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【摘要】 目的：研究精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响。方法：选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象，根据精子DNA完整性将其分为A组（精子DNA完整性<30%）34例、B组（30%<精子DNA完整性<60%）42例以及C组（精子DNA完整性≥60%）35例，观察三精子质量及人工授精后的妊娠结局。结果：B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组，但仅精子总数、前向运动精子率差异有统计学意义（P<0.05）。三组患者的临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组 【关键词】 不育症； 夫精人工授精； DNA完整性； 临床妊娠率
男性不育症是临床常见疾病，其发生与精子质量不良密切相关。目前研究认为，精子DNA完整性会影响精子质量，DNA破碎程度增高会产生负面影响，造成不育和反复流产[1]。人工授精是治疗男性不育症的主要方法之一[2]。本研究分析精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象，纳入标准：（1）符合第5版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》中男性不育症的诊断[3]；（2）符合人工授精启动标准；（3）取得患者知情同意，并签署人工授精知情同意书。111例男性不育症患者研究期间无失访、脱落病例，根据精子DNA完整性将其分为A组（精子DNA完整性<30%）34例、B组（30%<精子DNA完整性<60%）42例以及C组（精子DNA完整性≥60%）35例。三组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 精液常规检查 人工授精治疗当日，患者未排精3～7 d，在取精室内通过手淫法收集精液，精液液化后检测精子总数、精子浓度和精子活力等。
1.2.2 精子完整性检测方法 （1）准备：手淫取出的精液在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中洗涤，离心后悬浮精子至浓度为10×106/mL；（2）制片：70 μL的l%低熔点琼脂糖于融化于65～90 ℃水中，并在37 ℃下放置约3 min，后加入处理后的精子悬液30 μL，混匀后吸取20 μL混合液体，滴在0.65%标准琼脂糖凝胶包被的玻片上，盖上盖玻片，4 ℃冰箱放置3～5 min，取出后揭去盖玻片；（3）样本处理：将载玻片放入新鲜的0.08 mol/L盐酸中，22 ℃下避光7 min，后放入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内约25 min，再将载玻片置于PBS 5 min，后依次置入70%、90%、l00%的乙醇，晾干备用；（4）染色：用瑞士吉姆萨染液染色25～20 min；（5）观察并计数：载玻片自然风干后，于40倍显微镜下观察至少200个精子，判断标准：精子头部周围晕环宽度不小于精子头部半径，认为该精子染色质DNA完整，否则则认为精子DNA完整性破坏。精子完整性=DNA完整精子数/计数精子总数×100%[4]。
1.2.3 人工授精操作方法 女方选择枸橼酸氯米芬片或注射用尿促性素（HMG）对女方进行促排卵治疗，根据卵泡监测大小及血清LH、E2水平适时注射人绒毛膜粗性腺激素（hCG）5000～10 000 U，24～36 h后行人工授精治疗，男方精液行梯度离心法进行优化选择，次日检测排卵情况，排卵后给予黄体酮胶丸200 mg口服，每晚1次，或黄体酮注射液20 mg，每日1次支持治疗。2周后，检测尿液中hCG水平，阳性为生化妊娠，4周后，行阴道B超检查，若宫腔内可见孕囊则为临床妊娠。
1.3 观察指标 统计患者精液处理前的精液质量，包括精子总数、精子浓度、前向运动精子，同时统计各组的生化妊娠数及临床妊娠数。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，用完全随机设计方差分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组，但仅精子总数、前向运动精子率差异均有统计学意义（P<0.05）。三组患者的生化妊娠率、临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组 3 讨论
不育症是指育龄期机体功能正常的夫妇在保持正常性生活、且未采用避孕措施的条件下，超过1年时间仍未能生育[5-6]。不育症占不孕不育症的比例超过30%。相关的研究认为，男性不育症的发生与精子质量不良密切相关[7]。
目前检测精子质量的指标主要包括精子数量、存活率和抗精子抗体。但这些指标的检测过程中受检查者的主观判断影响较大，不利于疾病的准确诊断。近年来，国外的研究发现男性不育患者的DNA碎片会明显增多，而DNA碎片程度反映精子遗传物质的完整性，精子DNA发生碎片化对生育将会产生负面影响，造成不育和反复流产[8]。研究认为检测精子DAN的完整性能够有效评价精液质量和预测生育能力[9]。
在上述研究中笔者分析了精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响，旨在为临床中探寻筛查不育症、判断精液质量和生育能力的辅助检查指标提供更多的理论依据。目前关于DNA完整性的流行病学资料显示，精子DNA的碎片化程度与体外受精的成功率呈显著负相关，当DNA碎片化的精子比例超过10%时，受精率明显降低；而当这一比例超过20%时，受精率更是下降了超过50%[10]。为此，笔者将接受人工授精的患者分为A组（精子DNA完整性<30%）、B组（30%<精子DNA完整性<60%）以及C组（精子DNA完整性≥60%），进一步观察妊娠结局可以发现：DNA完整率越高，其患者精液质量越高，精子总数及前向运动精子率越高，临床妊娠率越高。本研究表明精子DNA结构的完整性与精子质量关系密切，DNA完整性越好、精子质量越好。精子DNA完整性可能通过精子质量影响人工授精妊娠率。
综上所述，精子DNA完整性与人工授精妊娠结局密切相关，DNA完整性越好，精子质量越好，临床妊娠率也越高。
参考文献
[1] Bungum M，Humaidan P，Axmon A，et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome[J].Hum Reprod，2007，22（1）：174-179.
[2]白静，李静，高瑞格.236周期宫腔内人工授精临床分析[J].中国医学创新，2011，8（8）：160-161.
[3]世界卫生组织.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2011：53-86.
[4]王玮玮，王厚照，张玲，等.精子染色质扩散法检测精子DNA完整性方法探讨及临床意义[J].国际检验医学杂志，2012，33（14）：1723-1724.
[5]苏静，薛惠英.精子DNA损伤与夫精宫腔内人工授精妊娠率的关系[J].医学临床研究，2013，30（1）：167-168.
[6]熊付兴，莫晓彬.运用生精胶囊治疗男性不育症的疗效及安全性分析[J].中国医学创新，2012，9（12）：100-101.
[7]黄茜，丘映，史秋雯，等.精子DNA损伤与精子形态，顶体完整率的关系研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（6）：649-650.
[8]张鑫，张昌军，罗清炳，等.精子DNA损伤对妊娠结局的影响及临床意义[J].求医问药：下半月刊，2012，10（6）：59-60.
[9]黄茜，丘映，史秋雯，等.年龄，禁欲时间对精液质量的影响[J].中外医学研究，2013，11（14）：1-2.
[10]刘安娜，董佳，王厚照.精子DNA完整性对男性不育患者精子质量的影响分析[J].中国优生与遗传杂志，2013，21（2）：113-114.
（收稿日期：2013-12-04） （本文编辑：欧丽）
男性不育症是临床常见疾病，其发生与精子质量不良密切相关。目前研究认为，精子DNA完整性会影响精子质量，DNA破碎程度增高会产生负面影响，造成不育和反复流产[1]。人工授精是治疗男性不育症的主要方法之一[2]。本研究分析精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2011年1月-2013年1月在本院收治的111例男性不育症患者作为研究对象，纳入标准：（1）符合第5版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》中男性不育症的诊断[3]；（2）符合人工授精启动标准；（3）取得患者知情同意，并签署人工授精知情同意书。111例男性不育症患者研究期间无失访、脱落病例，根据精子DNA完整性将其分为A组（精子DNA完整性<30%）34例、B组（30%<精子DNA完整性<60%）42例以及C组（精子DNA完整性≥60%）35例。三组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 精液常规检查 人工授精治疗当日，患者未排精3～7 d，在取精室内通过手淫法收集精液，精液液化后检测精子总数、精子浓度和精子活力等。
1.2.2 精子完整性检测方法 （1）准备：手淫取出的精液在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中洗涤，离心后悬浮精子至浓度为10×106/mL；（2）制片：70 μL的l%低熔点琼脂糖于融化于65～90 ℃水中，并在37 ℃下放置约3 min，后加入处理后的精子悬液30 μL，混匀后吸取20 μL混合液体，滴在0.65%标准琼脂糖凝胶包被的玻片上，盖上盖玻片，4 ℃冰箱放置3～5 min，取出后揭去盖玻片；（3）样本处理：将载玻片放入新鲜的0.08 mol/L盐酸中，22 ℃下避光7 min，后放入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内约25 min，再将载玻片置于PBS 5 min，后依次置入70%、90%、l00%的乙醇，晾干备用；（4）染色：用瑞士吉姆萨染液染色25～20 min；（5）观察并计数：载玻片自然风干后，于40倍显微镜下观察至少200个精子，判断标准：精子头部周围晕环宽度不小于精子头部半径，认为该精子染色质DNA完整，否则则认为精子DNA完整性破坏。精子完整性=DNA完整精子数/计数精子总数×100%[4]。
1.2.3 人工授精操作方法 女方选择枸橼酸氯米芬片或注射用尿促性素（HMG）对女方进行促排卵治疗，根据卵泡监测大小及血清LH、E2水平适时注射人绒毛膜粗性腺激素（hCG）5000～10 000 U，24～36 h后行人工授精治疗，男方精液行梯度离心法进行优化选择，次日检测排卵情况，排卵后给予黄体酮胶丸200 mg口服，每晚1次，或黄体酮注射液20 mg，每日1次支持治疗。2周后，检测尿液中hCG水平，阳性为生化妊娠，4周后，行阴道B超检查，若宫腔内可见孕囊则为临床妊娠。
1.3 观察指标 统计患者精液处理前的精液质量，包括精子总数、精子浓度、前向运动精子，同时统计各组的生化妊娠数及临床妊娠数。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，用完全随机设计方差分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
B、C组的临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率均明显高于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）。虽然C组的生化妊娠率、临床妊娠率、精子总数、前向运动精子率高于B组，但仅精子总数、前向运动精子率差异均有统计学意义（P<0.05）。三组患者的生化妊娠率、临床妊娠率以及精子数目、前向运动精子率均为A组
不育症是指育龄期机体功能正常的夫妇在保持正常性生活、且未采用避孕措施的条件下，超过1年时间仍未能生育[5-6]。不育症占不孕不育症的比例超过30%。相关的研究认为，男性不育症的发生与精子质量不良密切相关[7]。
目前检测精子质量的指标主要包括精子数量、存活率和抗精子抗体。但这些指标的检测过程中受检查者的主观判断影响较大，不利于疾病的准确诊断。近年来，国外的研究发现男性不育患者的DNA碎片会明显增多，而DNA碎片程度反映精子遗传物质的完整性，精子DNA发生碎片化对生育将会产生负面影响，造成不育和反复流产[8]。研究认为检测精子DAN的完整性能够有效评价精液质量和预测生育能力[9]。
在上述研究中笔者分析了精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响，旨在为临床中探寻筛查不育症、判断精液质量和生育能力的辅助检查指标提供更多的理论依据。目前关于DNA完整性的流行病学资料显示，精子DNA的碎片化程度与体外受精的成功率呈显著负相关，当DNA碎片化的精子比例超过10%时，受精率明显降低；而当这一比例超过20%时，受精率更是下降了超过50%[10]。为此，笔者将接受人工授精的患者分为A组（精子DNA完整性<30%）、B组（30%<精子DNA完整性<60%）以及C组（精子DNA完整性≥60%），进一步观察妊娠结局可以发现：DNA完整率越高，其患者精液质量越高，精子总数及前向运动精子率越高，临床妊娠率越高。本研究表明精子DNA结构的完整性与精子质量关系密切，DNA完整性越好、精子质量越好。精子DNA完整性可能通过精子质量影响人工授精妊娠率。
综上所述，精子DNA完整性与人工授精妊娠结局密切相关，DNA完整性越好，精子质量越好，临床妊娠率也越高。
参考文献
[1] Bungum M，Humaidan P，Axmon A，et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome[J].Hum Reprod，2007，22（1）：174-179.
[2]白静，李静，高瑞格.236周期宫腔内人工授精临床分析[J].中国医学创新，2011，8（8）：160-161.
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[4]王玮玮，王厚照，张玲，等.精子染色质扩散法检测精子DNA完整性方法探讨及临床意义[J].国际检验医学杂志，2012，33（14）：1723-1724.
[5]苏静，薛惠英.精子DNA损伤与夫精宫腔内人工授精妊娠率的关系[J].医学临床研究，2013，30（1）：167-168.
[6]熊付兴，莫晓彬.运用生精胶囊治疗男性不育症的疗效及安全性分析[J].中国医学创新，2012，9（12）：100-101.
[7]黄茜，丘映，史秋雯，等.精子DNA损伤与精子形态，顶体完整率的关系研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（6）：649-650.
[8]张鑫，张昌军，罗清炳，等.精子DNA损伤对妊娠结局的影响及临床意义[J].求医问药：下半月刊，2012，10（6）：59-60.
[9]黄茜，丘映，史秋雯，等.年龄，禁欲时间对精液质量的影响[J].中外医学研究，2013，11（14）：1-2.
[10]刘安娜，董佳，王厚照.精子DNA完整性对男性不育患者精子质量的影响分析[J].中国优生与遗传杂志，2013，21（2）：113-114.
（收稿日期：2013-12-04） （本文编辑：欧丽）