【摘 要】
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为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究.利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,
【机 构】
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黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江 大庆 163319军事医学科学院军事兽医研究所,吉林 长春 130122;东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;军事医学科学院军事兽医研究
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为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究.利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用.结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体.研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考.
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