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【摘 要】目的：探讨葛根芩连汤治疗炎症性肠病（IBD）的分子机制。方法：Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、模型+阳性药物对照组（美沙拉嗪）、模型+葛根芩连汤治疗组，葛根芩连汤治疗组又分为中、高剂量组。阳性对照组、中药治疗组分别灌胃给药。疗程结束后取大鼠结肠组织提取RNA，利用real time PCR的方法检测白介素-1β（IL-1β）及白介素-6（IL-6）在各组中的表达变化。结果：相对于模型组，阳性药物及葛根芩连汤治疗组尤其是高剂量组可有效抑制IL-1β及IL-6的表达。结论：葛根芩连汤可通过抑制促炎因子的表达从而发挥了对炎症性肠病中的治疗作用。
【关键词】葛根芩连汤；炎症性肠病；促炎细胞因子
【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0711-01
炎症性肠病是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，通常反复发作，迁延不愈，可有腹痛、腹泻、体重减轻、粘液血便等表现。现普遍认为，IBD是由遗传、环境、感染及免疫四大因素相互作用的结果。中医用葛根芩连汤对治疗该病具有临床疗效好、复发率低、不良反应小的优点。本研究旨在探讨葛根芩连汤在治疗炎症性肠病过程中，对炎症性肠病中促炎因子表达的影响，以探讨葛根芩连汤治疗炎症性肠病的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar 雄性大鼠40只，普通级，体重140±10 g，由泸州医学院实验动物中心提供；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）；.Trizol；sybr green；核糖核酸酶抑制剂；反转录酶；三磷酸脱氧核糖核苷，Sigma公司生产。葛根芩连汤由葛根24g，黄芩9g，黄连9g，炙甘草6g 组成，泸州医学院附属中医院门诊。阳性对照药美沙拉嗪肠溶片（安徽东盛制药有限公司），美沙拉嗪肠溶片碾磨成粉，配成浓度为30g/L的混悬液[1]。
1.2 方法
1.2.1造模 制备大鼠炎症性肠病模型：禁食不禁水24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，将直径2mm的乳胶管经肛门轻轻插入大鼠体内大约8cm处的肠腔内，给予2.5%的TNBS-乙醇溶液按75mg/kg灌肠，然后注入约0.3ml空气，以排空管中的药液，捏紧肛门，提起大鼠尾部，保持倒立30s，造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。正常对照组给予同体积的生理盐水灌肠，常规饲养。
1.2.2 分组与取材 40只大鼠随机分为A正常对照组、B模型组、C模型+阳性药物对照组、D模型+葛根芩连汤中剂量组、E模型+葛根芩连汤高剂量组，每组8只。造模成功3d后，葛根芩连汤治疗组中、高剂量组每日分别给予相应浓度的葛根芩连汤2ml灌胃治疗，阳性对照组每日分别给予美沙拉嗪肠溶片混悬液2ml灌胃治疗，每日1次，共14d。正常对照组和模型组给予同等体积生理盐水灌胃。第18d处死各组大鼠，剖腹，摘取肛门以上7cm～8cm结肠，沿肠系膜纵轴剪开，取病变最明显处液氮冻存，用于后续RNA提取，部分组织置于4%多聚甲醛固定、冰冻包埋、切片。
1.3 记录数据
1.3.1 RNA提取、检测及定量 取50-100mg组织加入到1ml Trizol中充分研磨匀浆，室温放置30min；离心后去上清，每管内加入200μl氯仿，剧烈混匀15s，室温放置2-3分钟后12000×g离心15min；吸取上清水相并置于另一新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，上下颠倒室温放置15min；4℃，12000×g离心10min，即得到RNA沉淀；弃去上清，向EP管中加1ml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀两次，7500×g离心沉淀5min，倒掉乙醇，室温空气中干燥RNA沉淀5-10min，加适量DEPC水以溶解RNA沉淀，55℃-60℃水溶5min。用紫外分光光度计测定浓度。
1.3.2 反转录制备cDNA 每组样本取2μgRNA，加入50pmol/μl引物1μl，另外加DEPC水至13.5μl，70℃加热10min，冰上放置5min后，依次加入RNA酶抑制剂0.5μl，M-MLV 1μl，5 х RT buffer 5μl，dNTP 5μl，42℃ 1h，95℃加热10min终止反应。
1.3.3 Real time PCR 以2μl提取的cDNA为模板，对IL-1β、IL-6及TNF-α等目的基因进行扩增，以GAPDH为内参，引物序列为：IL-1β F 5’-CAG GAT GAG GAC CCA AGC A-3’，R 5’-CAC AGA GGA CGG GCT CTT CT-3’；IL-6 F 5’- AAG TCG GAG GCT TAA TTA CAT ATG TTC -3’，R 5’- TGC CAT TGC ACA ACT CTT TTC T -3’；TNF-α F 5’- CAG CCG ATT TGC CAT TTC A -3’，R 5’- AGG GCT CTT GAT GGC AGA GA -3’；GAPDH F 5’- CCA TTC TTC CAC CTT TGA TGC T -3’ ，R 5’- TGT TGC TGT AGC CAT ATT CAT TGT -3’。 real time PCR反应体系为：cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，SYBR 12.5μl，水8.5μl，每个样本均做3个独立重复体系，反应体系为：94℃变性5min。94℃ 10s，62℃ 25s，72℃ 25s，40个循环。72℃延伸10min。
1.4 统计学分析 用SPSS 11.0进行数据处理，以均数±标准差（ ± s）表示，两组间行t检验。
2 结果
2.1葛根芩连汤对炎症性肠病中IL-1β mRNA表达的影响 同对照组相比，模型组IL-1β mRNA表达增加了1.8倍（##P<0.01）；应用阳性药物美沙拉嗪和葛根芩连汤治疗后，IL-1β mRNA表达虽然仍比对照组高，但相对于模型组，美沙拉嗪治疗后IL-1β mRNA表达下降了35%（**P <0.01），中剂量葛根芩连汤治疗后IL-1β mRNA表达下降了15%（*P <0.05），高剂量葛根芩连汤治疗后IL-1β mRNA表达下降了27%（*P <0.05），高剂量葛根芩连汤对IL-1β mRNA表达的抑制作用接近于美沙拉嗪。
2.2葛根芩连汤对炎症性肠病中IL-6 mRNA表达的影响 同对照组相比，模型组IL-6 mRNA表达增加了3.37倍（##P<0.01）；相对于模型组，应用美沙拉嗪治疗后IL-6 mRNA表达下降了60%（**P <0.01），中剂量葛根芩连汤治疗后IL-6 mRNA表达下降了34%（**P <0.01），高剂量葛根芩连汤治疗后IL-6 mRNA表达下降了41%（**P <0.01）。
3 讨论
炎症性肠病是由于各种微生物抗原的刺激，激活体内免疫系统，各种炎症细胞活化，释放多种炎性因子，导致促炎症细胞因子增多，抗炎细胞因子减少，从而引起的肠粘膜免疫反应异常和慢性炎症[2]。主要为IL- 1、IL- 6和TNF-α等。本研究得出，在大鼠IBD模型中，IL-1β 及IL-6 mRNA表达明显增加，同模型组相比，葛根芩连汤可显著抑制IL-1β 及IL-6mRNA在IBD大鼠模型中的表达，并呈现明显的剂效依赖性，高剂量葛根芩连汤对IL-1β 及IL-6mRNA的抑制程度接近阳性藥物美沙拉嗪，因此，葛根芩连汤对IBD疾病的治疗和缓解作用可能与其对IL- 1β及IL-6的抑制有关。我们认为，葛根芩连汤可通过抑制促炎细胞因子的表达对IBD急性期大鼠发挥显著的抗炎作用及修复炎症损伤的作用。
参考文献
[1] 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[J].北京：人民卫生出版社，2002.202～204.
[2] Tsianos EV，Katsanos K. Do we really understand what the immunological disturbances in inflammatory bowel disease mean[J].World J Gastroenterol. 2009，7；15（5）：521-5.
【关键词】葛根芩连汤；炎症性肠病；促炎细胞因子
【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0711-01
炎症性肠病是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，通常反复发作，迁延不愈，可有腹痛、腹泻、体重减轻、粘液血便等表现。现普遍认为，IBD是由遗传、环境、感染及免疫四大因素相互作用的结果。中医用葛根芩连汤对治疗该病具有临床疗效好、复发率低、不良反应小的优点。本研究旨在探讨葛根芩连汤在治疗炎症性肠病过程中，对炎症性肠病中促炎因子表达的影响，以探讨葛根芩连汤治疗炎症性肠病的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar 雄性大鼠40只，普通级，体重140±10 g，由泸州医学院实验动物中心提供；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）；.Trizol；sybr green；核糖核酸酶抑制剂；反转录酶；三磷酸脱氧核糖核苷，Sigma公司生产。葛根芩连汤由葛根24g，黄芩9g，黄连9g，炙甘草6g 组成，泸州医学院附属中医院门诊。阳性对照药美沙拉嗪肠溶片（安徽东盛制药有限公司），美沙拉嗪肠溶片碾磨成粉，配成浓度为30g/L的混悬液[1]。
1.2 方法
1.2.1造模 制备大鼠炎症性肠病模型：禁食不禁水24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，将直径2mm的乳胶管经肛门轻轻插入大鼠体内大约8cm处的肠腔内，给予2.5%的TNBS-乙醇溶液按75mg/kg灌肠，然后注入约0.3ml空气，以排空管中的药液，捏紧肛门，提起大鼠尾部，保持倒立30s，造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。正常对照组给予同体积的生理盐水灌肠，常规饲养。
1.2.2 分组与取材 40只大鼠随机分为A正常对照组、B模型组、C模型+阳性药物对照组、D模型+葛根芩连汤中剂量组、E模型+葛根芩连汤高剂量组，每组8只。造模成功3d后，葛根芩连汤治疗组中、高剂量组每日分别给予相应浓度的葛根芩连汤2ml灌胃治疗，阳性对照组每日分别给予美沙拉嗪肠溶片混悬液2ml灌胃治疗，每日1次，共14d。正常对照组和模型组给予同等体积生理盐水灌胃。第18d处死各组大鼠，剖腹，摘取肛门以上7cm～8cm结肠，沿肠系膜纵轴剪开，取病变最明显处液氮冻存，用于后续RNA提取，部分组织置于4%多聚甲醛固定、冰冻包埋、切片。
1.3 记录数据
1.3.1 RNA提取、检测及定量 取50-100mg组织加入到1ml Trizol中充分研磨匀浆，室温放置30min；离心后去上清，每管内加入200μl氯仿，剧烈混匀15s，室温放置2-3分钟后12000×g离心15min；吸取上清水相并置于另一新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，上下颠倒室温放置15min；4℃，12000×g离心10min，即得到RNA沉淀；弃去上清，向EP管中加1ml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀两次，7500×g离心沉淀5min，倒掉乙醇，室温空气中干燥RNA沉淀5-10min，加适量DEPC水以溶解RNA沉淀，55℃-60℃水溶5min。用紫外分光光度计测定浓度。
1.3.2 反转录制备cDNA 每组样本取2μgRNA，加入50pmol/μl引物1μl，另外加DEPC水至13.5μl，70℃加热10min，冰上放置5min后，依次加入RNA酶抑制剂0.5μl，M-MLV 1μl，5 х RT buffer 5μl，dNTP 5μl，42℃ 1h，95℃加热10min终止反应。
1.3.3 Real time PCR 以2μl提取的cDNA为模板，对IL-1β、IL-6及TNF-α等目的基因进行扩增，以GAPDH为内参，引物序列为：IL-1β F 5’-CAG GAT GAG GAC CCA AGC A-3’，R 5’-CAC AGA GGA CGG GCT CTT CT-3’；IL-6 F 5’- AAG TCG GAG GCT TAA TTA CAT ATG TTC -3’，R 5’- TGC CAT TGC ACA ACT CTT TTC T -3’；TNF-α F 5’- CAG CCG ATT TGC CAT TTC A -3’，R 5’- AGG GCT CTT GAT GGC AGA GA -3’；GAPDH F 5’- CCA TTC TTC CAC CTT TGA TGC T -3’ ，R 5’- TGT TGC TGT AGC CAT ATT CAT TGT -3’。 real time PCR反应体系为：cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，SYBR 12.5μl，水8.5μl，每个样本均做3个独立重复体系，反应体系为：94℃变性5min。94℃ 10s，62℃ 25s，72℃ 25s，40个循环。72℃延伸10min。
1.4 统计学分析 用SPSS 11.0进行数据处理，以均数±标准差（ ± s）表示，两组间行t检验。
2 结果
2.1葛根芩连汤对炎症性肠病中IL-1β mRNA表达的影响 同对照组相比，模型组IL-1β mRNA表达增加了1.8倍（##P<0.01）；应用阳性药物美沙拉嗪和葛根芩连汤治疗后，IL-1β mRNA表达虽然仍比对照组高，但相对于模型组，美沙拉嗪治疗后IL-1β mRNA表达下降了35%（**P <0.01），中剂量葛根芩连汤治疗后IL-1β mRNA表达下降了15%（*P <0.05），高剂量葛根芩连汤治疗后IL-1β mRNA表达下降了27%（*P <0.05），高剂量葛根芩连汤对IL-1β mRNA表达的抑制作用接近于美沙拉嗪。
2.2葛根芩连汤对炎症性肠病中IL-6 mRNA表达的影响 同对照组相比，模型组IL-6 mRNA表达增加了3.37倍（##P<0.01）；相对于模型组，应用美沙拉嗪治疗后IL-6 mRNA表达下降了60%（**P <0.01），中剂量葛根芩连汤治疗后IL-6 mRNA表达下降了34%（**P <0.01），高剂量葛根芩连汤治疗后IL-6 mRNA表达下降了41%（**P <0.01）。
3 讨论
炎症性肠病是由于各种微生物抗原的刺激，激活体内免疫系统，各种炎症细胞活化，释放多种炎性因子，导致促炎症细胞因子增多，抗炎细胞因子减少，从而引起的肠粘膜免疫反应异常和慢性炎症[2]。主要为IL- 1、IL- 6和TNF-α等。本研究得出，在大鼠IBD模型中，IL-1β 及IL-6 mRNA表达明显增加，同模型组相比，葛根芩连汤可显著抑制IL-1β 及IL-6mRNA在IBD大鼠模型中的表达，并呈现明显的剂效依赖性，高剂量葛根芩连汤对IL-1β 及IL-6mRNA的抑制程度接近阳性藥物美沙拉嗪，因此，葛根芩连汤对IBD疾病的治疗和缓解作用可能与其对IL- 1β及IL-6的抑制有关。我们认为，葛根芩连汤可通过抑制促炎细胞因子的表达对IBD急性期大鼠发挥显著的抗炎作用及修复炎症损伤的作用。
参考文献
[1] 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[J].北京：人民卫生出版社，2002.202～204.
[2] Tsianos EV，Katsanos K. Do we really understand what the immunological disturbances in inflammatory bowel disease mean[J].World J Gastroenterol. 2009，7；15（5）：521-5.