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【摘要】 目的：探讨胃癌术后复发的独立因素和ABCC4、p53表达水平评估胃癌化疗后复发的应用价值。方法：收集100例胃癌患者的临床资料，采用Logistic回归分析发现胃癌术后复发的独立因素，术后病理标本采用免疫组化法检测胃癌组织中CEA、p53、ABCC4表达水平，分析其与胃癌化疗后复发的关系。结果：Logistic回归分析显示：化疗、淋巴转移是影响胃癌术后复发的独立因素，差异有统计学意义（P<0.05），T分期、分化程度、CEA、ABCC4、p53表达水平无显著相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。CEA低表达化疗组复发率为18.9%，未化疗组复发率为32.1%，差异无统计学意义（P>0.05）；CEA高表达化疗组复发率为8.7%，未化疗组复发率为41.7%，差异无统计学意义（P>0.05）。p53低表达化疗组复发率为12.2%，未化疗组复发率为32.4%，差异有统计学意义（P<0.05）；p53高表达化疗组复发率为27.3%，未化疗组复发率为50.0%，差异无统计学意义（P>0.05）。ABCC4低表达化疗组复发率为15.7%，未化疗组复发率为36.7%，差异有统计学意义（P<0.05），ABCC4高表达化疗组复发率为11.1%，未化疗组复发率为30.0%，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：化疗、淋巴转移是影响胃癌术后复发的独立因素，联合检测ABCC4、P53可作为胃癌术后化疗敏感性预测的指标。
【关键词】 胃癌； 复发； 临床病理分期； 化疗； CEA； P53； ABCC4
胃癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是一个重要的公共卫生问题[1]。在西方国家，其发病率明显下降，但在亚洲，如日本、韩国和中国，其发病率仍高居不下[2]。手术是胃癌常用的治疗方法，但其切除率较低，复发转移率较高，胃癌术后可以采用化疗提高疗效。尽早评估化疗的疗效以及避免无效治疗至关重要，然而影像学是通过化疗后检测肿瘤的直径来评估化疗效果[3]，因此找到一种有效的检测方法用来评估化疗疗效迫在眉急。笔者前期研究发现，ABCC4（ATP-binding cassette，subfamily C member 4）在胃癌组织中高表达，与癌旁的正常组织差异具有统计学意义（P<0.05）。在ABCC4与肿瘤的相关研究中，基本集中在其与耐药的关系，尚未见ABCC4与胃癌化疗后复发的关系的相关报道。抑癌基因P53在胃癌中较常见。本课题初步探讨了胃癌术后复发的独立因素和ABCC4、P53表达水平与胃癌术后化疗复发的关系，以期作为化疗敏感性预测的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2010年1月-2013年1月在本院收治的胃癌患者100例，其中男76例，女24例，年龄29～80岁，平均（61.23±10.4）岁。病例纳入标准：符合美国癌症联合委员会（AJCC）（第7版）进展期胃癌诊断标准。排除标准：术前化疗、术前放疗、术前行胸片、腹部CT检查，肺部、肝脏、腹主动脉旁淋巴结等远处转移者。化疗组患者均采用FOLFOX方案化疗，3周为1个周期，完成4个周期后判定疗效。术后随访：主要以术后回院复查方式进行随访。胃癌根治术后前两年每3个月复查1次，两年之后每6个月复查1次。复查内容包括体格检查、血常规、肿瘤标志物和胸片，必要时行上消化道钡餐、腹部CT、胃镜检查和穿刺活检等。胃癌复发是本研究的主要观察终点，随访到2013年7月，复发生存时间定义为手术至出现肿瘤复发的时间，随访期间死亡20例。
1.2 试剂与方法
1.2.1 标本 所有组织蜡块均由本院病理科包埋，每例胃癌组织病理切片均由两位专家确诊。胃黏膜组织取自上述100例标本距癌组织3 cm以上的癌旁胃黏膜组织。
1.2.2 试剂 ABCC4单克隆抗体购自美国SantaCruz公司，CEA单克隆抗体购自福州迈新生物开发公司，p53购自福州迈新生物开发公司。
1.2.3 方法 采用免疫组织化SP法。将标本连续切片，常规脱蜡、水化，经3%的H2O2消化内源性过氧化物酶，高压抗原修复，一抗（如鼠抗人ABCC4单克隆抗体）、二抗（生物素标记）作用后，用DAB显色，苏木素复染后脱水透明，常规中性树胶封固后显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定 ABCC4阳性表达定位于细胞膜或浆，呈现棕黄色或棕褐色颗粒，取5个高倍视野，每个视野分别计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率。染色结果根据阳性细胞占比率分为4个等级，<5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分，51%～75%为3分；≥76%为4分。按着色程度计分：未着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分，棕褐色为3分，两种记分所得分值之和：0～1分为阴性（0）；2分为弱阳性（+）；3～4分为中度阳性（++）；≥5分为强阳性（+++）。CEA定位于胞浆，p53定位于胞核，呈现棕黄色或棕褐色颗粒，取5个高倍视野，每个视野分别计数100个细胞，以切片中阳性数大于25%为阳性。
1.4 统计学处理 所有数据均经SPSS 17.0软件进行统计分析。对胃癌术后复发的相关因素采用单因素Logistic回归分析和多因素Logistic回归分析，计量资料采用（x±s），计数资料采用 字2检验，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌术后复发的因素 表1中可见，胃癌术后复发与T分期、淋巴转移分期、是否化疗具有相关性，差异有统计学意义（P<0.05）。与分化程度、ABCC4表达水平、CEA表达水平、p53表达水平无相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。表2中可见，淋巴转移分期、是否化疗是影响胃癌术后是否复发的独立因素，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 化疗后复发与ABCC4、CEA、p53的关系 表3中可见，CEA低表达化疗组复发率为18.9%，未化疗组复发率为32.1%，差异无统计学意义；CEA高表达化疗组复发率为8.7%，未化疗组复发率为41.7%，差异无统计学意义。p53低表达化疗组复发率为12.2%，未化疗组复发率为32.4%，差异具有统计学意义；p53高表达化疗组复发率为27.3%，未化疗组复发率为50.0%，差异无统计学意义。ABCC4低表达化疗组复发率为15.7%，未化疗组复发率为36.7%，差异具有统计学意义；ABCC4高表达化疗组复发率为11.1%，未化疗组复发率为30.0%，差异无统计学意义。 3 讨论
胃癌为高发生率的肿瘤，死亡率在肿瘤性疾病中排第二位[4-5]。胃癌复发转移形式分为区域局部复发转移、腹膜复发转移、血源性复发转移及远处淋巴结复发转移4种[6]。Otsuji等[7]及吴亮亮等[6]多个研究发现胃癌术后复发转移，与原发肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移和肿瘤大小等相关，与肿瘤分化程度无关。本研究发现淋巴转移是影响胃癌术后复发的独立因素，胃癌复发也与T分期有一定关系。这可能是研究对象存在选择偏倚和研究方法不完全一样所致，因此，仍然需要多中心、大样本的研究进一步探讨。本研究发现胃癌术后复发与分化程度、CEA、ABCC4、p53表达水平无相关性。
肿瘤标志物是反映肿瘤自身存在的生物活性物质，CEA是胃癌的重要标志物，在胃癌诊断价值方面的研究较多，但关于其对胃癌患者术后复发影响的报道却很少，而笔者主要探讨其与肿瘤复发间的关系。有关CEA对胃癌预后的研究结果不一致，张燕华等[8]认为，CEA升高是胃癌患者预后不良的因素，而朱昱冰等[9]关于胃癌生存期的研究与本研究CEA对胃癌复发的影响相似，朱昱冰认为CEA表达水平的高低患者和阴性患者之间的复发情况差异无统计学意义，本研究发现CEA表达水平高低与胃癌术后化疗复发无相关性。
抑癌基因p53的突变在人类肿瘤中较常见的基因突变，如在胃癌中[10]。洪成雨等[11]证实p-p53高表达是进展期胃癌化疗的不良预后因素。而崔海滨等[12]发现p53在进展期胃癌新辅助化疗中具有重要的预测价值。本研究发现p53低表达的化疗组复发率为比未化疗组复发率低，因此，推测p53的表达水平可以作为胃癌术后化疗敏感性的指标，预测化疗的效果。其机制可能为p53基因能加强多药耐药（MDR）基因表达，并通过抗细胞凋亡使肿瘤细胞产生耐药性[12]。
ABCC4是Cole等在研究小细胞肺癌过程中发现的耐药基因家族成员。ABCC4广泛分布于脑、肾脏、肝脏、红细胞、血小板、肾上腺、胰腺和肠等组织中[13]。近年研究发现ABCC4可能参与肿瘤对化疗药物的抵抗。Hagmann等[14]比较了胰腺癌Capan-1细胞的5-氟尿嘧啶（5-flu-orouracil，5-FU）敏感和耐药株，最后发现5-FU耐药细胞中ABCC4表达升高。本研究发现ABCC4低表达的化疗组复发率为比未化疗组复发率低，考虑ABCC4可能与胃癌术后FOLFOX化疗方案中奥沙利帛、5-FU的耐药性有关。其机制可能ABCC4可作用于DNA的拓扑异构酶，抑制DNA 复制，同时ABCC4可通过促进药物向胞外转运，降低药物在细胞中的累积水平，而使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性[14]。
对于胃癌患者，化疗是其临床治疗的重要手段，但化疗有效率为30%～50%，化疗药物价格昂贵、副作用大，因此胃癌患者需要有效的检测方法来评估患者化疗药物的敏感性。本研究结果表明，联合检测ABCC4与p53可作为胃癌术后化疗敏感性的预测指标，临床上据此可对胃癌患者术后化疗进行筛选。
参考文献
[1] Siegel R， Naishadham D， Jemal A.Cancer statistics，2013[J]. CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.
[2] Kanat O， O’Neil B H. Metastatic gastric cancer treatment： a little slow but worthy progress[J].Med Onco，2013，30（1）：464.
[3] Afaq A， Akin O. Imaging assessment of tumor response： past， present and future[J].Future Oncol，2011，7（5）：669-677.
[4] Smith R A， Cokkinides V， Brawley O W. Cancer screening in the United States， 2012： A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening[J]. CA Cancer J Clin，2012，62（3）：118-128.
[5] Ferlay J， Shin H R，Bray F，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008： GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer，2010，127（12）：2893-2917.
[6]吴亮亮，梁寒，王晓娜，等.胃癌根治术后复发转移临床相关因素分析[J].中华消化杂志，2011，31（1）：17-20.
[7] Otsuji E，Kobayashi S，Okamoto K，et al.Is timing of death from tumor recurrence predictable after curative resection for gastric cancer[J].World J Surg，2001，25（11）：1373-1376
[8]张燕华，李雁，陈创，等.多种肿瘤标志物与胃癌进展及预后的关系[J].武汉大学学报，2009，30（4）：455-458.
[9]朱昱冰，葛少华，张连海，等.肿瘤标志物在胃癌患者中的诊断及预后价值[J].中华胃肠外科杂志，2012，15（2）：161-164.
[10] Wang L，Zhang X Y，Xu L，et al.Expression and significance of p53 and mdm2 in atypical intestinal metaplasia and gastric carcinoma[J].Oncol Lett，2011，2（4）：707–712.
[11]洪成雨，郑建，李婷.p-ATM，p-p53，p-p21因子与进展期胃癌化疗疗效及预后的关系[J].实用癌症杂志，2014，29（1）：13-16.
[12]崔海滨，葛怀娥，白希永，等.EGFR、HER2、Ki-67、P53在进展期胃癌新辅助化疗疗效预测中的应用[J].中国医药导报，2014，11（2）：35-38.
[13] Ravna A W，Sager G.Molecular modeling studies of ABC transporters involved in multidrug resistance[J].Mini Rev Med Chem，2009，9（2）：186-193.
[14] Hagmann W，Jesnowski R，Faissner R，et a1.ATP-binding cassette C transporters in human pancreatic car-cinoma cell lines.Upregulation in 5-fluorouracil-resist-ant cells[J].Pancreatology，2009，9（1-2）：136-144.
[15]张广钰，田小林.ABCC4基因与胃癌关系的研究进展[J].华夏医学，2012，25（6）：920-923.
（收稿日期：2014-07-11） （本文编辑：王宇）
【关键词】 胃癌； 复发； 临床病理分期； 化疗； CEA； P53； ABCC4
胃癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是一个重要的公共卫生问题[1]。在西方国家，其发病率明显下降，但在亚洲，如日本、韩国和中国，其发病率仍高居不下[2]。手术是胃癌常用的治疗方法，但其切除率较低，复发转移率较高，胃癌术后可以采用化疗提高疗效。尽早评估化疗的疗效以及避免无效治疗至关重要，然而影像学是通过化疗后检测肿瘤的直径来评估化疗效果[3]，因此找到一种有效的检测方法用来评估化疗疗效迫在眉急。笔者前期研究发现，ABCC4（ATP-binding cassette，subfamily C member 4）在胃癌组织中高表达，与癌旁的正常组织差异具有统计学意义（P<0.05）。在ABCC4与肿瘤的相关研究中，基本集中在其与耐药的关系，尚未见ABCC4与胃癌化疗后复发的关系的相关报道。抑癌基因P53在胃癌中较常见。本课题初步探讨了胃癌术后复发的独立因素和ABCC4、P53表达水平与胃癌术后化疗复发的关系，以期作为化疗敏感性预测的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2010年1月-2013年1月在本院收治的胃癌患者100例，其中男76例，女24例，年龄29～80岁，平均（61.23±10.4）岁。病例纳入标准：符合美国癌症联合委员会（AJCC）（第7版）进展期胃癌诊断标准。排除标准：术前化疗、术前放疗、术前行胸片、腹部CT检查，肺部、肝脏、腹主动脉旁淋巴结等远处转移者。化疗组患者均采用FOLFOX方案化疗，3周为1个周期，完成4个周期后判定疗效。术后随访：主要以术后回院复查方式进行随访。胃癌根治术后前两年每3个月复查1次，两年之后每6个月复查1次。复查内容包括体格检查、血常规、肿瘤标志物和胸片，必要时行上消化道钡餐、腹部CT、胃镜检查和穿刺活检等。胃癌复发是本研究的主要观察终点，随访到2013年7月，复发生存时间定义为手术至出现肿瘤复发的时间，随访期间死亡20例。
1.2 试剂与方法
1.2.1 标本 所有组织蜡块均由本院病理科包埋，每例胃癌组织病理切片均由两位专家确诊。胃黏膜组织取自上述100例标本距癌组织3 cm以上的癌旁胃黏膜组织。
1.2.2 试剂 ABCC4单克隆抗体购自美国SantaCruz公司，CEA单克隆抗体购自福州迈新生物开发公司，p53购自福州迈新生物开发公司。
1.2.3 方法 采用免疫组织化SP法。将标本连续切片，常规脱蜡、水化，经3%的H2O2消化内源性过氧化物酶，高压抗原修复，一抗（如鼠抗人ABCC4单克隆抗体）、二抗（生物素标记）作用后，用DAB显色，苏木素复染后脱水透明，常规中性树胶封固后显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定 ABCC4阳性表达定位于细胞膜或浆，呈现棕黄色或棕褐色颗粒，取5个高倍视野，每个视野分别计数100个细胞，计算阳性细胞所占百分率。染色结果根据阳性细胞占比率分为4个等级，<5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分，51%～75%为3分；≥76%为4分。按着色程度计分：未着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分，棕褐色为3分，两种记分所得分值之和：0～1分为阴性（0）；2分为弱阳性（+）；3～4分为中度阳性（++）；≥5分为强阳性（+++）。CEA定位于胞浆，p53定位于胞核，呈现棕黄色或棕褐色颗粒，取5个高倍视野，每个视野分别计数100个细胞，以切片中阳性数大于25%为阳性。
1.4 统计学处理 所有数据均经SPSS 17.0软件进行统计分析。对胃癌术后复发的相关因素采用单因素Logistic回归分析和多因素Logistic回归分析，计量资料采用（x±s），计数资料采用 字2检验，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌术后复发的因素 表1中可见，胃癌术后复发与T分期、淋巴转移分期、是否化疗具有相关性，差异有统计学意义（P<0.05）。与分化程度、ABCC4表达水平、CEA表达水平、p53表达水平无相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。表2中可见，淋巴转移分期、是否化疗是影响胃癌术后是否复发的独立因素，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 化疗后复发与ABCC4、CEA、p53的关系 表3中可见，CEA低表达化疗组复发率为18.9%，未化疗组复发率为32.1%，差异无统计学意义；CEA高表达化疗组复发率为8.7%，未化疗组复发率为41.7%，差异无统计学意义。p53低表达化疗组复发率为12.2%，未化疗组复发率为32.4%，差异具有统计学意义；p53高表达化疗组复发率为27.3%，未化疗组复发率为50.0%，差异无统计学意义。ABCC4低表达化疗组复发率为15.7%，未化疗组复发率为36.7%，差异具有统计学意义；ABCC4高表达化疗组复发率为11.1%，未化疗组复发率为30.0%，差异无统计学意义。 3 讨论
胃癌为高发生率的肿瘤，死亡率在肿瘤性疾病中排第二位[4-5]。胃癌复发转移形式分为区域局部复发转移、腹膜复发转移、血源性复发转移及远处淋巴结复发转移4种[6]。Otsuji等[7]及吴亮亮等[6]多个研究发现胃癌术后复发转移，与原发肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移和肿瘤大小等相关，与肿瘤分化程度无关。本研究发现淋巴转移是影响胃癌术后复发的独立因素，胃癌复发也与T分期有一定关系。这可能是研究对象存在选择偏倚和研究方法不完全一样所致，因此，仍然需要多中心、大样本的研究进一步探讨。本研究发现胃癌术后复发与分化程度、CEA、ABCC4、p53表达水平无相关性。
肿瘤标志物是反映肿瘤自身存在的生物活性物质，CEA是胃癌的重要标志物，在胃癌诊断价值方面的研究较多，但关于其对胃癌患者术后复发影响的报道却很少，而笔者主要探讨其与肿瘤复发间的关系。有关CEA对胃癌预后的研究结果不一致，张燕华等[8]认为，CEA升高是胃癌患者预后不良的因素，而朱昱冰等[9]关于胃癌生存期的研究与本研究CEA对胃癌复发的影响相似，朱昱冰认为CEA表达水平的高低患者和阴性患者之间的复发情况差异无统计学意义，本研究发现CEA表达水平高低与胃癌术后化疗复发无相关性。
抑癌基因p53的突变在人类肿瘤中较常见的基因突变，如在胃癌中[10]。洪成雨等[11]证实p-p53高表达是进展期胃癌化疗的不良预后因素。而崔海滨等[12]发现p53在进展期胃癌新辅助化疗中具有重要的预测价值。本研究发现p53低表达的化疗组复发率为比未化疗组复发率低，因此，推测p53的表达水平可以作为胃癌术后化疗敏感性的指标，预测化疗的效果。其机制可能为p53基因能加强多药耐药（MDR）基因表达，并通过抗细胞凋亡使肿瘤细胞产生耐药性[12]。
ABCC4是Cole等在研究小细胞肺癌过程中发现的耐药基因家族成员。ABCC4广泛分布于脑、肾脏、肝脏、红细胞、血小板、肾上腺、胰腺和肠等组织中[13]。近年研究发现ABCC4可能参与肿瘤对化疗药物的抵抗。Hagmann等[14]比较了胰腺癌Capan-1细胞的5-氟尿嘧啶（5-flu-orouracil，5-FU）敏感和耐药株，最后发现5-FU耐药细胞中ABCC4表达升高。本研究发现ABCC4低表达的化疗组复发率为比未化疗组复发率低，考虑ABCC4可能与胃癌术后FOLFOX化疗方案中奥沙利帛、5-FU的耐药性有关。其机制可能ABCC4可作用于DNA的拓扑异构酶，抑制DNA 复制，同时ABCC4可通过促进药物向胞外转运，降低药物在细胞中的累积水平，而使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性[14]。
对于胃癌患者，化疗是其临床治疗的重要手段，但化疗有效率为30%～50%，化疗药物价格昂贵、副作用大，因此胃癌患者需要有效的检测方法来评估患者化疗药物的敏感性。本研究结果表明，联合检测ABCC4与p53可作为胃癌术后化疗敏感性的预测指标，临床上据此可对胃癌患者术后化疗进行筛选。
参考文献
[1] Siegel R， Naishadham D， Jemal A.Cancer statistics，2013[J]. CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.
[2] Kanat O， O’Neil B H. Metastatic gastric cancer treatment： a little slow but worthy progress[J].Med Onco，2013，30（1）：464.
[3] Afaq A， Akin O. Imaging assessment of tumor response： past， present and future[J].Future Oncol，2011，7（5）：669-677.
[4] Smith R A， Cokkinides V， Brawley O W. Cancer screening in the United States， 2012： A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening[J]. CA Cancer J Clin，2012，62（3）：118-128.
[5] Ferlay J， Shin H R，Bray F，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008： GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer，2010，127（12）：2893-2917.
[6]吴亮亮，梁寒，王晓娜，等.胃癌根治术后复发转移临床相关因素分析[J].中华消化杂志，2011，31（1）：17-20.
[7] Otsuji E，Kobayashi S，Okamoto K，et al.Is timing of death from tumor recurrence predictable after curative resection for gastric cancer[J].World J Surg，2001，25（11）：1373-1376
[8]张燕华，李雁，陈创，等.多种肿瘤标志物与胃癌进展及预后的关系[J].武汉大学学报，2009，30（4）：455-458.
[9]朱昱冰，葛少华，张连海，等.肿瘤标志物在胃癌患者中的诊断及预后价值[J].中华胃肠外科杂志，2012，15（2）：161-164.
[10] Wang L，Zhang X Y，Xu L，et al.Expression and significance of p53 and mdm2 in atypical intestinal metaplasia and gastric carcinoma[J].Oncol Lett，2011，2（4）：707–712.
[11]洪成雨，郑建，李婷.p-ATM，p-p53，p-p21因子与进展期胃癌化疗疗效及预后的关系[J].实用癌症杂志，2014，29（1）：13-16.
[12]崔海滨，葛怀娥，白希永，等.EGFR、HER2、Ki-67、P53在进展期胃癌新辅助化疗疗效预测中的应用[J].中国医药导报，2014，11（2）：35-38.
[13] Ravna A W，Sager G.Molecular modeling studies of ABC transporters involved in multidrug resistance[J].Mini Rev Med Chem，2009，9（2）：186-193.
[14] Hagmann W，Jesnowski R，Faissner R，et a1.ATP-binding cassette C transporters in human pancreatic car-cinoma cell lines.Upregulation in 5-fluorouracil-resist-ant cells[J].Pancreatology，2009，9（1-2）：136-144.
[15]张广钰，田小林.ABCC4基因与胃癌关系的研究进展[J].华夏医学，2012，25（6）：920-923.
（收稿日期：2014-07-11） （本文编辑：王宇）