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摘要 以盐城地区分布广泛的新鲜环毛蚓为原料。经过4℃抽提、分段盐析、SephadexG-100凝胶柱层析、PEG-6000浓缩以及制备电泳等步骤分离纯化蚯蚓纤溶酶。在聚丙烯酰铵凝胶电泳和纤维平板活性检测的基础上，选用割胶的方式，最终得到蚯蚓纤溶酶的一种单一组分。该酶具有较强的溶解纤维蛋白的作用，SDS-PAGE测得其分子量为20KD。不同pH对其纤溶活性影响不同。采用单因素方差分析和多重比较，结果表明DH为8.0-12.0环境下该纤溶酶活性均较大。其中pH为9.0～12.0相互之间差异不显著，pH为9.0与8.0差异极显著，pH为10.0与8.0差异显著。
关键词 环毛蚓 蚯蚓纤溶酶 分离纯化
中图分类号0-33 文献标识码B
血栓栓塞性疾病如脑血栓、冠心病已成为当今危及人类生命的常见多发病。因此，寻找有效的治疗药物是国内外医药学界重点攻关内容之一。链激酶、尿激酶及组织型纤溶酶原激活物(t－PA)的问世使这类疾病得以治疗。但是近年来由于艾滋病对人类的危害日益加深，新的溶栓、抗栓药物亟待研究。自1983年，日本宫崎医科大学美原恒教授首先从蚯蚓体内分离出纤溶酶，并以此为原料制成的溶栓药物以其服用方便、副作用小、药理作用广而广泛应用于临床。国内许多单位相继研究报道了部分蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质方面的研究工作，但是关于盐城地区环毛蚓纤溶酶的研究还未见报道。由于蚯蚓来源不同，蚯蚓个体的蛋白质种类和含量也不同。我国蚯蚓品种有300种左右，其中13种用作中药。环毛蚓属毛足纲、巨蚓科、环毛属。本实验着重探讨该酶的分离纯化方法，并在此基础上利用单因素方差分析和Duncan比较方法研究pH值对其活性的影响。
1 材料和方法
1，1材料和试剂
蚯蚓为环毛蚓，在龙冈中学校园内挖掘；法布莱士冻干人纤维蛋白原、凝血酶、SephadexG-100、尿激酶、其他试剂均为国产分析纯。
1，2仪器
冷冻高速离心机；凝胶柱层析系统；电泳仪；蛋白检测仪。
1，3方法
1，3，1蚯蚓纤溶酶粗液的制备
新鲜蚯蚓洗净，吐泥2 d，再洗净、滤纸吸干水份称重。置于预冷小烧杯内快速剪成组织糜状后迅速匀浆。加入等体积pH为8.0，0.02 mol／L的磷酸缓冲液在4摄氏度下浸提过夜，离心(8 000 r／min，30 min)，取上清液密封备用。
1，3，2蚯蚓纤溶酶的分离纯化
盐析曲线的制作：取一定量的蚯蚓纤溶酶粗品，分7次加入硫酸铵至不同饱和度，单独收集每次沉淀。沉淀充分溶解于PBS中，测定其蛋白含量。
分段盐析：向粗酶液中逐量加入研磨细的硫酸铵固体至20％饱和度，同上离心取上清；再加硫酸铵至60％饱和度，同上离心取沉淀。
透析除盐：以蒸馏水为透析液，用10％BaCl2检测SO当不再出现白色沉淀时更换透析液为PBS，至沉淀量不再减少时停止透析。
凝胶过滤层析：选取SephadexG-100灌制层析柱(2.5 cmx50 cm)，经PBS平衡后，取样品液上柱，同样的缓冲液洗脱，收集有活性的洗脱液。
浓缩：PEG-6000浓缩洗脱液。
电泳制备及活性印记试验：按照Laemmli方法进行，垂直电泳槽制作不连续电泳系统：12％分离胶，5％浓缩胶。将上述浓缩液加样2孔电泳结束后切开凝胶，一半用于测定纤溶活性，一半用于染色对照。同样的方法电泳后，从凝胶上切下目的条带捣碎并用PBS充分洗脱蛋白。
1，3，3 SDS-PAGE
按照Weberk方法进行。
1，3，4蚯蚓纤溶酶的活力测定
按照Astrup方法制备纤维蛋白平板。各样品加样5 uL，37摄氏度保温2 h，测定溶圈两相互垂直直径作乘积，以尿激酶为标准计算酶活力。
1，3，5蛋白浓度测定
采用考马司亮蓝法。
1，3，6 pH对酶纤溶活性影响
样品液与pH为1-14的缓冲液充分混合，37℃放置2 h。测定、计算酶活力。对活性较大的pH做重复试验，并在此基础上进行单因素方差分析和Duneun比较。
2 结果与分析
2，1硫酸铵盐析曲线图
纤维蛋白检测结果表明30％－60％饱和度沉淀溶解物有纤溶活性，低于20％和大于60％饱和度的沉淀溶解物无活性(图1)。
2，2 Sephadex
G-100凝胶柱层析图谱：洗脱曲线呈现3个峰。其中峰Ⅲ无纤溶活性，峰I和峰Ⅱ具有纤溶活性，且峰Ⅱ活性高于峰I(图2)。
2，3 PAGE和印记试验
洗脱样品液浓缩液进行及活性检测，结果如图3所示，聚丙烯酰铵凝胶电泳条带中对应有三个条带有溶栓活性。
2，4蚯蚓纤溶酶纯化各步酶比活力变化
随着纯化倍数的逐渐增加，总蛋白含量呈下降趋势，但酶的比活力依次增大(表1)。
2，5 SDS-PAGE测定结果
采取割胶的方式将有活性的三个条带割下，分别用PBS洗脱。洗脱液浓缩后经SDS-PAGE得到一电泳纯物质，其分子量为20 KD。
2，6不同pH对酶活力影响
pH为1-3、13-14条件下溶圈内有白色沉淀出现，可能该酶因强酸或强碱作用而变性；pH为5－7之间酶纤溶活性随pH升高而逐渐增强；pH为8-12作用下纤溶活性均较强。对pH为8-12做5组重复实验，单因素方差分析结果表明：pH为8.0，pH为9.0，pH为10.0，pH为11.0，pH为12.0对蚯蚓纤溶酶活性影响差异显著(表2、表3、表4)。
3 讨论
环毛蚓组织经过一系列分离纯化步骤得到纤溶酶的单一组分，纤维蛋白平板法活力检测表明该组分能溶解纤维蛋白，且纤溶活性较强。因此它的开发研究无疑将扩大蚯蚓的应用范围；将在生化、医药等领域具有重要的理论和应用意义；也很可能给盐城地区乃至更大、更多区域带来可观的经济效益。不同pH作用结果表明该酶的稳定范围是pH为5.0-12.0，其中pH为8.0－12.0下效果较优。所以在pH为0.9～1.5的胃酸环境中，盐城环毛蚓纤溶酶将会因变性而失去药效。因此，以该酶为原料的胶囊或口服剂不能制成胃溶型。结合最近研究成果：蚯蚓纤溶酶可直接由肠上皮吸收，是一种“穿肠而过的生物大分子”，说明该酶可制成肠溶型溶栓、抗栓药物。
关键词 环毛蚓 蚯蚓纤溶酶 分离纯化
中图分类号0-33 文献标识码B
血栓栓塞性疾病如脑血栓、冠心病已成为当今危及人类生命的常见多发病。因此，寻找有效的治疗药物是国内外医药学界重点攻关内容之一。链激酶、尿激酶及组织型纤溶酶原激活物(t－PA)的问世使这类疾病得以治疗。但是近年来由于艾滋病对人类的危害日益加深，新的溶栓、抗栓药物亟待研究。自1983年，日本宫崎医科大学美原恒教授首先从蚯蚓体内分离出纤溶酶，并以此为原料制成的溶栓药物以其服用方便、副作用小、药理作用广而广泛应用于临床。国内许多单位相继研究报道了部分蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质方面的研究工作，但是关于盐城地区环毛蚓纤溶酶的研究还未见报道。由于蚯蚓来源不同，蚯蚓个体的蛋白质种类和含量也不同。我国蚯蚓品种有300种左右，其中13种用作中药。环毛蚓属毛足纲、巨蚓科、环毛属。本实验着重探讨该酶的分离纯化方法，并在此基础上利用单因素方差分析和Duncan比较方法研究pH值对其活性的影响。
1 材料和方法
1，1材料和试剂
蚯蚓为环毛蚓，在龙冈中学校园内挖掘；法布莱士冻干人纤维蛋白原、凝血酶、SephadexG-100、尿激酶、其他试剂均为国产分析纯。
1，2仪器
冷冻高速离心机；凝胶柱层析系统；电泳仪；蛋白检测仪。
1，3方法
1，3，1蚯蚓纤溶酶粗液的制备
新鲜蚯蚓洗净，吐泥2 d，再洗净、滤纸吸干水份称重。置于预冷小烧杯内快速剪成组织糜状后迅速匀浆。加入等体积pH为8.0，0.02 mol／L的磷酸缓冲液在4摄氏度下浸提过夜，离心(8 000 r／min，30 min)，取上清液密封备用。
1，3，2蚯蚓纤溶酶的分离纯化
盐析曲线的制作：取一定量的蚯蚓纤溶酶粗品，分7次加入硫酸铵至不同饱和度，单独收集每次沉淀。沉淀充分溶解于PBS中，测定其蛋白含量。
分段盐析：向粗酶液中逐量加入研磨细的硫酸铵固体至20％饱和度，同上离心取上清；再加硫酸铵至60％饱和度，同上离心取沉淀。
透析除盐：以蒸馏水为透析液，用10％BaCl2检测SO当不再出现白色沉淀时更换透析液为PBS，至沉淀量不再减少时停止透析。
凝胶过滤层析：选取SephadexG-100灌制层析柱(2.5 cmx50 cm)，经PBS平衡后，取样品液上柱，同样的缓冲液洗脱，收集有活性的洗脱液。
浓缩：PEG-6000浓缩洗脱液。
电泳制备及活性印记试验：按照Laemmli方法进行，垂直电泳槽制作不连续电泳系统：12％分离胶，5％浓缩胶。将上述浓缩液加样2孔电泳结束后切开凝胶，一半用于测定纤溶活性，一半用于染色对照。同样的方法电泳后，从凝胶上切下目的条带捣碎并用PBS充分洗脱蛋白。
1，3，3 SDS-PAGE
按照Weberk方法进行。
1，3，4蚯蚓纤溶酶的活力测定
按照Astrup方法制备纤维蛋白平板。各样品加样5 uL，37摄氏度保温2 h，测定溶圈两相互垂直直径作乘积，以尿激酶为标准计算酶活力。
1，3，5蛋白浓度测定
采用考马司亮蓝法。
1，3，6 pH对酶纤溶活性影响
样品液与pH为1-14的缓冲液充分混合，37℃放置2 h。测定、计算酶活力。对活性较大的pH做重复试验，并在此基础上进行单因素方差分析和Duneun比较。
2 结果与分析
2，1硫酸铵盐析曲线图
纤维蛋白检测结果表明30％－60％饱和度沉淀溶解物有纤溶活性，低于20％和大于60％饱和度的沉淀溶解物无活性(图1)。
2，2 Sephadex
G-100凝胶柱层析图谱：洗脱曲线呈现3个峰。其中峰Ⅲ无纤溶活性，峰I和峰Ⅱ具有纤溶活性，且峰Ⅱ活性高于峰I(图2)。
2，3 PAGE和印记试验
洗脱样品液浓缩液进行及活性检测，结果如图3所示，聚丙烯酰铵凝胶电泳条带中对应有三个条带有溶栓活性。
2，4蚯蚓纤溶酶纯化各步酶比活力变化
随着纯化倍数的逐渐增加，总蛋白含量呈下降趋势，但酶的比活力依次增大(表1)。
2，5 SDS-PAGE测定结果
采取割胶的方式将有活性的三个条带割下，分别用PBS洗脱。洗脱液浓缩后经SDS-PAGE得到一电泳纯物质，其分子量为20 KD。
2，6不同pH对酶活力影响
pH为1-3、13-14条件下溶圈内有白色沉淀出现，可能该酶因强酸或强碱作用而变性；pH为5－7之间酶纤溶活性随pH升高而逐渐增强；pH为8-12作用下纤溶活性均较强。对pH为8-12做5组重复实验，单因素方差分析结果表明：pH为8.0，pH为9.0，pH为10.0，pH为11.0，pH为12.0对蚯蚓纤溶酶活性影响差异显著(表2、表3、表4)。
3 讨论
环毛蚓组织经过一系列分离纯化步骤得到纤溶酶的单一组分，纤维蛋白平板法活力检测表明该组分能溶解纤维蛋白，且纤溶活性较强。因此它的开发研究无疑将扩大蚯蚓的应用范围；将在生化、医药等领域具有重要的理论和应用意义；也很可能给盐城地区乃至更大、更多区域带来可观的经济效益。不同pH作用结果表明该酶的稳定范围是pH为5.0-12.0，其中pH为8.0－12.0下效果较优。所以在pH为0.9～1.5的胃酸环境中，盐城环毛蚓纤溶酶将会因变性而失去药效。因此，以该酶为原料的胶囊或口服剂不能制成胃溶型。结合最近研究成果：蚯蚓纤溶酶可直接由肠上皮吸收，是一种“穿肠而过的生物大分子”，说明该酶可制成肠溶型溶栓、抗栓药物。