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摘要：本文对色谱-质谱联用新技术进行了综述评论。
目前，LC-MS在技术和应用方面取得了惊人的进展，各种分析模式联用使分析化学家威力大增。几种光谱仪与液相色谱仪的联用，构成一个集成系统，在单次分离过程中就能提供一套综合光谱信息。由这种多维技术创造了“多重联用”（“hyphenation”）这个术语。
一、LC-API-MS
LC-MS联用存在着色谱仪和质谱仪间的压力匹配、流量匹配、气化等问题，为了解决这些难题，实现液相色谱仪和质谱仪的联机，接口技术是关键所在，它决定着LC-MS能否在实际的分析中得以应用。API技术是LC-MS联用接口的一大进步。有关API接口技术Nilsson[1]和余天等[2]的综述作了详细的阐述。API包括电喷雾（Electro spray, ESI）,离子喷雾（Ion spray，ISI）和大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）三种方式。ESI电离是一种“软”电离技术，起源与1917年，但目前ESI电离机理尚无定论[3]，现有两种离子化的机理模型：带电残余物模型（charged-residue model）和离子蒸发模型(ion-evaporation model)，前者认为，随着溶剂蒸发，荷电液滴上的电荷最后残留在溶质分子上而形成离子，并进入气相，后者认为荷电液滴由于库仑排斥作用不断分裂成更小的液滴，在电场的作用下，溶剂化离子从小液滴表面逸出进入气相，这一过程称为场助离子蒸发（field-assisted ion evaporation）,离子携带电荷的数目与离子母体的分子结构和载体溶剂有关。
ESI技术80年代用于质谱，1984年美国耶鲁大学化学工程系John Fenn 教授为首的研究组首次报道了ESI-MS的研究成果，并于四年后率先运用ESI-MS成功地进行蛋白质的分析，从此揭开了ESI-MS用于生物大分子及生命科学研究的序幕。ESI技术易产生多电荷离子，可以扩展质谱的可测质量限度，有利于测定生物大分子的分子量，但多电荷离子不利于离子的结构鉴定。若调控样品溶液的PH值或加入有机酸、有机碱抑制多电荷离子的形成，发展用混合溶剂，如咪唑、六氢吡啶和乙酸溶于乙腈-水（80：20）中作为样品溶剂，既可抑制钾钠加合离子的形成，又可减少多电荷的程度。同时，可通过α粒子碰撞气体分子产生正负电荷的离子，中和多电荷离子电荷，得以控制离子的电荷数，从而简化图谱，提高分析的灵敏度[5]。还有在MS之前设置一漂移管，使质核比相同但带不同数量电荷的离子因在漂移管的漂移时间不等而得以分离，同样达到简化图谱的目的[6]。ESI常常用于肽和蛋白质表征的各个阶段：分子质量的测定；氨基酸的测序；蛋白质的化学和翻译后修饰位置和性能的测定；蛋白质三级和四级结构的研究和共价键和结合的研究[1]。
与ESI不同，CI源是通过反应离子与被测组分分子反应而使组分分子电离的一种电离方法。一般与反应气体碰撞后形成的是单电荷准分子离子，分子质量数可直接观察到。结合源内（in source）CID谱，灵活改变锥体电压（cone voltage）,就能得到具有一定特征的碎片离子。文献[7]采用HPLC/APCI/MS技术实验了六种有机磷农药的分离和定量。结合固相萃取技术，国外已实现了ng/l有机磷农药的鉴定分析[8]总之LC/API/MS进行环境、生物应用的前景非常广阔，可以进行生物分子的分离和鉴定，生物现象的研究，并结合组合化学广泛应用在新药研究，反应过程控制，产量控制以及药物动力学研究等各项工作。
二、LC-MALDI-MS
MALDI是80年代末才出现的新型电离技术，这种技术主要是通过将分析的物质分子从一个适当的固体基质（小分子有机物）分离的方法，释放出完整的大分子量的气体分子离子。MALDI是由激光解吸（LD）质谱发展起来的。激光通过单一或多个光学系统聚焦并通过一窗口进入质谱仪，激光苏般大小在10~300μm,激光束与样品表面角度可调节，一般为30~75o,样品需加入基质，激光打在样品上产生离子，Hilleakamp把离子产生过程归结为四种作用类型[11]：（1）离子直接从固体蒸发；（2）中性分子直接从固体热蒸发并随后在气相状态中电离；（3）激光解吸过程，即有机分子进行共振吸收时分子生色团在固体样品中共振吸收能量，并把绝大部分能量传递到有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时扰动而解吸离子或中性分子；（4）激光形成等离子过程中生成离子[12]。
MALDI的特点：
MALDI谱中单电荷分子离子和双电荷分子离子峰都很强。随着分析量增加，双电荷离子相对丰度增加，并出现多电荷离子，基质信号出现低在质量范围（500-1000Da）。他们有准分子离子和一些特别碎片峰，还有光化学反应产生的家河离子，不同基质在低质量区出现分子离子信号的强度不同，如比样品低，条件好时，甚至不出现基质峰，但MALDI谱图中单电荷分子离子峰站主要地位，且碎片离子少，成为混合物分析的理想手段。
MALDI与其它质谱电离源相比，对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其它非挥发性成分，必须仔细准备样品，这是MALDI 的显著优点。但有两种杂质严重影响分析结果，离子去垢剂（如十二烷基硫酸钠）和低挥发溶剂（如甘油和二甲亚砜），后者有害作用很易解释，故破坏样品的结晶过程，或在样品基质表面形成液膜，妨碍蛋白质离子化过程。
分辨率和灵敏度高是MALDI的又一大特点。早期的 MALDI-TOF分辨率很低（低于1000），质量检测精度只有0.1%，随着仪器的改进和新基质的加入，有很大改善，测定3000蛋白质的精度达0.01%[13]。
与API相比，实现LC-MALDI-MS的在线偶合很困难，因为它需要高真空的条件，但是MALDI比API有进样速度快的优势。MALDI已广泛用于 蛋白质、多肽、DNA、核酸和糖类的测定等方面。例如，为了得到序列离子和更好的解释肽质谱中离子的结构，常采用MALDI与串联质谱（Tandem Mass Spectrometry,MS/MS）结合的方法。在串联质谱中，MS-Ⅰ产生碎片离子，碎片离子经MS-Ⅱ分离后，检测碰撞活化裂解（Collisional activation dissociation）质谱图，简称CAD谱，可推导待测离子的结构。可以用MALDI-TOF-四极杆或MALDI-FTMS，后者有超分辨率的特点，并可以进行n次串联(MS/MS)n。MALDI-FTMS/MS是测寡糖结构最有效的方法[14]。
三、HPLC-NMR-MS
结构测定经常要用到核磁共振（NMR）谱。虽然LC-NMR装置不象LC-MS那样容易得到，那样普遍，但是它在解决实际问题中已经得到广泛应用。HPLC-NMR和HPLC-MS联用仪的问世，使得色谱柱流出物的鉴定手段发生了革命性的变化。近来，HPLC与NMR和MS的联用提供了一种更加有利的手段- HPLC-NMR-MS[15]。该系统是基于传统的HPLC泵系统、柱系统和紫外检测器。紫外检测器提供的紫外光谱数据弥补了NMR和MS数据的不足，使光谱学家更好地确定分析物的保留时间及达到光谱仪的时间。图中NMR和MS平行放置，这样由于NMR和MS灵敏度的不同，可以让两种仪器通过的样品量不同（如NMR：MS=95：5，也可以是其它比例）。另外，还可以控制峰的保留时间及未知物被NMR和MS检测的时间，以致在MS中出现特殊峰时，避免了继续向NMR通入样品的操作。NMR和MS平行放置的缺点是使NMR的效率降低，并且NMR的高磁场也影响MS仪的操作。
HPLC-NMR-MS无论从仪器的商品化生产，还是从复杂程度上，都不愧是一门成熟的技术，已经广泛应用于制药业、药物代谢物的研究、天然产品等方面。HPLC-NMR-MS的联用通过在线接口LC变压器（LC-transform）成功以后，进一步开发了三级联用仪HPLC-NMR-IR-MS[16]。与前者不同的是使用了一个特殊的接口，将通过NMR的样品流以1：1劈开，分别进入NMR中，并且也使用了LC变压器。柱流出物的在线收集可以运用灵敏度高的FT-IR，进而在线收集IR数据。但是实际应用结果是灵敏度很低，仅相当于单个NMR。
四、结束语
显然，我们上述所描述的联用仪器已相当完善，但并没有穷尽所有的联用技术，其它光谱检测器与HPLC的联用也是可行的。总之，随着接口技术不断改进，质谱系统不断推陈出新，更加高级的联用仪会相继出现，我们所做的是付出更大的努力，探索更新的分析方法，分析更为复杂的未知物。
参考文献：
[1]W.M.A.Niessen,J.Chromatogr. 1999,856:179~197.
[2]余天;郭寅龙等.有机化学.2000,20(5):629~633.
[3]魏先文,锁志勇,徐正.化学通报,1998(8):5~11.
[4]徐文宣,彭师奇.药学学报,1997,32(10):795~799.
[5]M.Scalf,MS Westphall,Jkrause,SL Kaufman ,L M Smith. Science,1999,283,194.
[6]R Gueveremont,K W M Siu,J Y Wang,L Y Ding .Anal Chem,1997,69(19),3959.
[7]潘元海,金军等. 分析化学.2000,28(6):666~671.
[8]Lacorte S, Barclo D. Anal Chem. 1996,68;2464.
[9]J.Chromatogr. A. 892(2000)329~346.
[10]Quattro UltimaTMthe new bench mark in LC-MS-MS for bioanalysis Micromass 公司,http://WWW.Pesciex.com.
[11]李悦,王慧敏.中国医药工业杂志.1998,29(11):524~525.
[12]K. Tanaka,et al.Rapid Common. Mass Spectrom. 2 , 151(1988).
[13]Y.Li,et al, Anal. Chem. 68,941(1996).
[14]B.lebrilla,et al,Anal Chem,68,2331(1996).
[15]J.Chromatogr. A. 892(2000)315~327.
[16]M.Ludlow,D.Louden,A Handley, S,Taylor, B.Wright, J.Chromatogr. A.857(1999)89.
[17]Ian D.Wilson, 中国实验室，2002，1，6-12.
目前，LC-MS在技术和应用方面取得了惊人的进展，各种分析模式联用使分析化学家威力大增。几种光谱仪与液相色谱仪的联用，构成一个集成系统，在单次分离过程中就能提供一套综合光谱信息。由这种多维技术创造了“多重联用”（“hyphenation”）这个术语。
一、LC-API-MS
LC-MS联用存在着色谱仪和质谱仪间的压力匹配、流量匹配、气化等问题，为了解决这些难题，实现液相色谱仪和质谱仪的联机，接口技术是关键所在，它决定着LC-MS能否在实际的分析中得以应用。API技术是LC-MS联用接口的一大进步。有关API接口技术Nilsson[1]和余天等[2]的综述作了详细的阐述。API包括电喷雾（Electro spray, ESI）,离子喷雾（Ion spray，ISI）和大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）三种方式。ESI电离是一种“软”电离技术，起源与1917年，但目前ESI电离机理尚无定论[3]，现有两种离子化的机理模型：带电残余物模型（charged-residue model）和离子蒸发模型(ion-evaporation model)，前者认为，随着溶剂蒸发，荷电液滴上的电荷最后残留在溶质分子上而形成离子，并进入气相，后者认为荷电液滴由于库仑排斥作用不断分裂成更小的液滴，在电场的作用下，溶剂化离子从小液滴表面逸出进入气相，这一过程称为场助离子蒸发（field-assisted ion evaporation）,离子携带电荷的数目与离子母体的分子结构和载体溶剂有关。
ESI技术80年代用于质谱，1984年美国耶鲁大学化学工程系John Fenn 教授为首的研究组首次报道了ESI-MS的研究成果，并于四年后率先运用ESI-MS成功地进行蛋白质的分析，从此揭开了ESI-MS用于生物大分子及生命科学研究的序幕。ESI技术易产生多电荷离子，可以扩展质谱的可测质量限度，有利于测定生物大分子的分子量，但多电荷离子不利于离子的结构鉴定。若调控样品溶液的PH值或加入有机酸、有机碱抑制多电荷离子的形成，发展用混合溶剂，如咪唑、六氢吡啶和乙酸溶于乙腈-水（80：20）中作为样品溶剂，既可抑制钾钠加合离子的形成，又可减少多电荷的程度。同时，可通过α粒子碰撞气体分子产生正负电荷的离子，中和多电荷离子电荷，得以控制离子的电荷数，从而简化图谱，提高分析的灵敏度[5]。还有在MS之前设置一漂移管，使质核比相同但带不同数量电荷的离子因在漂移管的漂移时间不等而得以分离，同样达到简化图谱的目的[6]。ESI常常用于肽和蛋白质表征的各个阶段：分子质量的测定；氨基酸的测序；蛋白质的化学和翻译后修饰位置和性能的测定；蛋白质三级和四级结构的研究和共价键和结合的研究[1]。
与ESI不同，CI源是通过反应离子与被测组分分子反应而使组分分子电离的一种电离方法。一般与反应气体碰撞后形成的是单电荷准分子离子，分子质量数可直接观察到。结合源内（in source）CID谱，灵活改变锥体电压（cone voltage）,就能得到具有一定特征的碎片离子。文献[7]采用HPLC/APCI/MS技术实验了六种有机磷农药的分离和定量。结合固相萃取技术，国外已实现了ng/l有机磷农药的鉴定分析[8]总之LC/API/MS进行环境、生物应用的前景非常广阔，可以进行生物分子的分离和鉴定，生物现象的研究，并结合组合化学广泛应用在新药研究，反应过程控制，产量控制以及药物动力学研究等各项工作。
二、LC-MALDI-MS
MALDI是80年代末才出现的新型电离技术，这种技术主要是通过将分析的物质分子从一个适当的固体基质（小分子有机物）分离的方法，释放出完整的大分子量的气体分子离子。MALDI是由激光解吸（LD）质谱发展起来的。激光通过单一或多个光学系统聚焦并通过一窗口进入质谱仪，激光苏般大小在10~300μm,激光束与样品表面角度可调节，一般为30~75o,样品需加入基质，激光打在样品上产生离子，Hilleakamp把离子产生过程归结为四种作用类型[11]：（1）离子直接从固体蒸发；（2）中性分子直接从固体热蒸发并随后在气相状态中电离；（3）激光解吸过程，即有机分子进行共振吸收时分子生色团在固体样品中共振吸收能量，并把绝大部分能量传递到有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时扰动而解吸离子或中性分子；（4）激光形成等离子过程中生成离子[12]。
MALDI的特点：
MALDI谱中单电荷分子离子和双电荷分子离子峰都很强。随着分析量增加，双电荷离子相对丰度增加，并出现多电荷离子，基质信号出现低在质量范围（500-1000Da）。他们有准分子离子和一些特别碎片峰，还有光化学反应产生的家河离子，不同基质在低质量区出现分子离子信号的强度不同，如比样品低，条件好时，甚至不出现基质峰，但MALDI谱图中单电荷分子离子峰站主要地位，且碎片离子少，成为混合物分析的理想手段。
MALDI与其它质谱电离源相比，对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其它非挥发性成分，必须仔细准备样品，这是MALDI 的显著优点。但有两种杂质严重影响分析结果，离子去垢剂（如十二烷基硫酸钠）和低挥发溶剂（如甘油和二甲亚砜），后者有害作用很易解释，故破坏样品的结晶过程，或在样品基质表面形成液膜，妨碍蛋白质离子化过程。
分辨率和灵敏度高是MALDI的又一大特点。早期的 MALDI-TOF分辨率很低（低于1000），质量检测精度只有0.1%，随着仪器的改进和新基质的加入，有很大改善，测定3000蛋白质的精度达0.01%[13]。
与API相比，实现LC-MALDI-MS的在线偶合很困难，因为它需要高真空的条件，但是MALDI比API有进样速度快的优势。MALDI已广泛用于 蛋白质、多肽、DNA、核酸和糖类的测定等方面。例如，为了得到序列离子和更好的解释肽质谱中离子的结构，常采用MALDI与串联质谱（Tandem Mass Spectrometry,MS/MS）结合的方法。在串联质谱中，MS-Ⅰ产生碎片离子，碎片离子经MS-Ⅱ分离后，检测碰撞活化裂解（Collisional activation dissociation）质谱图，简称CAD谱，可推导待测离子的结构。可以用MALDI-TOF-四极杆或MALDI-FTMS，后者有超分辨率的特点，并可以进行n次串联(MS/MS)n。MALDI-FTMS/MS是测寡糖结构最有效的方法[14]。
三、HPLC-NMR-MS
结构测定经常要用到核磁共振（NMR）谱。虽然LC-NMR装置不象LC-MS那样容易得到，那样普遍，但是它在解决实际问题中已经得到广泛应用。HPLC-NMR和HPLC-MS联用仪的问世，使得色谱柱流出物的鉴定手段发生了革命性的变化。近来，HPLC与NMR和MS的联用提供了一种更加有利的手段- HPLC-NMR-MS[15]。该系统是基于传统的HPLC泵系统、柱系统和紫外检测器。紫外检测器提供的紫外光谱数据弥补了NMR和MS数据的不足，使光谱学家更好地确定分析物的保留时间及达到光谱仪的时间。图中NMR和MS平行放置，这样由于NMR和MS灵敏度的不同，可以让两种仪器通过的样品量不同（如NMR：MS=95：5，也可以是其它比例）。另外，还可以控制峰的保留时间及未知物被NMR和MS检测的时间，以致在MS中出现特殊峰时，避免了继续向NMR通入样品的操作。NMR和MS平行放置的缺点是使NMR的效率降低，并且NMR的高磁场也影响MS仪的操作。
HPLC-NMR-MS无论从仪器的商品化生产，还是从复杂程度上，都不愧是一门成熟的技术，已经广泛应用于制药业、药物代谢物的研究、天然产品等方面。HPLC-NMR-MS的联用通过在线接口LC变压器（LC-transform）成功以后，进一步开发了三级联用仪HPLC-NMR-IR-MS[16]。与前者不同的是使用了一个特殊的接口，将通过NMR的样品流以1：1劈开，分别进入NMR中，并且也使用了LC变压器。柱流出物的在线收集可以运用灵敏度高的FT-IR，进而在线收集IR数据。但是实际应用结果是灵敏度很低，仅相当于单个NMR。
四、结束语
显然，我们上述所描述的联用仪器已相当完善，但并没有穷尽所有的联用技术，其它光谱检测器与HPLC的联用也是可行的。总之，随着接口技术不断改进，质谱系统不断推陈出新，更加高级的联用仪会相继出现，我们所做的是付出更大的努力，探索更新的分析方法，分析更为复杂的未知物。
参考文献：
[1]W.M.A.Niessen,J.Chromatogr. 1999,856:179~197.
[2]余天;郭寅龙等.有机化学.2000,20(5):629~633.
[3]魏先文,锁志勇,徐正.化学通报,1998(8):5~11.
[4]徐文宣,彭师奇.药学学报,1997,32(10):795~799.
[5]M.Scalf,MS Westphall,Jkrause,SL Kaufman ,L M Smith. Science,1999,283,194.
[6]R Gueveremont,K W M Siu,J Y Wang,L Y Ding .Anal Chem,1997,69(19),3959.
[7]潘元海,金军等. 分析化学.2000,28(6):666~671.
[8]Lacorte S, Barclo D. Anal Chem. 1996,68;2464.
[9]J.Chromatogr. A. 892(2000)329~346.
[10]Quattro UltimaTMthe new bench mark in LC-MS-MS for bioanalysis Micromass 公司,http://WWW.Pesciex.com.
[11]李悦,王慧敏.中国医药工业杂志.1998,29(11):524~525.
[12]K. Tanaka,et al.Rapid Common. Mass Spectrom. 2 , 151(1988).
[13]Y.Li,et al, Anal. Chem. 68,941(1996).
[14]B.lebrilla,et al,Anal Chem,68,2331(1996).
[15]J.Chromatogr. A. 892(2000)315~327.
[16]M.Ludlow,D.Louden,A Handley, S,Taylor, B.Wright, J.Chromatogr. A.857(1999)89.
[17]Ian D.Wilson, 中国实验室，2002，1，6-12.