【摘 要】
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目的 构建高尔基体膜蛋白73(Golgi membrane protein 73, GP73)小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,筛选出稳定干扰GP73的细胞株.方法 根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合
【机 构】
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安徽大学生命科学学院,合肥,230039;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100850;安徽大学生命科学学院和军事医学科学院生物工程研究所
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目的 构建高尔基体膜蛋白73(Golgi membrane protein 73, GP73)小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,筛选出稳定干扰GP73的细胞株.方法 根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对GP73的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后,质粒命名为psiGP73.用脂质体转染质粒到肝癌细胞系HepG2中,经G418加压筛选稳定表达GP73 siRNA的细胞株,用免疫印迹检测质粒对内源GP73的干扰效果,将干扰效果好的细胞株命名为HepG2/siGP73.用MTT法检测GP73被干扰下调后对细胞增殖的影响.再通过贴壁非依赖性生长试验检测GP73被干扰下调后对细胞贴壁非依赖性生长的影响.结果 免疫印迹结果 证实构建的psiGP73质粒能够有效干扰细胞内源GP73的表达.GP73被干扰下调后,HepG2细胞的增殖速度降低,在软琼脂中克隆形成减慢.结论 成功构建了表达GP73 siRNA的质粒psiGP73,筛选出稳定干扰GP73表达的细胞株HepG2/siGP73,为深入研究GP73在肝癌发生中的作用提供了平台.
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