【摘 要】
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目的构建人/鼠干扰素(IFN-γ)的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs),为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-v
【机 构】
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四川大学华西医院血液科; 四川省医学科学院·四川省人民医院血液科;
【基金项目】
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863计划项目(No.2002AA205061)资助
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目的构建人/鼠干扰素(IFN-γ)的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs),为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中的作用提供实验依据。方法采用PCR法从含有人/鼠IFN-γ基因的质粒中扩增出目的基因片段IFN-γ,然后定向克隆到穿梭质粒载体pDC316中,构建pDC316-IFN-γ,经酶切、PCR及测序鉴定后,再将IFN-γ定向克隆至腺病毒骨架载体,从而构建携带IFN-γ的重组腺病毒载体,并转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒(Ad-IFN-γ)的包装、生产和纯化;用半数组织培养感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)法检测重组腺病毒滴度。将Ad-IFN-γ及空病毒(Ad-null,作为载体阴性对照)分别转染HUMSCs,在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用Western blot与ELISA法鉴定IFN-γ蛋白的表达。结果成功构建了携带IFN-γ的重组腺病毒,鼠IFN-γ(Ad-mIFN-γ)的滴度为1.0×1010 IU/mL,人IFN-γ(Ad-hIFN-γ)的滴度为1.6×1010 IU/mL,Ad-GFP的滴度为1.0×109 IU/mL。Ad-IFN-γ转染HUMSCs后24h开始观察到绿色荧光,72h时该荧光表达更强;Western blot和ELISA法均证实HUMSCs表达IFN-γ蛋白。结论成功构建了携带人/鼠IFN-γ基因的重组腺病毒载体,并证实其可有效转染HUMSCs。
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