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【摘要】 目的:研究精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响。方法:选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象,根据精子DNA完整性将其分为A组(精子DNA完整性<30%)34例、B组(30%<精子DNA完整性<60%)42例以及C组(精子DNA完整性≥60%)35例,观察三精子质量及人工授精后的妊娠结局。结果:B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组,但仅精子总数、前向运动精子率差异有统计学意义(P<0.05)。三组患者的临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组 【关键词】 不育症; 夫精人工授精; DNA完整性; 临床妊娠率
男性不育症是临床常见疾病,其发生与精子质量不良密切相关。目前研究认为,精子DNA完整性会影响精子质量,DNA破碎程度增高会产生负面影响,造成不育和反复流产[1]。人工授精是治疗男性不育症的主要方法之一[2]。本研究分析精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响,现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象,纳入标准:(1)符合第5版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》中男性不育症的诊断[3];(2)符合人工授精启动标准;(3)取得患者知情同意,并签署人工授精知情同意书。111例男性不育症患者研究期间无失访、脱落病例,根据精子DNA完整性将其分为A组(精子DNA完整性<30%)34例、B组(30%<精子DNA完整性<60%)42例以及C组(精子DNA完整性≥60%)35例。三组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 精液常规检查 人工授精治疗当日,患者未排精3~7 d,在取精室内通过手淫法收集精液,精液液化后检测精子总数、精子浓度和精子活力等。
1.2.2 精子完整性检测方法 (1)准备:手淫取出的精液在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中洗涤,离心后悬浮精子至浓度为10×106/mL;(2)制片:70 μL的l%低熔点琼脂糖于融化于65~90 ℃水中,并在37 ℃下放置约3 min,后加入处理后的精子悬液30 μL,混匀后吸取20 μL混合液体,滴在0.65%标准琼脂糖凝胶包被的玻片上,盖上盖玻片,4 ℃冰箱放置3~5 min,取出后揭去盖玻片;(3)样本处理:将载玻片放入新鲜的0.08 mol/L盐酸中,22 ℃下避光7 min,后放入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内约25 min,再将载玻片置于PBS 5 min,后依次置入70%、90%、l00%的乙醇,晾干备用;(4)染色:用瑞士吉姆萨染液染色25~20 min;(5)观察并计数:载玻片自然风干后,于40倍显微镜下观察至少200个精子,判断标准:精子头部周围晕环宽度不小于精子头部半径,认为该精子染色质DNA完整,否则则认为精子DNA完整性破坏。精子完整性=DNA完整精子数/计数精子总数×100%[4]。
1.2.3 人工授精操作方法 女方选择枸橼酸氯米芬片或注射用尿促性素(HMG)对女方进行促排卵治疗,根据卵泡监测大小及血清LH、E2水平适时注射人绒毛膜粗性腺激素(hCG)5000~10 000 U,24~36 h后行人工授精治疗,男方精液行梯度离心法进行优化选择,次日检测排卵情况,排卵后给予黄体酮胶丸200 mg口服,每晚1次,或黄体酮注射液20 mg,每日1次支持治疗。2周后,检测尿液中hCG水平,阳性为生化妊娠,4周后,行阴道B超检查,若宫腔内可见孕囊则为临床妊娠。
1.3 观察指标 统计患者精液处理前的精液质量,包括精子总数、精子浓度、前向运动精子,同时统计各组的生化妊娠数及临床妊娠数。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,用完全随机设计方差分析,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组,但仅精子总数、前向运动精子率差异均有统计学意义(P<0.05)。三组患者的生化妊娠率、临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组 3 讨论
不育症是指育龄期机体功能正常的夫妇在保持正常性生活、且未采用避孕措施的条件下,超过1年时间仍未能生育[5-6]。不育症占不孕不育症的比例超过30%。相关的研究认为,男性不育症的发生与精子质量不良密切相关[7]。
目前检测精子质量的指标主要包括精子数量、存活率和抗精子抗体。但这些指标的检测过程中受检查者的主观判断影响较大,不利于疾病的准确诊断。近年来,国外的研究发现男性不育患者的DNA碎片会明显增多,而DNA碎片程度反映精子遗传物质的完整性,精子DNA发生碎片化对生育将会产生负面影响,造成不育和反复流产[8]。研究认为检测精子DAN的完整性能够有效评价精液质量和预测生育能力[9]。
在上述研究中笔者分析了精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响,旨在为临床中探寻筛查不育症、判断精液质量和生育能力的辅助检查指标提供更多的理论依据。目前关于DNA完整性的流行病学资料显示,精子DNA的碎片化程度与体外受精的成功率呈显著负相关,当DNA碎片化的精子比例超过10%时,受精率明显降低;而当这一比例超过20%时,受精率更是下降了超过50%[10]。为此,笔者将接受人工授精的患者分为A组(精子DNA完整性<30%)、B组(30%<精子DNA完整性<60%)以及C组(精子DNA完整性≥60%),进一步观察妊娠结局可以发现:DNA完整率越高,其患者精液质量越高,精子总数及前向运动精子率越高,临床妊娠率越高。本研究表明精子DNA结构的完整性与精子质量关系密切,DNA完整性越好、精子质量越好。精子DNA完整性可能通过精子质量影响人工授精妊娠率。
综上所述,精子DNA完整性与人工授精妊娠结局密切相关,DNA完整性越好,精子质量越好,临床妊娠率也越高。
参考文献
[1] Bungum M,Humaidan P,Axmon A,et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome[J].Hum Reprod,2007,22(1):174-179.
[2]白静,李静,高瑞格.236周期宫腔内人工授精临床分析[J].中国医学创新,2011,8(8):160-161.
[3]世界卫生组织.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2011:53-86.
[4]王玮玮,王厚照,张玲,等.精子染色质扩散法检测精子DNA完整性方法探讨及临床意义[J].国际检验医学杂志,2012,33(14):1723-1724.
[5]苏静,薛惠英.精子DNA损伤与夫精宫腔内人工授精妊娠率的关系[J].医学临床研究,2013,30(1):167-168.
[6]熊付兴,莫晓彬.运用生精胶囊治疗男性不育症的疗效及安全性分析[J].中国医学创新,2012,9(12):100-101.
[7]黄茜,丘映,史秋雯,等.精子DNA损伤与精子形态,顶体完整率的关系研究[J].国际检验医学杂志,2013,34(6):649-650.
[8]张鑫,张昌军,罗清炳,等.精子DNA损伤对妊娠结局的影响及临床意义[J].求医问药:下半月刊,2012,10(6):59-60.
[9]黄茜,丘映,史秋雯,等.年龄,禁欲时间对精液质量的影响[J].中外医学研究,2013,11(14):1-2.
[10]刘安娜,董佳,王厚照.精子DNA完整性对男性不育患者精子质量的影响分析[J].中国优生与遗传杂志,2013,21(2):113-114.
(收稿日期:2013-12-04) (本文编辑:欧丽)
男性不育症是临床常见疾病,其发生与精子质量不良密切相关。目前研究认为,精子DNA完整性会影响精子质量,DNA破碎程度增高会产生负面影响,造成不育和反复流产[1]。人工授精是治疗男性不育症的主要方法之一[2]。本研究分析精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响,现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象,纳入标准:(1)符合第5版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》中男性不育症的诊断[3];(2)符合人工授精启动标准;(3)取得患者知情同意,并签署人工授精知情同意书。111例男性不育症患者研究期间无失访、脱落病例,根据精子DNA完整性将其分为A组(精子DNA完整性<30%)34例、B组(30%<精子DNA完整性<60%)42例以及C组(精子DNA完整性≥60%)35例。三组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 精液常规检查 人工授精治疗当日,患者未排精3~7 d,在取精室内通过手淫法收集精液,精液液化后检测精子总数、精子浓度和精子活力等。
1.2.2 精子完整性检测方法 (1)准备:手淫取出的精液在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中洗涤,离心后悬浮精子至浓度为10×106/mL;(2)制片:70 μL的l%低熔点琼脂糖于融化于65~90 ℃水中,并在37 ℃下放置约3 min,后加入处理后的精子悬液30 μL,混匀后吸取20 μL混合液体,滴在0.65%标准琼脂糖凝胶包被的玻片上,盖上盖玻片,4 ℃冰箱放置3~5 min,取出后揭去盖玻片;(3)样本处理:将载玻片放入新鲜的0.08 mol/L盐酸中,22 ℃下避光7 min,后放入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内约25 min,再将载玻片置于PBS 5 min,后依次置入70%、90%、l00%的乙醇,晾干备用;(4)染色:用瑞士吉姆萨染液染色25~20 min;(5)观察并计数:载玻片自然风干后,于40倍显微镜下观察至少200个精子,判断标准:精子头部周围晕环宽度不小于精子头部半径,认为该精子染色质DNA完整,否则则认为精子DNA完整性破坏。精子完整性=DNA完整精子数/计数精子总数×100%[4]。
1.2.3 人工授精操作方法 女方选择枸橼酸氯米芬片或注射用尿促性素(HMG)对女方进行促排卵治疗,根据卵泡监测大小及血清LH、E2水平适时注射人绒毛膜粗性腺激素(hCG)5000~10 000 U,24~36 h后行人工授精治疗,男方精液行梯度离心法进行优化选择,次日检测排卵情况,排卵后给予黄体酮胶丸200 mg口服,每晚1次,或黄体酮注射液20 mg,每日1次支持治疗。2周后,检测尿液中hCG水平,阳性为生化妊娠,4周后,行阴道B超检查,若宫腔内可见孕囊则为临床妊娠。
1.3 观察指标 统计患者精液处理前的精液质量,包括精子总数、精子浓度、前向运动精子,同时统计各组的生化妊娠数及临床妊娠数。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,用完全随机设计方差分析,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组,但仅精子总数、前向运动精子率差异均有统计学意义(P<0.05)。三组患者的生化妊娠率、临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组 3 讨论
不育症是指育龄期机体功能正常的夫妇在保持正常性生活、且未采用避孕措施的条件下,超过1年时间仍未能生育[5-6]。不育症占不孕不育症的比例超过30%。相关的研究认为,男性不育症的发生与精子质量不良密切相关[7]。
目前检测精子质量的指标主要包括精子数量、存活率和抗精子抗体。但这些指标的检测过程中受检查者的主观判断影响较大,不利于疾病的准确诊断。近年来,国外的研究发现男性不育患者的DNA碎片会明显增多,而DNA碎片程度反映精子遗传物质的完整性,精子DNA发生碎片化对生育将会产生负面影响,造成不育和反复流产[8]。研究认为检测精子DAN的完整性能够有效评价精液质量和预测生育能力[9]。
在上述研究中笔者分析了精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响,旨在为临床中探寻筛查不育症、判断精液质量和生育能力的辅助检查指标提供更多的理论依据。目前关于DNA完整性的流行病学资料显示,精子DNA的碎片化程度与体外受精的成功率呈显著负相关,当DNA碎片化的精子比例超过10%时,受精率明显降低;而当这一比例超过20%时,受精率更是下降了超过50%[10]。为此,笔者将接受人工授精的患者分为A组(精子DNA完整性<30%)、B组(30%<精子DNA完整性<60%)以及C组(精子DNA完整性≥60%),进一步观察妊娠结局可以发现:DNA完整率越高,其患者精液质量越高,精子总数及前向运动精子率越高,临床妊娠率越高。本研究表明精子DNA结构的完整性与精子质量关系密切,DNA完整性越好、精子质量越好。精子DNA完整性可能通过精子质量影响人工授精妊娠率。
综上所述,精子DNA完整性与人工授精妊娠结局密切相关,DNA完整性越好,精子质量越好,临床妊娠率也越高。
参考文献
[1] Bungum M,Humaidan P,Axmon A,et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome[J].Hum Reprod,2007,22(1):174-179.
[2]白静,李静,高瑞格.236周期宫腔内人工授精临床分析[J].中国医学创新,2011,8(8):160-161.
[3]世界卫生组织.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2011:53-86.
[4]王玮玮,王厚照,张玲,等.精子染色质扩散法检测精子DNA完整性方法探讨及临床意义[J].国际检验医学杂志,2012,33(14):1723-1724.
[5]苏静,薛惠英.精子DNA损伤与夫精宫腔内人工授精妊娠率的关系[J].医学临床研究,2013,30(1):167-168.
[6]熊付兴,莫晓彬.运用生精胶囊治疗男性不育症的疗效及安全性分析[J].中国医学创新,2012,9(12):100-101.
[7]黄茜,丘映,史秋雯,等.精子DNA损伤与精子形态,顶体完整率的关系研究[J].国际检验医学杂志,2013,34(6):649-650.
[8]张鑫,张昌军,罗清炳,等.精子DNA损伤对妊娠结局的影响及临床意义[J].求医问药:下半月刊,2012,10(6):59-60.
[9]黄茜,丘映,史秋雯,等.年龄,禁欲时间对精液质量的影响[J].中外医学研究,2013,11(14):1-2.
[10]刘安娜,董佳,王厚照.精子DNA完整性对男性不育患者精子质量的影响分析[J].中国优生与遗传杂志,2013,21(2):113-114.
(收稿日期:2013-12-04) (本文编辑:欧丽)