【摘 要】
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背景:以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床.目的:构建携带人碱性成纤维细胞生长因
【机 构】
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新疆医科大学第一附属医院,新疆医科大学地方病重点分子生物学实验室
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背景:以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床.目的:构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达.方法:实验组:设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO(r) 表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建.在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG 共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs.对照组:设计GFP基因引物,以GFP- PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO(r) 表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs.RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达.结果与结论:转染48 h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15 d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达.提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法.
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