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摘 要 MYC是bHLH转录因子家族的亚家族成员，在植物茉莉酸信号转导过程中发挥着重要的调节作用。HblMYC3是从巴西橡胶树的乳管细胞中分离鉴定到的MYC类转录因子，其基因表达受割胶和茉莉酸上调。采用酵母双杂交方法初步筛选HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在进一步了解HblMYC3的功能。结果表明：HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧还蛋白2、含A20和 AN1 锌指结构域的胁迫相关蛋白5、28 ku热和酸稳定的磷蛋白以及25 ku泛素连接酶E2等7种蛋白不同程度地与HblMYC3蛋白互作。基于这些互作蛋白的功能，推测HblMYC1或HblMYC2通过与HblMYC3形成二聚体对小橡胶粒子膜蛋白基因表达进行调控，其他蛋白参与胁迫条件下维持二聚体的稳定性和胁迫反应后降解该二聚体。
关键词 巴西橡胶树；HblMYC3基因；酵母双杂交；蛋白相互作用
中图分类号 S794.1 文献标示码 A
Abstract MYC transcription factors are the members of bHLH-type transcription factor superfamily and play an important role in jasmonate signaling transduction. Available data show that HblMYC3 gene is a typical MYC transcriptional factor gene and its transcripts are both enriched in laticifer cells and induced by tapping and exogenous JA. For further revealing its biological functions in laticifer cells， the yeast two-hybridization method was applied to screen candidate interacting partners of the HblMYC3. The results showed that HblMYC1， HblMYC2， DNAJ， glutaredoxin2， zinc finger A20 and AN1 domain-containing stress-associated protein 5， 28 ku heat- and acid-stable phosphoprotein and a 25 ku ubiquitin-conjugating enzyme E2 were detected to interact with HblMYC3 to varying degrees. Based on the reported functions of these candidate parterners， HblMYC1 or HblMYC2 may participate in the regulation of HblMYC3 on the SRPP gene expression in a dimer form， while the others contribute to the stability of the dimer during functioning and thereafter the digestion of the dimer through ubiquitin-mediated proteolysis.
Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.；HblMYC3 gene；Yeast two-hybridization；Protein interaction
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.012
植物bHLH类（basic helix-loop-helix）转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，参与植物的生长发育、逆境响应和次生代谢调控等生物学过程[1]。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）、烟草（Nicotiana tabacum L.）和水稻（Oryza sativa L.）中已分离鉴定出各种类型的bHLH类亚家族成员[2]。其中MYC亚家族成员，其N端含有典型的MYC结构域，能够和CACGTG或CATGTG 特征的 E-box（CANNTG）又称为（MYC consensus motif）结合，在植物茉莉酸信号转导和次生代谢中发挥着十分重要的调节作用[3]。
已有研究结果表明，MYC类转录因子是茉莉酸信号传导的关键组分之一[4-5]。拟南芥中AtMYC2/3/4类转录因子参与调控拟南芥表皮毛的发育、伤害反应和对虫害的防御及次生代谢物质合成[6]，表明MYC类转录因子是重要的逆境响应调节因子，同时具有调控次生代谢物合成的功能。本实验室前期从橡胶树乳管细胞的胶乳中分离到若干MYC类转录因子基因。如HblMYC1、HblMYC2、HblMYC3、HblMYC4和HblMYC5基因等。这些基因对割胶、茉莉酸和乙烯处理反应模式不尽相同，既表现出冗余性又有独特的表达模式。其中HblMYC3基因能够直接结合橡胶合成相关基因HbSRPP上游启动子区，调控该基因的表达，并且HblMYC3基因受割胶、茉莉酸和乙烯诱导表达[7]。同时发现HblMYC3基因在成龄高产品种中的表达量显著地高于低产种质[8]，这表明HblMYC3基因与橡胶产量相关。因此，研究HblMYC3基因参与对橡胶生物合成调控的分子机制具有重要的理论意义和实际应用价值。
目前除了包杰[9]发现HblMYC3蛋白能够与HblMYC1蛋白互作外，还未见利用酵母双杂交技术高通量筛选HblMYC3蛋白的互作蛋白报道。因此本研究拟通过酵母双杂交技术，初步筛选与HblMYC3蛋白互作的蛋白，为进一步研究茉莉酸信号途径的调控机制奠定良好基础。 1 材料与方法
1.1 材料
胶乳总RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司；cDNA反转录试剂盒、快速限制性内切酶购自于Thermo ScientificTM公司；PCR克隆所需试剂2x PrimeSTAR Max premix、胶回收试剂盒购自于宝生物工程大连有限公司；克隆载体pEASY-Blunt、大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶购自NEB（北京）公司；酵母双杂交cDNA文库构建试剂盒、酵母双杂交实验所用pGBKT7和pGADT7载体、Y2HGold酵母菌株及酵母质粒提取试剂盒购自于Clontech公司。
1.2 方法
1.2.1 构建酵母双杂交pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体 根据NCBI数据库中HblMYC3基因（GenBank：HM347338）的编码框序列设计分别带有SfiⅠ和XmaⅠ酶切位点的载体构建引物：SfiⅠ-HblMYC3-S：5′-CGGCCATGGAGGCCATGGAGGAG
ATAACGTCCCC-3，XmaⅠ-HblMYC3-A：5′-TCCCCGGGTCATAGGCTAGCAGCTAAGTTCTG-3′。载体构建所需模板来自于橡胶树胶乳RNA反转录合成的cDNA，其提取和合成参照试剂盒中的标准方法。PCR反应体系为：总体积20 μL，其中水 8 μL，2×PrimerSTAR Max permix 10 μL，正反向引物（10 μm/L）各0.5 μL， cDNA模板1 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后切取正确条带回收。纯化的PCR回收产物与载体pEASY-Blunt在25 ℃连接20 min后，转化50 μL Trans1-T1感受态细胞涂氨苄抗性平板置于37 ℃孵育过夜。利用载体通用引物M13F和M13R，通过RT-PCR反应鉴定阳性克隆，送英骏公司测序鉴定正确后，提取pEASY-HblMYC3质粒，用SfiⅠ和XmaⅠ进行双酶切，反应体系为：总体积20 μL，其中水12 μL，pEASY-HblMYC3或pGBKT7质粒4 μL，l0×digestion buffer 2 μL，SfiⅠ1 μL，XmaⅠ1 μL，37 ℃酶切反应1 h。回收纯化正确条带，然后将胶回收片段SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ和酶切过的载体pGBKT7按照如下体系连接：水1 μL，SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ4 μL，pGBKT7 3 μL，10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16 ℃连接过夜。连接产物转化参照前述方法进行。用载体构建基因引物检测阳性克隆菌后，提取质粒pGBKT7-HblMYC3，双酶切鉴定插入片段大小，并送英俊公司测序鉴定。
1.2.2 pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体转化Y2HGold酵母菌 酵母感受态细胞的制备和转化主要参考訾亮等[10]的方法。
1.2.3 重组质粒pGBKT7-HblMYC3自激活作用验证 将含有重组质粒pGBKT7-HblMYC3的阳性酵母菌和对照酵母菌分别接种于20 mL的SD/-Trp液体培养基中培养过夜，检测菌体浓度后统一调OD600至0.6左右，然后取4 μL 菌液分别滴加到SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade（添加显色剂）的缺陷型平板上，30 ℃生长3～6 d后记录其生长情况。同时为了确定后续酵母双杂交实验条件，本研究将空pGADT7-AD载体和pGBKT7-HblMYC3一起转化Y2HGold酵母菌株，然后涂布SD/-Trp-Leu平板，参照上述自激活检测方法将酵母菌点至SD/-Leu-Trp和SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加生长抑制剂3-AT）平板上，记录其生长情况。
1.2.4 酵母双杂交cDNA文库构建 酵母双杂交cDNA文库构建采用Clontech公司的酵母双杂交cDNA文库试剂盒，参照PT4085-1说明书中的方法进行。橡胶树胶乳材料采集于中国热带农业科学院儋州院区试验场种植的成年割胶树热研7-33-97。首先利用天根生化科技（北京）有限公司的植物RNA提取试剂盒提取胶乳样品的总RNA后，取2 μL RNA样品，1 μL CDSIII （Oligo-dT）引物和1 μL水置于72 ℃反应2 min，然后置于冰上冷却，再利用SMART MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA第一链（反应体系为2 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL DTT，1 μL dNTPs ，1 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，置于42 ℃反应10 min后，接着添加1 μL SMART III-modified oligo置于42 ℃反应60 min，75 ℃保温2 min以终止第一链反应，冷却至室温后，加入1 μL RNase H置于37 ℃反应20 min。取2 μL First-stand SMART cDNA，70 μL ddH2O，10 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 3′PCR primer，2 μL 5′PCR primer，10 μL Melting Solution， 2 μL 50× Advantage 2 polymerase Mix共100 μL体系按照95 ℃ 30 s，20个循环（95 ℃ 10 s，68 ℃ for 6 min，其中68 ℃延伸时间为每个循环增加5 s），68 ℃ for 5 min后得到双链cDNA，经过Clontech公司的Clontech CHROMA SPINTM TE-400 COLUMN柱子纯化后溶于20 μL ddH2O中待用。然后将20 μL ds cDNA和6 μL 线性化的pGADT7-Rec载体利用LiAc转化法转入Y187酵母菌株中，涂布于SD/-Leu平板上，于30 ℃培养3～4 d，用5 mL Freezing Medium充分重选每个SD/-Leu平板上的酵母菌，汇集所有酵母菌液后，利用Clontech公司的酵母质粒提取试剂盒提取质粒备用。 1.2.5 文库筛选和酵母双杂交阳性克隆的鉴定
在分析评价诱饵质粒的自激活作用后，将诱饵载体pGBKT7-HblMYC3用于酵母双杂交文库筛选实验，方法参照MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System（PT4084-1）。将在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上长出来的菌斑重新挑至新鲜的SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加显色剂）平板上继续筛选，能连续生长的菌即为候选的阳性克隆菌，提取质粒后转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂布氨苄抗性平板后得到阳性菌落，提取质粒后经载体测序引物T7和3′AD（Clontech公司）检测后，送至测序公司测序，测序结果在NCBI公共数据库中同源比对获取相应候选基因的注释信息。
2 结果与分析
2.1 重组pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体构建与验证
以橡胶树胶乳cDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增HblMYC3基因的1 450 bp大小的编码框（图1-A）。扩增片段经胶回收纯化后，与pEASY-Blunt载体连接，通过载体引物PCR筛选阳性克隆菌落，并检测质粒大小。用SfiⅠ和XmaⅠ双酶切含有目的片段的质粒，回收目的片段（图1-A）。将目的片段与pGBKT7载体连接，构建pGBKT7-HblMYC3重组载体，经pGBKT7载体通用引物PCR检测和双酶切验证，插入片段大小与预期大小一致（图1-B）。进一步通过测序验证插入目的片段的序列及其翻译产生的蛋白序列的正确性。把pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体转入Y2HGold酵母菌中，经pGBKT7载体通用引物PCR筛选阳性菌落（图1-C）。
2.2 pGBKT7-HblMYC3重组质粒自激活检测
含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌和含有空载体的酵母菌在SD/-Trp筛选平板上均能生长，而且除了阳性对照菌能够在SD/-Trp-His-Ade筛选平板上很好的生长外，阴性对照菌不能在该筛选平板上良好生长，含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌生长较慢，菌落很小，这些结果表明pGBKT7-HblMYC3重组质粒自激活很弱，通过控制筛选条件可用于后续文库筛选（图2）。通过在SD/-Trp-His-Ade筛选平板上添加1mmol/L 3-AT生长抑制剂能够抑制pGBKT7-HblMYC3的酵母菌的背景生长，而阳性对照菌仍能正常良好生长（图2）。由此确定后续HblMYC3蛋白的酵母文库筛选的条件：SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT （1 mmol/L）。
2.3 阳性克隆的筛选和测序分析
经过在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上筛选得到了7个酵母菌株。这些候选的酵母菌株接种到SD/-Trp-Leu和添加显色剂的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上的生长情况见图3。这些阳性酵母菌都能不同程度地在筛选平板上生长，同时其生长情况和显色程度的差异可能体现了候选蛋白与靶蛋白HblMYC3之间不同强度的结合能力。阳性酵母菌中的质粒经过测序后，在NCBI数据库中同源比对分析，结果表明候选蛋白分别为DNAJ分子伴侣/蛋白、参与活性氧清除的glutaredoxin2蛋白、转录因子LMYC1和LMYC2、ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白酶体相关蛋白，含zinc finger A20 and AN1 domain的胁迫相关蛋白、参与细胞增殖和信号传导的28 ku热、酸稳定磷蛋白（表1）。
3 讨论与结论
橡胶树乳管是一种功能特化的组织，其主要功能是合成天然橡胶。天然橡胶主要在胶乳中的小橡胶粒子上合成[11]，而SRPP蛋白是小橡胶粒子中含量最丰富的蛋白[12]，参与了天然橡胶合成的调节。HblMYC3是从巴西橡胶树的乳管细胞中分离鉴定到的MYC类转录因子，其基因表达受割胶和茉莉酸上调。HblMYC3转录因子是SRPP基因表达的上游调控因子，它能直接结合SRPP基因的启动子，上调SRPP基因的表达[7]。因此推测HblMYC3基因是重要的参与橡胶生物合成调节的因子。本研究采用酵母双杂交方法初步筛选HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在进一步了解HblMYC3的功能。酵母双杂交技术是比较成熟和经典的筛选靶蛋白的互作蛋白的方法，已经成功应用于橡胶树分子生物学的研究中。例如，邓治等[13]和杨子平等[14]分别利用该方法筛选到胶乳中与转录因子HbMyb1蛋白、HbRZF蛋白的互作蛋白；曾日中等[15]利用该方法筛选到胶乳中REF蛋白的互作蛋白。本研究利用酵母双杂交技术筛选到HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧还蛋白2、含A20和 AN1 锌指结构域的胁迫相关蛋白5、28 ku热、酸稳定的磷蛋白以及25 ku泛素连接酶E2等7种蛋白，它们不同程度地与HblMYC3蛋白互作，推测HblMYC3可能与这些蛋白在胶乳中形成不同的复合体，参与不同的生物学过程。
DNAJ蛋白是重要的分子伴侣蛋白，对靶蛋白起保护作用，参与了植物对各种逆境胁迫的反应[16-17]。橡胶生产中通过割胶收集胶乳，而割胶对橡胶树而言是一种伤害胁迫。HblMYC3能够被割胶处理诱导表达，表明HblMYC3参与了对这一逆境胁迫的反应，而橡胶树DNAJ蛋白能够与HblMYC3蛋白互作，可能对保护HblMYC3蛋白有一定作用。
另外筛选到2个已经报道的橡胶树胶乳转录因子HblMYC1（或LMYC1）和HblMYC2（或LMYC2）。HblMYC1和HblMYC2基因与HblMYC3基因同属于MYC亚类转录因子成员[7]。它们能够被割胶胁迫和茉莉酸诱导表达[18]，但两者的表达模式相反。HblMYC1和HblMYC2基因不能够直接结合SRPP基因的上游启动子（1 103 bp）[7]。因此，HblMYC1或HblMYC2蛋白可能通过与HblMYC3蛋白形成异源二聚体转录因子复合体参与调控SRPP基因的表达。本实验室曾利用点对点酵母双杂交证明HblMYC3蛋白与HblMYC1蛋白的相互作用[9]。 Glutaredoxin为谷氧还蛋白，参与活性氧的清除，其作用与硫氧还蛋白（Thioredoxin）类似[19]。HblMYC3与glutaredoxin蛋白之间的相互作用可能暗示HblMYC3蛋白参与了胶乳中的抗氧化过程。同时HblMYC3与ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白之间的相互作用表明HblMYC3蛋白同样经由泛素连接酶E2介导的泛素化降解过程。
基于这些互作蛋白的功能，推测HblMYC1或HblMYC2通过与HblMYC3形成二聚体调控小橡胶粒子膜蛋白基因表达，其他蛋白参与胁迫条件下维持该二聚体的稳定性和胁迫反应后降解该蛋白。
参考文献
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关键词 巴西橡胶树；HblMYC3基因；酵母双杂交；蛋白相互作用
中图分类号 S794.1 文献标示码 A
Abstract MYC transcription factors are the members of bHLH-type transcription factor superfamily and play an important role in jasmonate signaling transduction. Available data show that HblMYC3 gene is a typical MYC transcriptional factor gene and its transcripts are both enriched in laticifer cells and induced by tapping and exogenous JA. For further revealing its biological functions in laticifer cells， the yeast two-hybridization method was applied to screen candidate interacting partners of the HblMYC3. The results showed that HblMYC1， HblMYC2， DNAJ， glutaredoxin2， zinc finger A20 and AN1 domain-containing stress-associated protein 5， 28 ku heat- and acid-stable phosphoprotein and a 25 ku ubiquitin-conjugating enzyme E2 were detected to interact with HblMYC3 to varying degrees. Based on the reported functions of these candidate parterners， HblMYC1 or HblMYC2 may participate in the regulation of HblMYC3 on the SRPP gene expression in a dimer form， while the others contribute to the stability of the dimer during functioning and thereafter the digestion of the dimer through ubiquitin-mediated proteolysis.
Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.；HblMYC3 gene；Yeast two-hybridization；Protein interaction
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.012
植物bHLH类（basic helix-loop-helix）转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，参与植物的生长发育、逆境响应和次生代谢调控等生物学过程[1]。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）、烟草（Nicotiana tabacum L.）和水稻（Oryza sativa L.）中已分离鉴定出各种类型的bHLH类亚家族成员[2]。其中MYC亚家族成员，其N端含有典型的MYC结构域，能够和CACGTG或CATGTG 特征的 E-box（CANNTG）又称为（MYC consensus motif）结合，在植物茉莉酸信号转导和次生代谢中发挥着十分重要的调节作用[3]。
已有研究结果表明，MYC类转录因子是茉莉酸信号传导的关键组分之一[4-5]。拟南芥中AtMYC2/3/4类转录因子参与调控拟南芥表皮毛的发育、伤害反应和对虫害的防御及次生代谢物质合成[6]，表明MYC类转录因子是重要的逆境响应调节因子，同时具有调控次生代谢物合成的功能。本实验室前期从橡胶树乳管细胞的胶乳中分离到若干MYC类转录因子基因。如HblMYC1、HblMYC2、HblMYC3、HblMYC4和HblMYC5基因等。这些基因对割胶、茉莉酸和乙烯处理反应模式不尽相同，既表现出冗余性又有独特的表达模式。其中HblMYC3基因能够直接结合橡胶合成相关基因HbSRPP上游启动子区，调控该基因的表达，并且HblMYC3基因受割胶、茉莉酸和乙烯诱导表达[7]。同时发现HblMYC3基因在成龄高产品种中的表达量显著地高于低产种质[8]，这表明HblMYC3基因与橡胶产量相关。因此，研究HblMYC3基因参与对橡胶生物合成调控的分子机制具有重要的理论意义和实际应用价值。
目前除了包杰[9]发现HblMYC3蛋白能够与HblMYC1蛋白互作外，还未见利用酵母双杂交技术高通量筛选HblMYC3蛋白的互作蛋白报道。因此本研究拟通过酵母双杂交技术，初步筛选与HblMYC3蛋白互作的蛋白，为进一步研究茉莉酸信号途径的调控机制奠定良好基础。 1 材料与方法
1.1 材料
胶乳总RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司；cDNA反转录试剂盒、快速限制性内切酶购自于Thermo ScientificTM公司；PCR克隆所需试剂2x PrimeSTAR Max premix、胶回收试剂盒购自于宝生物工程大连有限公司；克隆载体pEASY-Blunt、大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶购自NEB（北京）公司；酵母双杂交cDNA文库构建试剂盒、酵母双杂交实验所用pGBKT7和pGADT7载体、Y2HGold酵母菌株及酵母质粒提取试剂盒购自于Clontech公司。
1.2 方法
1.2.1 构建酵母双杂交pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体 根据NCBI数据库中HblMYC3基因（GenBank：HM347338）的编码框序列设计分别带有SfiⅠ和XmaⅠ酶切位点的载体构建引物：SfiⅠ-HblMYC3-S：5′-CGGCCATGGAGGCCATGGAGGAG
ATAACGTCCCC-3，XmaⅠ-HblMYC3-A：5′-TCCCCGGGTCATAGGCTAGCAGCTAAGTTCTG-3′。载体构建所需模板来自于橡胶树胶乳RNA反转录合成的cDNA，其提取和合成参照试剂盒中的标准方法。PCR反应体系为：总体积20 μL，其中水 8 μL，2×PrimerSTAR Max permix 10 μL，正反向引物（10 μm/L）各0.5 μL， cDNA模板1 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后切取正确条带回收。纯化的PCR回收产物与载体pEASY-Blunt在25 ℃连接20 min后，转化50 μL Trans1-T1感受态细胞涂氨苄抗性平板置于37 ℃孵育过夜。利用载体通用引物M13F和M13R，通过RT-PCR反应鉴定阳性克隆，送英骏公司测序鉴定正确后，提取pEASY-HblMYC3质粒，用SfiⅠ和XmaⅠ进行双酶切，反应体系为：总体积20 μL，其中水12 μL，pEASY-HblMYC3或pGBKT7质粒4 μL，l0×digestion buffer 2 μL，SfiⅠ1 μL，XmaⅠ1 μL，37 ℃酶切反应1 h。回收纯化正确条带，然后将胶回收片段SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ和酶切过的载体pGBKT7按照如下体系连接：水1 μL，SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ4 μL，pGBKT7 3 μL，10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16 ℃连接过夜。连接产物转化参照前述方法进行。用载体构建基因引物检测阳性克隆菌后，提取质粒pGBKT7-HblMYC3，双酶切鉴定插入片段大小，并送英俊公司测序鉴定。
1.2.2 pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体转化Y2HGold酵母菌 酵母感受态细胞的制备和转化主要参考訾亮等[10]的方法。
1.2.3 重组质粒pGBKT7-HblMYC3自激活作用验证 将含有重组质粒pGBKT7-HblMYC3的阳性酵母菌和对照酵母菌分别接种于20 mL的SD/-Trp液体培养基中培养过夜，检测菌体浓度后统一调OD600至0.6左右，然后取4 μL 菌液分别滴加到SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade（添加显色剂）的缺陷型平板上，30 ℃生长3～6 d后记录其生长情况。同时为了确定后续酵母双杂交实验条件，本研究将空pGADT7-AD载体和pGBKT7-HblMYC3一起转化Y2HGold酵母菌株，然后涂布SD/-Trp-Leu平板，参照上述自激活检测方法将酵母菌点至SD/-Leu-Trp和SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加生长抑制剂3-AT）平板上，记录其生长情况。
1.2.4 酵母双杂交cDNA文库构建 酵母双杂交cDNA文库构建采用Clontech公司的酵母双杂交cDNA文库试剂盒，参照PT4085-1说明书中的方法进行。橡胶树胶乳材料采集于中国热带农业科学院儋州院区试验场种植的成年割胶树热研7-33-97。首先利用天根生化科技（北京）有限公司的植物RNA提取试剂盒提取胶乳样品的总RNA后，取2 μL RNA样品，1 μL CDSIII （Oligo-dT）引物和1 μL水置于72 ℃反应2 min，然后置于冰上冷却，再利用SMART MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA第一链（反应体系为2 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL DTT，1 μL dNTPs ，1 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，置于42 ℃反应10 min后，接着添加1 μL SMART III-modified oligo置于42 ℃反应60 min，75 ℃保温2 min以终止第一链反应，冷却至室温后，加入1 μL RNase H置于37 ℃反应20 min。取2 μL First-stand SMART cDNA，70 μL ddH2O，10 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 3′PCR primer，2 μL 5′PCR primer，10 μL Melting Solution， 2 μL 50× Advantage 2 polymerase Mix共100 μL体系按照95 ℃ 30 s，20个循环（95 ℃ 10 s，68 ℃ for 6 min，其中68 ℃延伸时间为每个循环增加5 s），68 ℃ for 5 min后得到双链cDNA，经过Clontech公司的Clontech CHROMA SPINTM TE-400 COLUMN柱子纯化后溶于20 μL ddH2O中待用。然后将20 μL ds cDNA和6 μL 线性化的pGADT7-Rec载体利用LiAc转化法转入Y187酵母菌株中，涂布于SD/-Leu平板上，于30 ℃培养3～4 d，用5 mL Freezing Medium充分重选每个SD/-Leu平板上的酵母菌，汇集所有酵母菌液后，利用Clontech公司的酵母质粒提取试剂盒提取质粒备用。 1.2.5 文库筛选和酵母双杂交阳性克隆的鉴定
在分析评价诱饵质粒的自激活作用后，将诱饵载体pGBKT7-HblMYC3用于酵母双杂交文库筛选实验，方法参照MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System（PT4084-1）。将在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上长出来的菌斑重新挑至新鲜的SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加显色剂）平板上继续筛选，能连续生长的菌即为候选的阳性克隆菌，提取质粒后转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂布氨苄抗性平板后得到阳性菌落，提取质粒后经载体测序引物T7和3′AD（Clontech公司）检测后，送至测序公司测序，测序结果在NCBI公共数据库中同源比对获取相应候选基因的注释信息。
2 结果与分析
2.1 重组pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体构建与验证
以橡胶树胶乳cDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增HblMYC3基因的1 450 bp大小的编码框（图1-A）。扩增片段经胶回收纯化后，与pEASY-Blunt载体连接，通过载体引物PCR筛选阳性克隆菌落，并检测质粒大小。用SfiⅠ和XmaⅠ双酶切含有目的片段的质粒，回收目的片段（图1-A）。将目的片段与pGBKT7载体连接，构建pGBKT7-HblMYC3重组载体，经pGBKT7载体通用引物PCR检测和双酶切验证，插入片段大小与预期大小一致（图1-B）。进一步通过测序验证插入目的片段的序列及其翻译产生的蛋白序列的正确性。把pGBKT7-HblMYC3诱饵表达载体转入Y2HGold酵母菌中，经pGBKT7载体通用引物PCR筛选阳性菌落（图1-C）。
2.2 pGBKT7-HblMYC3重组质粒自激活检测
含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌和含有空载体的酵母菌在SD/-Trp筛选平板上均能生长，而且除了阳性对照菌能够在SD/-Trp-His-Ade筛选平板上很好的生长外，阴性对照菌不能在该筛选平板上良好生长，含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌生长较慢，菌落很小，这些结果表明pGBKT7-HblMYC3重组质粒自激活很弱，通过控制筛选条件可用于后续文库筛选（图2）。通过在SD/-Trp-His-Ade筛选平板上添加1mmol/L 3-AT生长抑制剂能够抑制pGBKT7-HblMYC3的酵母菌的背景生长，而阳性对照菌仍能正常良好生长（图2）。由此确定后续HblMYC3蛋白的酵母文库筛选的条件：SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT （1 mmol/L）。
2.3 阳性克隆的筛选和测序分析
经过在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上筛选得到了7个酵母菌株。这些候选的酵母菌株接种到SD/-Trp-Leu和添加显色剂的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上的生长情况见图3。这些阳性酵母菌都能不同程度地在筛选平板上生长，同时其生长情况和显色程度的差异可能体现了候选蛋白与靶蛋白HblMYC3之间不同强度的结合能力。阳性酵母菌中的质粒经过测序后，在NCBI数据库中同源比对分析，结果表明候选蛋白分别为DNAJ分子伴侣/蛋白、参与活性氧清除的glutaredoxin2蛋白、转录因子LMYC1和LMYC2、ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白酶体相关蛋白，含zinc finger A20 and AN1 domain的胁迫相关蛋白、参与细胞增殖和信号传导的28 ku热、酸稳定磷蛋白（表1）。
3 讨论与结论
橡胶树乳管是一种功能特化的组织，其主要功能是合成天然橡胶。天然橡胶主要在胶乳中的小橡胶粒子上合成[11]，而SRPP蛋白是小橡胶粒子中含量最丰富的蛋白[12]，参与了天然橡胶合成的调节。HblMYC3是从巴西橡胶树的乳管细胞中分离鉴定到的MYC类转录因子，其基因表达受割胶和茉莉酸上调。HblMYC3转录因子是SRPP基因表达的上游调控因子，它能直接结合SRPP基因的启动子，上调SRPP基因的表达[7]。因此推测HblMYC3基因是重要的参与橡胶生物合成调节的因子。本研究采用酵母双杂交方法初步筛选HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在进一步了解HblMYC3的功能。酵母双杂交技术是比较成熟和经典的筛选靶蛋白的互作蛋白的方法，已经成功应用于橡胶树分子生物学的研究中。例如，邓治等[13]和杨子平等[14]分别利用该方法筛选到胶乳中与转录因子HbMyb1蛋白、HbRZF蛋白的互作蛋白；曾日中等[15]利用该方法筛选到胶乳中REF蛋白的互作蛋白。本研究利用酵母双杂交技术筛选到HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧还蛋白2、含A20和 AN1 锌指结构域的胁迫相关蛋白5、28 ku热、酸稳定的磷蛋白以及25 ku泛素连接酶E2等7种蛋白，它们不同程度地与HblMYC3蛋白互作，推测HblMYC3可能与这些蛋白在胶乳中形成不同的复合体，参与不同的生物学过程。
DNAJ蛋白是重要的分子伴侣蛋白，对靶蛋白起保护作用，参与了植物对各种逆境胁迫的反应[16-17]。橡胶生产中通过割胶收集胶乳，而割胶对橡胶树而言是一种伤害胁迫。HblMYC3能够被割胶处理诱导表达，表明HblMYC3参与了对这一逆境胁迫的反应，而橡胶树DNAJ蛋白能够与HblMYC3蛋白互作，可能对保护HblMYC3蛋白有一定作用。
另外筛选到2个已经报道的橡胶树胶乳转录因子HblMYC1（或LMYC1）和HblMYC2（或LMYC2）。HblMYC1和HblMYC2基因与HblMYC3基因同属于MYC亚类转录因子成员[7]。它们能够被割胶胁迫和茉莉酸诱导表达[18]，但两者的表达模式相反。HblMYC1和HblMYC2基因不能够直接结合SRPP基因的上游启动子（1 103 bp）[7]。因此，HblMYC1或HblMYC2蛋白可能通过与HblMYC3蛋白形成异源二聚体转录因子复合体参与调控SRPP基因的表达。本实验室曾利用点对点酵母双杂交证明HblMYC3蛋白与HblMYC1蛋白的相互作用[9]。 Glutaredoxin为谷氧还蛋白，参与活性氧的清除，其作用与硫氧还蛋白（Thioredoxin）类似[19]。HblMYC3与glutaredoxin蛋白之间的相互作用可能暗示HblMYC3蛋白参与了胶乳中的抗氧化过程。同时HblMYC3与ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白之间的相互作用表明HblMYC3蛋白同样经由泛素连接酶E2介导的泛素化降解过程。
基于这些互作蛋白的功能，推测HblMYC1或HblMYC2通过与HblMYC3形成二聚体调控小橡胶粒子膜蛋白基因表达，其他蛋白参与胁迫条件下维持该二聚体的稳定性和胁迫反应后降解该蛋白。
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