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摘 要：氨基甲酸乙酯（EC）是葡萄酒中的有毒物质。本文讲述了葡萄酒中EC的毒性机理、生物合成途径，阐述了影响葡萄酒中EC含量的因素并相应提出了控制方法，最终叙述了世界各国对酒精饮品中EC的安全限量，为我国尽早制定相应安全标准提供了理论依据和参照的标准。
关键词：氨基甲酸乙酯；葡萄酒；合成途径；影响因素；限量标准
中图分类号： 文献标识码： A
Research progress of ethyl Carbamate in wine
YANG Xue-wei1, Duan Xue-Rong, LI Hong-yu, DONG Xuan, ZHOU Guang-rong
(COFCO Huaxia Great Wall Wine Co. Ltd., Changli 066600, China)
Abstract: Ethyl Carbamate is a toxic substance in wine. This research summarized its toxic mechanism, biosynthesis pathways, and provided the relative control solution according to the influence factors to the content of EC in wine. In the final part, EC limit concentrations in alcohol drinks of some countries were given and provide reference standards and theoretical foundation for making our limitation in the future.
Key words: ethyl Carbamate; wine; biosynthesis pathway; influence factors; limitation
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），也称乌拉坦或尿烷（urethane），是发酵食品中的一种发酵副产物。EC的分子式C3H7NO2，分子量89.1，为无色无味的白色粉末状晶体，其主要的物理化学性质见表1[1]。EC不易挥发，在水中的溶解度大约为2g/mL，在有机溶剂中溶解度稍低，蒸气压较高，这些特征使得在分析检测酒精饮料中痕量EC时，样品前处理过程会造成EC的损失[2]。目前，大都采用气相色谱质谱联用（GC-MS）对葡萄酒中的EC进行定性定量分析[3]。
早在1943年，EC就被证实是一种致癌物质，2007年氨基甲酸乙酯被国际癌症研究机构（IARC）从2B类提升为2A类 [4, 5]。氨基甲酸乙酯可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病，而且乙醇对其致癌性有促进作用[6-8]。对氨基甲酸乙酯致癌机理的研究显示，其在生物体内的代谢主要与细胞色素P450有关[9, 10]。
氨基甲酸乙酯在体内的代谢途径有4条，前两条途径对人体无害，通过这些途径可将超过95%的精氨酸代谢为乙醇、氨和碳水化合物及尿而排出体外[11]；第三条途径中，细胞色素P450将氨基甲酸乙酯氧化成的DNA加聚物能够破坏DNA双链，进而导致癌变，这一途径大约代谢0.5%的精氨酸；最后一条途径中，细胞色素P450将大约0.1%的氨基甲酸乙酯氧化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，该物质能够在Cu2+存在时，造成DNA损伤，而且这种损伤多发生在脱氧核苷酸（T、C）的残基上，因此，这一途径通常被认为是氨基甲酸乙酯的主要致癌途径。
2 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的合成途径
自发酵食品和饮品中发现氨基甲酸乙酯以来，关于EC的合成途径主要有以下五条[2]：（1）焦碳酸二乙酯和氨反应形成；（2）氰化物和乙醇反应而生成；（3）氨甲酰磷酸和乙醇反应形成；（4）尿素和乙醇反应形成；（5）瓜氨酸和乙醇反应形成。目前研究表明，葡萄酒中氨基甲酸乙酯的产生主要通过以下两条途径[12, 13]。
2.1酵母菌的尿素循环途径（见图1）
在葡萄酒酿造中，尿素曾一直作为酵母氮源而被使用，直到1976年Ough在实验证明了乙醇和尿素在室温下反应72h后产生了氨基甲酸乙酯，人们才开始注意到葡萄酒中存在的尿素。酵母发酵过程中利用的尿素大部分是由精氨酸通过精氨酸酶（arginase）分解产生的，而精氨酸是葡萄汁中含量最丰富的氨基酸之一[14]，其含量过高时，由于酵母氮代谢的抑制作用，细胞不能进一步代谢尿素，导致其在细胞内积累，到一定程度时，被酵母释放到葡萄酒中，然后与乙醇自发反应生成氨基甲酸乙酯；然而Uthurry研究表明酵母对精氨酸的代谢不会被葡萄汁中过多的精氨酸抑制，因此酵母产生尿素的量会随着葡萄汁中精氨酸含量的增高而增加[15]。这一途径是葡萄酒中的氨基甲酸乙酯合成的主要途径[16, 17]。
注：(1)精氨酸酶; (2)鸟氨酸转氨甲酰酶; (3)精氨琥珀酸合成酶;
(4)精氨琥珀酸裂解酶; (5)脲酶; (6)氨甲酰磷酸合成酶
2.2苹果酸-乳酸菌的精氨酸脱亚胺途径
人们曾一度认为，苹果酸-乳酸菌对精氨酸的代谢也同酵母菌相似，是按照尿素循环的途径进行的，即精氨酸在精氨酸酶的作用下转变为尿素和鸟氨酸，尿素在脲酶的作用下转变为NH3和CO2，鸟氨酸则最终在鸟氨酸转氨甲酰酶的作用下转变为瓜氨酸[18]。但Liu等（1995, 1996, 1998）对苹果酸-乳酸菌中精氨酸代谢途径的研究表明，在细菌的培养过程中并未检测到尿素、精氨酸酶和脲酶活力的情况下，同样代谢精氨酸产生上述产物[19-21]。因此，苹果酸-乳酸菌对精氨酸的降解并不是通过尿素循环途径。
研究发现，在苹果酸-乳酸菌代谢精氨酸过程中存在着不同于尿素循环的三个关键酶：精氨酸脱亚胺酶、鸟氨酸转氨甲酰酶和氨基甲酰激酶 [22, 23]。在前人对异型发酵乳杆菌精氨酸代谢途径的研究基础上，Liu等（1998）提出了苹果酸-乳酸菌降解精氨酸的脱亚胺途径，即ADI途径[20]（图2）。
通过培养基的研究发现，某些细菌通过ADI途径代谢精氨酸的过程中，如O. oeni等，会有少量的瓜氨酸从细胞内分泌到培养基中。而在葡萄酒中，这些细菌的这一行为就会导致瓜氨酸与葡萄酒的乙醇自发反应生成EC[24]。目前尚未对瓜氨酸向胞外分泌的现象进行代谢机理的深刻研究，初步认为这可能是因为ADI途径中步骤1的反应速度较快，而反应2可能有反应上限，最终导致胞内瓜氨酸由于细菌自身保护而造成其外渗[25]。
3葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的影响因素及降低措施
影响葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的因素很多，主要有以下几个：
（1）葡萄汁中精氨酸含量[26]：葡萄酒发酵过程中精氨酸全部来源于葡萄汁，作为氨基甲酸乙酯的间接反应物，它的含量直接影响葡萄酒中EC的含量。而葡萄汁中的精氨酸含量主要与葡萄园的管理方式相关。
（2）酵母菌和苹果酸-乳酸菌的种类[15]：酵母菌对尿素的生成以及精氨酸的合成具有菌株间的差异。早在1993年，研究学者An等就对8株酿酒酵母发酵而成的酒中尿素的含量进行检测，发现有7株对应酒样中尽管含量各不相同，但都发现有尿素的积累，一株Lalvin 71B对应的样品中却没有发现尿素。
（3）发酵温度[27]和时间[28]：研究发现氨基甲酸乙酯的形成与温度直接相关，温度每升高10℃，氨基甲酸乙酯的形成速度变为为升温前的2倍。
（4）带酒脚的陈酿方式[29]：这种陈酿方式主要是老牌葡萄酒产国—法国的陈酿方式之一，主要是为了获得更好的葡萄酒风味。然而发酵结束后，酿酒酵母就会自溶，直接将细胞内的尿素释放于葡萄酒中，与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯。有研究表明，此种陈酿方式，葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量立刻提高，与陈酿时间不存在相关性。
与影响氨基甲酸乙酯含量的因素相对应，得到以下一些降低其产生的方法[13]：（1）改善葡萄园管理，选择氮含量低的砧木：研究表明葡萄栽培品种和砧木、施肥、修剪、灌溉等栽培管理措施[30]都直接影响葡萄汁中精氨酸的含量；（2）通过对酿酒微生物的选育，选择低产尿素的酵母菌和不具有arcABC基因或者精氨酸脱亚胺酶活性低的酒酒球菌，或者直接通过基因工程技术，通过基因重组构建含有酸性脲酶的工程菌，或通过敲出arcABC乳酸菌基因的方法构建酿酒工程菌；（3）控制葡萄酒酿造条件，尽量低温发酵[31]；（4）改善酿酒工艺，尽量避免带酒脚的陈酿方式，还可向葡萄酒中添加酸性脲酶将酵母中代谢的尿素转化为氨，降低其积累，直接减少酵母的排出胞外尿素含量等。
4 氨基甲酸乙酯与葡萄酒安全
人体摄取的氨基甲酸乙酯主要来源于酒精饮料的饮用[32]，葡萄酒中EC含量与人体健康密切相关[33]，为此世界许多国家的卫生机构与组织作出了相关规定。加拿大卫生与福利组织在1985年规定了各类酒中的氨基甲酸乙酯的限量，佐餐葡萄酒30μg/L，蒸馏酒150μg/L，强化葡萄酒100μg/L等。美国葡萄酒工业规定的限量为：佐餐葡萄酒15μg/L，餐后甜葡萄酒60μg/L。联合国粮农组织在2002年规定氨基甲酸乙酯的限量标准为20μg/L。然而作为葡萄酒的消费大国，我国目前却仅制定了出口黄酒中氨基甲酸乙酯的行业检测标准[34]，而对于酒精饮料或者发酵食品中氨基甲酸乙酯的限量标准，尚未做出规定。
为了尽快制定我国葡萄酒中 EC 的限量标准，保护我国葡萄酒消费者利益，国内许多学者已经对氨基甲酸乙酯产生途径[16]、检测方法[4, 11, 34-36]、在发酵食品中含量[1, 9, 37-39]以及污染估等进行了研究，并提出了我国葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的限制性标准的建议[40]，为葡萄酒的卫生以及安全提供了十分重要的理论依据，以期葡萄酒行业今后的蓬勃发展。
参考文献：
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关键词：氨基甲酸乙酯；葡萄酒；合成途径；影响因素；限量标准
中图分类号： 文献标识码： A
Research progress of ethyl Carbamate in wine
YANG Xue-wei1, Duan Xue-Rong, LI Hong-yu, DONG Xuan, ZHOU Guang-rong
(COFCO Huaxia Great Wall Wine Co. Ltd., Changli 066600, China)
Abstract: Ethyl Carbamate is a toxic substance in wine. This research summarized its toxic mechanism, biosynthesis pathways, and provided the relative control solution according to the influence factors to the content of EC in wine. In the final part, EC limit concentrations in alcohol drinks of some countries were given and provide reference standards and theoretical foundation for making our limitation in the future.
Key words: ethyl Carbamate; wine; biosynthesis pathway; influence factors; limitation
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），也称乌拉坦或尿烷（urethane），是发酵食品中的一种发酵副产物。EC的分子式C3H7NO2，分子量89.1，为无色无味的白色粉末状晶体，其主要的物理化学性质见表1[1]。EC不易挥发，在水中的溶解度大约为2g/mL，在有机溶剂中溶解度稍低，蒸气压较高，这些特征使得在分析检测酒精饮料中痕量EC时，样品前处理过程会造成EC的损失[2]。目前，大都采用气相色谱质谱联用（GC-MS）对葡萄酒中的EC进行定性定量分析[3]。
早在1943年，EC就被证实是一种致癌物质，2007年氨基甲酸乙酯被国际癌症研究机构（IARC）从2B类提升为2A类 [4, 5]。氨基甲酸乙酯可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病，而且乙醇对其致癌性有促进作用[6-8]。对氨基甲酸乙酯致癌机理的研究显示，其在生物体内的代谢主要与细胞色素P450有关[9, 10]。
氨基甲酸乙酯在体内的代谢途径有4条，前两条途径对人体无害，通过这些途径可将超过95%的精氨酸代谢为乙醇、氨和碳水化合物及尿而排出体外[11]；第三条途径中，细胞色素P450将氨基甲酸乙酯氧化成的DNA加聚物能够破坏DNA双链，进而导致癌变，这一途径大约代谢0.5%的精氨酸；最后一条途径中，细胞色素P450将大约0.1%的氨基甲酸乙酯氧化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，该物质能够在Cu2+存在时，造成DNA损伤，而且这种损伤多发生在脱氧核苷酸（T、C）的残基上，因此，这一途径通常被认为是氨基甲酸乙酯的主要致癌途径。
2 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的合成途径
自发酵食品和饮品中发现氨基甲酸乙酯以来，关于EC的合成途径主要有以下五条[2]：（1）焦碳酸二乙酯和氨反应形成；（2）氰化物和乙醇反应而生成；（3）氨甲酰磷酸和乙醇反应形成；（4）尿素和乙醇反应形成；（5）瓜氨酸和乙醇反应形成。目前研究表明，葡萄酒中氨基甲酸乙酯的产生主要通过以下两条途径[12, 13]。
2.1酵母菌的尿素循环途径（见图1）
在葡萄酒酿造中，尿素曾一直作为酵母氮源而被使用，直到1976年Ough在实验证明了乙醇和尿素在室温下反应72h后产生了氨基甲酸乙酯，人们才开始注意到葡萄酒中存在的尿素。酵母发酵过程中利用的尿素大部分是由精氨酸通过精氨酸酶（arginase）分解产生的，而精氨酸是葡萄汁中含量最丰富的氨基酸之一[14]，其含量过高时，由于酵母氮代谢的抑制作用，细胞不能进一步代谢尿素，导致其在细胞内积累，到一定程度时，被酵母释放到葡萄酒中，然后与乙醇自发反应生成氨基甲酸乙酯；然而Uthurry研究表明酵母对精氨酸的代谢不会被葡萄汁中过多的精氨酸抑制，因此酵母产生尿素的量会随着葡萄汁中精氨酸含量的增高而增加[15]。这一途径是葡萄酒中的氨基甲酸乙酯合成的主要途径[16, 17]。
注：(1)精氨酸酶; (2)鸟氨酸转氨甲酰酶; (3)精氨琥珀酸合成酶;
(4)精氨琥珀酸裂解酶; (5)脲酶; (6)氨甲酰磷酸合成酶
2.2苹果酸-乳酸菌的精氨酸脱亚胺途径
人们曾一度认为，苹果酸-乳酸菌对精氨酸的代谢也同酵母菌相似，是按照尿素循环的途径进行的，即精氨酸在精氨酸酶的作用下转变为尿素和鸟氨酸，尿素在脲酶的作用下转变为NH3和CO2，鸟氨酸则最终在鸟氨酸转氨甲酰酶的作用下转变为瓜氨酸[18]。但Liu等（1995, 1996, 1998）对苹果酸-乳酸菌中精氨酸代谢途径的研究表明，在细菌的培养过程中并未检测到尿素、精氨酸酶和脲酶活力的情况下，同样代谢精氨酸产生上述产物[19-21]。因此，苹果酸-乳酸菌对精氨酸的降解并不是通过尿素循环途径。
研究发现，在苹果酸-乳酸菌代谢精氨酸过程中存在着不同于尿素循环的三个关键酶：精氨酸脱亚胺酶、鸟氨酸转氨甲酰酶和氨基甲酰激酶 [22, 23]。在前人对异型发酵乳杆菌精氨酸代谢途径的研究基础上，Liu等（1998）提出了苹果酸-乳酸菌降解精氨酸的脱亚胺途径，即ADI途径[20]（图2）。
通过培养基的研究发现，某些细菌通过ADI途径代谢精氨酸的过程中，如O. oeni等，会有少量的瓜氨酸从细胞内分泌到培养基中。而在葡萄酒中，这些细菌的这一行为就会导致瓜氨酸与葡萄酒的乙醇自发反应生成EC[24]。目前尚未对瓜氨酸向胞外分泌的现象进行代谢机理的深刻研究，初步认为这可能是因为ADI途径中步骤1的反应速度较快，而反应2可能有反应上限，最终导致胞内瓜氨酸由于细菌自身保护而造成其外渗[25]。
3葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的影响因素及降低措施
影响葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的因素很多，主要有以下几个：
（1）葡萄汁中精氨酸含量[26]：葡萄酒发酵过程中精氨酸全部来源于葡萄汁，作为氨基甲酸乙酯的间接反应物，它的含量直接影响葡萄酒中EC的含量。而葡萄汁中的精氨酸含量主要与葡萄园的管理方式相关。
（2）酵母菌和苹果酸-乳酸菌的种类[15]：酵母菌对尿素的生成以及精氨酸的合成具有菌株间的差异。早在1993年，研究学者An等就对8株酿酒酵母发酵而成的酒中尿素的含量进行检测，发现有7株对应酒样中尽管含量各不相同，但都发现有尿素的积累，一株Lalvin 71B对应的样品中却没有发现尿素。
（3）发酵温度[27]和时间[28]：研究发现氨基甲酸乙酯的形成与温度直接相关，温度每升高10℃，氨基甲酸乙酯的形成速度变为为升温前的2倍。
（4）带酒脚的陈酿方式[29]：这种陈酿方式主要是老牌葡萄酒产国—法国的陈酿方式之一，主要是为了获得更好的葡萄酒风味。然而发酵结束后，酿酒酵母就会自溶，直接将细胞内的尿素释放于葡萄酒中，与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯。有研究表明，此种陈酿方式，葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量立刻提高，与陈酿时间不存在相关性。
与影响氨基甲酸乙酯含量的因素相对应，得到以下一些降低其产生的方法[13]：（1）改善葡萄园管理，选择氮含量低的砧木：研究表明葡萄栽培品种和砧木、施肥、修剪、灌溉等栽培管理措施[30]都直接影响葡萄汁中精氨酸的含量；（2）通过对酿酒微生物的选育，选择低产尿素的酵母菌和不具有arcABC基因或者精氨酸脱亚胺酶活性低的酒酒球菌，或者直接通过基因工程技术，通过基因重组构建含有酸性脲酶的工程菌，或通过敲出arcABC乳酸菌基因的方法构建酿酒工程菌；（3）控制葡萄酒酿造条件，尽量低温发酵[31]；（4）改善酿酒工艺，尽量避免带酒脚的陈酿方式，还可向葡萄酒中添加酸性脲酶将酵母中代谢的尿素转化为氨，降低其积累，直接减少酵母的排出胞外尿素含量等。
4 氨基甲酸乙酯与葡萄酒安全
人体摄取的氨基甲酸乙酯主要来源于酒精饮料的饮用[32]，葡萄酒中EC含量与人体健康密切相关[33]，为此世界许多国家的卫生机构与组织作出了相关规定。加拿大卫生与福利组织在1985年规定了各类酒中的氨基甲酸乙酯的限量，佐餐葡萄酒30μg/L，蒸馏酒150μg/L，强化葡萄酒100μg/L等。美国葡萄酒工业规定的限量为：佐餐葡萄酒15μg/L，餐后甜葡萄酒60μg/L。联合国粮农组织在2002年规定氨基甲酸乙酯的限量标准为20μg/L。然而作为葡萄酒的消费大国，我国目前却仅制定了出口黄酒中氨基甲酸乙酯的行业检测标准[34]，而对于酒精饮料或者发酵食品中氨基甲酸乙酯的限量标准，尚未做出规定。
为了尽快制定我国葡萄酒中 EC 的限量标准，保护我国葡萄酒消费者利益，国内许多学者已经对氨基甲酸乙酯产生途径[16]、检测方法[4, 11, 34-36]、在发酵食品中含量[1, 9, 37-39]以及污染估等进行了研究，并提出了我国葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的限制性标准的建议[40]，为葡萄酒的卫生以及安全提供了十分重要的理论依据，以期葡萄酒行业今后的蓬勃发展。
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