玄， 沈忆坷， 周文彬， 等. 植物ATP结合盒（ABC）转运蛋白研究进展[J]. 浙江农林大学学报， 2013， 30（5）： 761-768.
[3] Rea P A. P1ant ATP-binding cassette transporters[J]. Annual Review of Plant Biology， 2007， 58： 347-375.
[4] Verrier P J， Bird D， Burla B， et al. Plant ABC proteins-a unified nomenclature and updated inventory[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（4）： 151-159.
[5] 王晓珠， 孙万梅， 马义峰， 等. 拟南芥ABC转运蛋白研究进展[J]. 植物生理学报， 2017， 53 （2）： 133-144.
[6] Kang J， Park J， Choi H， et al. Plant ABC transporters[J/OL]. The Arabidopsis Book， 2011， 9： e0153[2017-12-01]. http：//doi.org/10.1199/tab.0153.
[7] Nuruzzaman M， Zhang R， Cao H Z， et al. Plant pleiotropic drug resistance transporters： transport mechanism， gene expression， and function[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2014， 56（8）： 729-740.
[8] Van den Brule S， Müller A， Fleming A J， et al. The ABC transporter SpTUR2 confers resistance to the antifungal diterpene sclareol[J]. The Plant Journal， 2002， 30（6）： 649- 662.
[9] Schulz B， Kolukisaoglu H U. Genomics of plant ABC transporters： the alphabet of photosynthetic life forms or just holes in membranes[J]. FEBS Letters， 2006， 580（4）： 1 010-1 016.
[10] 刘红弟， 陈 丽， 康立敏， 等. 基于转录组测序的越橘PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析[J]. 吉林农业大学学报， 2015， 37（6）： 674-681.
[11] Stukkens Y， Bultreys A， Grec S， et al. NpPDR1， a pleiotropic drug resistance-type ATP-binding cassette transporter from Nicotiana plumbaginifolia， plays a major role in plant pathogen defense[J]. Plant Physiology， 2005， 139（1）： 341-352.
[12] 尚 毅， 肖 進， 马璐琳， 等. 小麦中一个PDR型ABC转运蛋白基因的克隆和特征分析[J]. 科学通报， 2009， 54（17）： 2 500-2 507. [13] Jasinski M， Banasiak J， Radom M， et al. Full-size ABC transporters from the ABCG subfamily in medicago truncatula[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2009， 22（8）： 921-931.
[14] Eichhorn H， Klinghammer M， Becht P， et al. Isolation of a novel ABC-transporter gene from soybean induced by salicylic acid[J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（10）： 2 193-2 201.
[15] 谢小芳， 陈志伟， 吴为人. 植物PDR蛋白家族的进化分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2012， 31（6）： 617-623.
[16] 马永林， 覃建林， 马跃峰， 等. 几种除草剂对柑橘园入侵性杂草假臭草防除效果[J]. 农药， 2013， 52（6）： 444-446.
[17] 廖聪学， 欧 毅， 谢永红. 几种除草剂对土壤养分供应和柑橘植株吸收的影响[J]. 西南园艺， 2004， 32（2）： 17-19.
[18] 王兆振， 毕亚玲， 丛 聪， 等. 除草剂对作物的药害研究[J]. 农药科学与管理. 2013， 34（5）： 68-73.
[19] Xi J， Xu P， Xiang C B. Loss of AtPDR11， a plasma membrane-localized ABC transporter， confers paraquat tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal： for Cell and Molecular Biology， 2012， 69（5）： 782-791.
[20] Peng Y， Abercrombie L L G， Yuan J S， et al. Characterization of the horseweed （Conyza canadensis） transcriptome using GS-FLX 454 pyrosequencing and its application for expression analysis of candidate non-target herbicide resistance genes[J]. Pest Management Science， 2010， 66（10）： 1 053-1 062.
[21] Nol N， Tsikou D， Eid M， et al. Shikimate leaf disc assay for early detection of glyphosate resistance in Conyza canadensis and relative transcript levels of EPSPS and ABC transporter genes[J]. Weed Research， 2012， 52（3）： 233-241.
[22] 張 冬， 张 宇， 王 萌. 草甘膦对植物生理影响的研究进展[J]. 热带农业科学， 2016， 36（9）： 55-61.
[23] 万 盼， 熊兴政， 黄小辉. 2种农药胁迫对油桐幼苗叶绿素荧光特性及生长的影响[J]. 林业科学， 2016， 52（7）： 22-29.
[24] Wang X Y， Wang P， Qi Y P， et al. Effects of granulation on organicacid metabolism and its relation to mineral elements in Citrus grandis juice sacs[J]. Food Chemistry， 2014， 145： 984-990.
[25] Tani E， Chachalis D， Travlos I S， et al. Environmental conditions in?uence induction of key ABC-transporter genes affecting glyphosate resistance mechanism in Conyza canadensis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016， 17（4）： 342.