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目的验证遗传毒性实验(推荐的标准组合)的有效性。通过多轮实验来优化和确定实验阳性对照物的剂量及实验参数,建立实验有效性的标准和阳性结果的评判标准。建立和积累实验室历史数据。方法①细菌回复突变实验(Ames实验)采用鼠伤寒沙门氏菌TA97,TA98,TA100,TA102和TA1535,在加S9和不加S9情况下,每个测试菌株用不同剂量浓度的对应阳性对照物处理,采用预培养法进行试验,每个剂量平行做3皿,记数各平板中的突变菌落数。并以纯净水水和二甲亚砜(DMSO)分别作为阴性对照。②体外哺乳动物细胞染色体畸变实验采用CHL细胞,在加S9时,使用不同浓度环磷酰胺(阳性对照物)处理细胞;在不加S9时,使用丝裂霉素C(阳性对照物)处理细胞。每个剂量组观察200个可记数中期相细胞,计算其畸变细胞发生率。并以溶媒纯净水作为阴性对照。③小鼠骨髓微核验证实验采用KM小鼠,经腹腔注射给药,阳性对照物为环磷酰胺,取股骨骨髓细胞涂片,甲醇固定后2～8℃保存,吉姆萨染色观察骨髓涂片中微核多染红细胞出现的频率。并以溶媒纯净水作为阴性对照。结果①Ames实验测得各阳性药的最佳浓度为:ICR191(TA97-S9致突变剂)2.0 g/皿,2-硝基芴(TA98-S9致突变剂)10.0 g/皿,丝裂霉素C(TA102-S9、+S9致突变剂)2.0 g/皿,叠氮化钠(TA100和TA1535-S9致突变剂)2.0 g/皿;2-氨基芴(TA97,TA98和TA100+S9诱变剂)10 g/皿;环磷酰胺(TA1535+S9)致突变剂200.0 g/皿。各阳性药各菌株的回复突变菌落数均超过溶媒对照组的2倍以上,显著高于溶媒对照组回复突变菌落数(P<0.05)。②体外哺乳动物细胞染色体畸变实验各阳性药的最佳浓度为:环磷酰胺(+S9)10 g.ml-1,丝裂霉素C(-S9)0.2 g.ml-1。阳性对照组与溶媒对照组相比,畸变细胞频率显著增加(P<0.01)。③小鼠骨髓微核实验阳性药环磷酰胺剂量为40.0 mg·kg-1时最佳,阳性对照组MNPCE比率明显高于溶媒对照组,与溶媒对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结论①Ames试验。在本实验条件下,所有菌株相应的基因型测试合格,菌株自发回复突变率与文献报道相近,阳性对照组出现阳性结果且该阳性结果可重复。在1个或多个剂量组菌落数为溶媒对照组的2倍或以上,试验结果可重复,与溶媒对照组比较菌落数增加有统计学意义(P<0.05),可判结果为阳性;或者回复突变菌落数出现剂量依赖性增加和(或)在1个或多个剂量组上出现可重复性的增加,可判结果为阳性。②体外哺乳动物细胞染色体畸变实验。溶媒对照组的畸变细胞百分比应小于8%;至少应有三个剂量组的细胞可用于计数,即该剂量组中应至少有100个可计数的中期相;阳性对照组、高剂量组(受试物)与溶媒对照组相比,畸变细胞频率应显著增加(P<0.05)。受试物组畸变细胞率与平行溶媒对照组具有显著性差异(P<0.05),可认为差异具有统计学意义,若有两个阳性点或细胞畸变率>10%,则可作为阳性结果;若只有一个阳性点或细胞畸变率>5%而<10%,则作为可疑阳性。③小鼠骨髓微核实验。溶媒对照组微核多染红细胞的频率低于5‰,各剂量组嗜多染红细胞和总红细胞的比例不能低于溶媒对照组比值的20%,与溶媒对照组比,阳性对照组微核嗜多染红细胞频率上调具有统计学意义(P<0.05)。在与相应溶媒对照组比较,受试物在1个或多个剂量诱导的微核嗜多染红细胞频率的上调具有统计学意义(P<0.05),并观察见剂量-反应趋势;与相应溶媒对照组相比,供试品在2个或多个剂量诱导的微核嗜多染红细胞频率的上调具有统计学意义(P<0.05),即使未观察见剂量-反应趋势。