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摘 要 以甜叶菊茎段为外植体，采用不同低浓度秋水仙素在甜叶菊试管苗茎段再生苗初期进行长时间持续处理，以探讨低浓度秋水仙素诱导甜叶菊多倍体的优势及适合长时间诱导甜叶菊的秋水仙素浓度，简化甜叶菊离体诱导多倍体技术环节。结果表明：0.025%的秋水仙素浓度适合于甜叶菊多倍体离体诱导的持续诱变，直至试管苗再生而无需清洗外植体和更换培养基，简化了诱导技术环节，提高了甜叶菊多倍体离体诱导效率；多倍体植株田间农艺性状表现为叶片大而厚实、开花延迟、花蕾较大等特征。旨在建立低浓度秋水仙素离体诱导甜叶菊多倍体技术体系。
关键词 甜叶菊；低浓度秋水仙素；多倍体
中图分类号 Q949.783.5 文献标识码 A
Establishment of the Technique System of Polyploidy
Induction for Stevia rebaudiana Bertoni by Low
Concentration of Colchicines in vitro
PENG Cheng， ZHANG Lulu*， YE Chao， SHE Qingmei， YANG Chenglin，
ZHOU Mingliang， MA Xiangxiang， ZHAO Yang， CUI Guangrong**
Plant Science School/Anhui Science and Technology University， Fengyang， Anhui 233100， China
Abstract The stem sections of S. rebaudiana Bertoni were used as explants for polyploidy induction in vitro by low concentrations of colchicines for long time treatments during shoot formation. The aims were to study the superiority of polyploidy induction by lower concentrations of colchicines for long time in S. rebaudiana Bertoni and simplify the technique protocols for polyploidy induction in vitro in S. rebaudiana Bertoni. The results showed that the concentration of 0.025% colchicines was suitable to induct polyploidy in vitro for long time treatment and need not rinse explants， change medium until the shoots formation. Agricultural traits of the polyploidy displayed bigger and thicker leaves， bigger flower bud and florescence being postponed. The technique system of polyploidy induction for S. rebaudiana Bertoni was established by low concentration of colchicines in vitro.
Key words Stevia rebaudiana Bertoni；Low concentration of colchicines；Polyploidy
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.011
甜叶菊（Stevia rebaudiana bertoni）是菊科多年生草本植物，原产于南美巴拉圭，现世界各地引种栽培均获得成功。甜叶菊是一种新型糖源植物，它所含有的甜菊糖甙的甜度是蔗糖的250～300倍，但所含热量只是蔗糖的1/300[1-4]。利用秋水仙素开展多倍体诱导是植物倍性育种的常用技术之一，将植物组织培养技术与化学诱变技术结合起来是开展诱变育种的一个重要发展方向，现已有相关成功的报道[5-8]和较多的优点。国内有关甜叶菊多倍体离体诱导报道仅见王波等[5]、李红杨等[6]2例报道，并且已取得了十分相似的、较好的试验结果，这表明在离体条件下利用秋水仙素诱导甜叶菊多倍体具有较好的稳定性。但上述试验中也存在一些不足，即在化学药剂处理后需要清洗外植体、更换培养基等试验环节，既浪费人力物力，又容易造成材料污染，而且诱变效率低等[5-6]。在相关研究的基础上[5]，本试验拟采用低剂量秋水仙素处理，以探讨离体条件下持续诱导甜叶菊多倍体技术，省去清洗外植体、更换培养基等技术环节，简化了诱导程序，提高了诱变效率，旨在建立一种简单、方便的甜叶菊多倍体诱导技术体系，为甜叶菊多倍体育种奠定基础，同时为其他植物的倍性育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
在超净工作台上取出试管苗除去叶片，剪成约1 cm长含侧芽茎段，水平放置于再生培养基表面上，轻按固定，每瓶接种5个茎段，每个处理接种10瓶，最后置于培养室中进行培养，其培养方法参照王波等[5]的方法。培养2 d后取出，在超净工作台上分别滴加0.10%、0.05%、0.025%、0.012 5%、0.006 25%秋水仙素（过滤灭菌），确保秋水仙素浸润每个茎段，并以滴加无菌水的设为空白对照。秋水仙素处理完毕放回培养室，继续培养芽苗长至2.0 cm高时（约30 d），在超净工作台上将芽苗剪下接种于生根培养基中培养20 d。观察茎段侧芽的生长变化、试管苗生根等情况，统计诱变苗再生率（再生率=再生苗茎段数/接种茎段总数×100%，污染瓶苗不计）。 多倍体试管苗的鉴定参照王波等[5]的方法（诱变率=多倍体苗数/再生苗总数×100%，污染瓶苗不计）。将诱变苗移栽至大田中观察农艺性状，并与对应的二倍体进行比较。试验于2011年12月至2012年10月在安徽科技学院遗传育种实验室进行。离体诱变试验设3次重复，试验数据分析采用邓肯氏新复极差法进行方差分析比较，显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 不同浓度秋水仙素处理对不同品系甜叶菊茎段侧芽再生苗的影响
由表1可知，不同浓度秋水仙素处理严重抑制了茎段侧芽的萌发，浓度越大，抑制效应越强烈，各品系表现基本一致；并且对后期再生芽苗的生长产生较强的伤害作用，试管苗表现出初期生长缓慢，部分芽苗呈现出一定的畸形状（图1），这些伤害作用在较高浓度（0.10%处理）下尤为明显。从芽苗再生率情况看，同品系、不同浓度处理间差异显著，不同品系间也存在着一定的差异，其中+3品系在各种浓度处理下苗再生率均低于其他品系，而ST品系的苗再生率则均高于其他品系，反映出甜叶菊不同品系对秋水仙素的敏感性不尽相同。
2.2 不同浓度秋水仙素处理对不同品系甜叶菊再生苗诱变率的影响
由表2可知，不同浓度的秋水仙素处理，再生苗多倍体的比例差异较大，其总体趋势是随着秋水仙素浓度不断减小，多倍体的诱导率不断下降，各品系表现基本一致，呈现出秋水仙素诱导多倍体时的共性特征。但在本试验中，秋水仙素浓度在0.10%～0.025%的范围内，多倍体诱导率变化不大，几乎无差异；当秋水仙素浓度降至0.012 5%以下时，多倍体诱导率急剧下降，呈现出倍性减少的趋势，多倍体诱导效应迅速减弱，各品系均呈现出类似的效应。此外，不同品系甜叶菊在相同的诱导条件下，多倍体诱变率也表现出一定的差异，体现出多倍体诱导中基因型间的差异（表2）。
结合2.1与2.2的结果不难看出，在秋水仙素浓度为0.025%时，不仅维持了甜叶菊芽苗较高的再生频率，而且保证了多倍体较高的诱变频率；秋水仙素浓度高于0.025%时，虽然能够获得更高的诱变率，但获得的再生苗数少，获得多倍体苗数相应较少；而秋水仙素浓度低于0.025%时，虽能获得较多的再生苗数，但多倍体比例较低。综合二者因素，在甜叶菊试管苗茎段侧芽再生苗过程中，采用较低剂量的0.025%秋水仙素持续处理，能够获取较多数量的多倍体试管苗，从而有效提高了诱变效率。
2.3 不同品系甜叶菊多倍体试管苗生根、移栽及农艺性状差异
试验结果显示，多倍体与二倍体试管苗在后期生根成苗后，外部形态上并无明显的区别，但在生根率及生根数量上则存在一定的差异。由表3可知，多倍体苗生根率普遍较二倍体苗低，且生根数量较少，一般二倍体生根数量为6～8根，而多倍体的生根数量一般为3～5根，进而影响其移栽成活率。
与试管苗表现不同，多倍体植株田间的农艺性状表现与二倍体间差异极为明显。对各品系多倍体植株进行初步的田间农艺性状考察，结果显示，多倍体植株生长较为缓慢，株高矮10 cm左右，花期普遍晚10～15 d，叶片大而厚实，叶色较浅（图2），花蕾较大（图3）。除株高与一般植物多倍体特性存在偏差外，其他特征均表现出一般多倍体的共同特征，其原因有待于进一步研究。
3 讨论与结论
在植物多倍体离体诱导中，通常采用特定浓度的秋水仙素结合特定的时间进行处理，从而确定效率较高的处理剂量，较高的浓度和较长的处理时间均会对材料产生较大的损伤[5-8]，因而影响诱变工作效率。在此过程中需要清洗处理材料、更换培养基等环节，既浪费人力物力又易造成培养材料的污染，诱变效率较低[5-6]。与前人相关研究进行比较，本试验采用的低浓度秋水仙素、长时间持续诱变处理，去除了试验过程中对材料清洗、更换培养基等环节，极大地提高了诱变效率，也为其他植物的离体化学诱变提供了有益的参考。
多倍体植株一般表现为形态上的巨大性、细胞内次生代谢物含量高等特点，甜菜等植物多倍体品种在生产上已经获得了广泛应用。本研究结果显示，甜叶菊多倍体在一定程度上表现了器官的巨大性，如叶片、花蕾等，但植株整体并未能表现出巨大性，尤其是生物学产量偏低，其原因尚待继续研究。甜叶菊是以叶片为主要收获产品，其叶片的巨大性已经显示了倍性育种的潜力，但要形成生产上能够广泛应用的多倍体品种尚有较多的问题需解决。
参考文献
[1] 赵秀玲. 我国甜味剂甜菊糖苷发展状况[J]. 中国调味品， 2009， 5（1）： 110-113.
[2] 倪军明， 李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景[J]. 广州食品工业科技， 2004， 3（1）： 156-158.
[3] 卢清会. 明光市甜叶菊的生产状况、存在问题及发展对策[J]. 农业科技通讯， 2009， 9（1）： 15-17.
[4] Yukiyoshi T， Shigeharu N， Hiroshi F， et al. Clonal propagation of Stevia rebaudiana Bertoni by stem-tip culture[J]. Plant Cell Reports， 1984， 3（1）： 183-185.
[5] 王 波， 崔广荣， 何克勤，等. 甜叶菊多倍体离体诱导技术体系的建立[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 711-1 714.
[6] 李红杨， 杨 岚，向增旭. 甜叶菊同源四倍体诱导及鉴定[J]. 西北植物学报， 2012， 32（8）： 1 692-1 697.
[7] 崔广荣， 张子学， 张从宇， 等. 文心兰多倍体诱导及其鉴定[J]. 草业学报， 2012， 19（1）： 184-190.
[8] 崔广荣， 张子学， 张从宇，等. 秋水仙素对蝴蝶兰试管苗叶切片胚状体试管苗叶切片胚状体发生期的化学诱变[J]. 中国农业科学， 2009， 42（9）： 3 368-3 373.
关键词 甜叶菊；低浓度秋水仙素；多倍体
中图分类号 Q949.783.5 文献标识码 A
Establishment of the Technique System of Polyploidy
Induction for Stevia rebaudiana Bertoni by Low
Concentration of Colchicines in vitro
PENG Cheng， ZHANG Lulu*， YE Chao， SHE Qingmei， YANG Chenglin，
ZHOU Mingliang， MA Xiangxiang， ZHAO Yang， CUI Guangrong**
Plant Science School/Anhui Science and Technology University， Fengyang， Anhui 233100， China
Abstract The stem sections of S. rebaudiana Bertoni were used as explants for polyploidy induction in vitro by low concentrations of colchicines for long time treatments during shoot formation. The aims were to study the superiority of polyploidy induction by lower concentrations of colchicines for long time in S. rebaudiana Bertoni and simplify the technique protocols for polyploidy induction in vitro in S. rebaudiana Bertoni. The results showed that the concentration of 0.025% colchicines was suitable to induct polyploidy in vitro for long time treatment and need not rinse explants， change medium until the shoots formation. Agricultural traits of the polyploidy displayed bigger and thicker leaves， bigger flower bud and florescence being postponed. The technique system of polyploidy induction for S. rebaudiana Bertoni was established by low concentration of colchicines in vitro.
Key words Stevia rebaudiana Bertoni；Low concentration of colchicines；Polyploidy
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.011
甜叶菊（Stevia rebaudiana bertoni）是菊科多年生草本植物，原产于南美巴拉圭，现世界各地引种栽培均获得成功。甜叶菊是一种新型糖源植物，它所含有的甜菊糖甙的甜度是蔗糖的250～300倍，但所含热量只是蔗糖的1/300[1-4]。利用秋水仙素开展多倍体诱导是植物倍性育种的常用技术之一，将植物组织培养技术与化学诱变技术结合起来是开展诱变育种的一个重要发展方向，现已有相关成功的报道[5-8]和较多的优点。国内有关甜叶菊多倍体离体诱导报道仅见王波等[5]、李红杨等[6]2例报道，并且已取得了十分相似的、较好的试验结果，这表明在离体条件下利用秋水仙素诱导甜叶菊多倍体具有较好的稳定性。但上述试验中也存在一些不足，即在化学药剂处理后需要清洗外植体、更换培养基等试验环节，既浪费人力物力，又容易造成材料污染，而且诱变效率低等[5-6]。在相关研究的基础上[5]，本试验拟采用低剂量秋水仙素处理，以探讨离体条件下持续诱导甜叶菊多倍体技术，省去清洗外植体、更换培养基等技术环节，简化了诱导程序，提高了诱变效率，旨在建立一种简单、方便的甜叶菊多倍体诱导技术体系，为甜叶菊多倍体育种奠定基础，同时为其他植物的倍性育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
在超净工作台上取出试管苗除去叶片，剪成约1 cm长含侧芽茎段，水平放置于再生培养基表面上，轻按固定，每瓶接种5个茎段，每个处理接种10瓶，最后置于培养室中进行培养，其培养方法参照王波等[5]的方法。培养2 d后取出，在超净工作台上分别滴加0.10%、0.05%、0.025%、0.012 5%、0.006 25%秋水仙素（过滤灭菌），确保秋水仙素浸润每个茎段，并以滴加无菌水的设为空白对照。秋水仙素处理完毕放回培养室，继续培养芽苗长至2.0 cm高时（约30 d），在超净工作台上将芽苗剪下接种于生根培养基中培养20 d。观察茎段侧芽的生长变化、试管苗生根等情况，统计诱变苗再生率（再生率=再生苗茎段数/接种茎段总数×100%，污染瓶苗不计）。 多倍体试管苗的鉴定参照王波等[5]的方法（诱变率=多倍体苗数/再生苗总数×100%，污染瓶苗不计）。将诱变苗移栽至大田中观察农艺性状，并与对应的二倍体进行比较。试验于2011年12月至2012年10月在安徽科技学院遗传育种实验室进行。离体诱变试验设3次重复，试验数据分析采用邓肯氏新复极差法进行方差分析比较，显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 不同浓度秋水仙素处理对不同品系甜叶菊茎段侧芽再生苗的影响
由表1可知，不同浓度秋水仙素处理严重抑制了茎段侧芽的萌发，浓度越大，抑制效应越强烈，各品系表现基本一致；并且对后期再生芽苗的生长产生较强的伤害作用，试管苗表现出初期生长缓慢，部分芽苗呈现出一定的畸形状（图1），这些伤害作用在较高浓度（0.10%处理）下尤为明显。从芽苗再生率情况看，同品系、不同浓度处理间差异显著，不同品系间也存在着一定的差异，其中+3品系在各种浓度处理下苗再生率均低于其他品系，而ST品系的苗再生率则均高于其他品系，反映出甜叶菊不同品系对秋水仙素的敏感性不尽相同。
2.2 不同浓度秋水仙素处理对不同品系甜叶菊再生苗诱变率的影响
由表2可知，不同浓度的秋水仙素处理，再生苗多倍体的比例差异较大，其总体趋势是随着秋水仙素浓度不断减小，多倍体的诱导率不断下降，各品系表现基本一致，呈现出秋水仙素诱导多倍体时的共性特征。但在本试验中，秋水仙素浓度在0.10%～0.025%的范围内，多倍体诱导率变化不大，几乎无差异；当秋水仙素浓度降至0.012 5%以下时，多倍体诱导率急剧下降，呈现出倍性减少的趋势，多倍体诱导效应迅速减弱，各品系均呈现出类似的效应。此外，不同品系甜叶菊在相同的诱导条件下，多倍体诱变率也表现出一定的差异，体现出多倍体诱导中基因型间的差异（表2）。
结合2.1与2.2的结果不难看出，在秋水仙素浓度为0.025%时，不仅维持了甜叶菊芽苗较高的再生频率，而且保证了多倍体较高的诱变频率；秋水仙素浓度高于0.025%时，虽然能够获得更高的诱变率，但获得的再生苗数少，获得多倍体苗数相应较少；而秋水仙素浓度低于0.025%时，虽能获得较多的再生苗数，但多倍体比例较低。综合二者因素，在甜叶菊试管苗茎段侧芽再生苗过程中，采用较低剂量的0.025%秋水仙素持续处理，能够获取较多数量的多倍体试管苗，从而有效提高了诱变效率。
2.3 不同品系甜叶菊多倍体试管苗生根、移栽及农艺性状差异
试验结果显示，多倍体与二倍体试管苗在后期生根成苗后，外部形态上并无明显的区别，但在生根率及生根数量上则存在一定的差异。由表3可知，多倍体苗生根率普遍较二倍体苗低，且生根数量较少，一般二倍体生根数量为6～8根，而多倍体的生根数量一般为3～5根，进而影响其移栽成活率。
与试管苗表现不同，多倍体植株田间的农艺性状表现与二倍体间差异极为明显。对各品系多倍体植株进行初步的田间农艺性状考察，结果显示，多倍体植株生长较为缓慢，株高矮10 cm左右，花期普遍晚10～15 d，叶片大而厚实，叶色较浅（图2），花蕾较大（图3）。除株高与一般植物多倍体特性存在偏差外，其他特征均表现出一般多倍体的共同特征，其原因有待于进一步研究。
3 讨论与结论
在植物多倍体离体诱导中，通常采用特定浓度的秋水仙素结合特定的时间进行处理，从而确定效率较高的处理剂量，较高的浓度和较长的处理时间均会对材料产生较大的损伤[5-8]，因而影响诱变工作效率。在此过程中需要清洗处理材料、更换培养基等环节，既浪费人力物力又易造成培养材料的污染，诱变效率较低[5-6]。与前人相关研究进行比较，本试验采用的低浓度秋水仙素、长时间持续诱变处理，去除了试验过程中对材料清洗、更换培养基等环节，极大地提高了诱变效率，也为其他植物的离体化学诱变提供了有益的参考。
多倍体植株一般表现为形态上的巨大性、细胞内次生代谢物含量高等特点，甜菜等植物多倍体品种在生产上已经获得了广泛应用。本研究结果显示，甜叶菊多倍体在一定程度上表现了器官的巨大性，如叶片、花蕾等，但植株整体并未能表现出巨大性，尤其是生物学产量偏低，其原因尚待继续研究。甜叶菊是以叶片为主要收获产品，其叶片的巨大性已经显示了倍性育种的潜力，但要形成生产上能够广泛应用的多倍体品种尚有较多的问题需解决。
参考文献
[1] 赵秀玲. 我国甜味剂甜菊糖苷发展状况[J]. 中国调味品， 2009， 5（1）： 110-113.
[2] 倪军明， 李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景[J]. 广州食品工业科技， 2004， 3（1）： 156-158.
[3] 卢清会. 明光市甜叶菊的生产状况、存在问题及发展对策[J]. 农业科技通讯， 2009， 9（1）： 15-17.
[4] Yukiyoshi T， Shigeharu N， Hiroshi F， et al. Clonal propagation of Stevia rebaudiana Bertoni by stem-tip culture[J]. Plant Cell Reports， 1984， 3（1）： 183-185.
[5] 王 波， 崔广荣， 何克勤，等. 甜叶菊多倍体离体诱导技术体系的建立[J]. 热带作物学报， 2011， 32（9）： 1 711-1 714.
[6] 李红杨， 杨 岚，向增旭. 甜叶菊同源四倍体诱导及鉴定[J]. 西北植物学报， 2012， 32（8）： 1 692-1 697.
[7] 崔广荣， 张子学， 张从宇， 等. 文心兰多倍体诱导及其鉴定[J]. 草业学报， 2012， 19（1）： 184-190.
[8] 崔广荣， 张子学， 张从宇，等. 秋水仙素对蝴蝶兰试管苗叶切片胚状体试管苗叶切片胚状体发生期的化学诱变[J]. 中国农业科学， 2009， 42（9）： 3 368-3 373.