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【摘要】 目的：通过检测非综合征性唇腭裂（NSCL/P）患者与正常人尿液中代谢物的变化，探讨基于核磁共振（NMR）的代谢组学在此症的临床应用中的可行性。方法：分别收集12个NSCL/P患者和12个正常人对照组的尿液样品。采用NMR分析NSCL/P患者尿液代谢特征，测定1 H-NMR图谱，进而用主成分分析法（PCA）处理NMR数据，研究NSCL/P组和正常对照组尿液中的代谢物差异，获得NSCL/P患者的特异性代谢标志物。结果：NSCL/P组和正常对照组间的尿液代谢产物存在明显差别。结论：采用基于NMR的代谢组学技术能较好地反映NSCL/P患者尿液的代谢变化，获得相应的特征代谢物，在未来的临床应用中具有广阔的前景。
【关键词】 非综合征性唇腭裂； 基于核磁共振的代谢组学； 主成分分析
唇腭裂是一种常见的口腔颌面部先天性发育畸形，我国是唇腭裂高发国家[1-2]。有研究表明近年来非综合征性唇腭裂总体发病率在我国呈上升趋势[3]。其影响因素不是单一的，患儿父母的家族遗传病史、饮酒、吸烟等，母孕早期感染、使用药物等都有可能造成发病[4-5]。
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的新学科，它是通过观察生物体系受生理病理刺激前后代谢产物图谱的动态变化，来研究生命体系代谢网络的一种技术[6-7]。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的不同应答，也可以区分同种不同个体之间的表型差异[8]。利用NMR对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测，可得到相应的生物体代谢物信息，研究这些组分的NMR图谱，可以了解生物体代谢规律[9]。本文旨在运用代谢组学技术研究比较先天性唇腭裂患者和正常人的尿液代谢情况，找出两者间的差异代谢物，从而可能为未来唇腭裂患者的早期诊断提供潜在的检测代谢物。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机采集2013年7月-2014年7月在本院诊断为非综合征性唇腭裂患者的尿液12例，其中女8例，男4例，年龄5～20岁，平均（9±4.2）岁。同时随机选择2013年在本院健康体检科查体的健康人的尿液12例作为对照组，女7例，男5例，年龄12～20岁，平均（15.0±4.1）岁。
1.2 实验仪器 本实验主要仪器有：Bruker Avance DRX 600核磁共振仪（Bruker公司，德国）；XYJ80-2低速离心机（江苏金坛实验仪器有限公司）；MR1812高速离心机（jouan公司，法国）。
1.3 试验方法
1.3.1 样本的采集 研究对象晨起第一次尿液的中段尿，后做好标记保存于-80 ℃冰箱中。
1.3.2 NMR数据的采集
1.3.2.1 预处理样本 将冻干处理过的样本在室温下解冻，向编号后的Ep管中分别依次加入600 ?L样本液及300 ?L重水，快速涡旋混匀器上震荡混匀后，静置10 min，在4 ℃下以14000 r/min的转速离心5 min，取其上清液500 ?L加入直径为5 mm核磁共振管中，待NMR分析。
1.3.2.2 获取1H-NMR核磁共振氢谱图 获取不同实验组1H-NMR核磁共振氢谱图，使用MestReNova软件（V7.0）对谱图进行了傅立叶变换，相位调整，基线校正，及定标等处理。
1.3.2.3 差异代谢物的筛选及鉴定 通过分析各代谢物相应的系数，在相关系数图中，将每一个变量的载荷值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢物。
1.4 统计学处理 使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
3 讨论
先天性唇腭裂是人类最常见的先天性畸形之一[10]。唇腭裂畸形的发生与许多因素有关，是多种因素在同一或不同时期综合作用的结果。胚胎早期的外环境，包括病毒感染、化学药物、毒物、妊娠反应、营养不良、生育年龄、胎次、胎儿出生季节等都可能与之相关[11]。
本研究运用代谢组学对比分析了12例非综合征性唇腭裂患者和12例正常人的尿液样本，结果发现，两者在尿液代谢产物上的确存在差异，这些引起差异的特征性代谢产物可能是非综合征性唇腭裂的生物标记物，为以后对本病的研究及治疗提供一个思路[12]。
综合起来，笔者的研究表明，基于核磁共振的代谢组学技术可以较好地用于获得具有特征性的代谢物，是寻找非综合征性唇腭裂标志物的有效方法，在未来的临床应用中具有广阔的前景[13-15]。
参考文献
[1]张艳萍，李逸松，梁娜，等.1253例唇腭裂患者的临床资料分析[J].现代口腔医学杂志，2005，19（6）：642-643.
[2]代礼，缪蕾，周光萱，等.1996～2000年中国围产儿腭裂畸形发生状况分析[J].华西口腔医学杂志，2004，22（1）：35-37.
[3]赵瑞红.先天性唇腭裂的流行病学分析[J].中国实用医药，2011，6（16）：223-224.
[4] Beaty T H， Wang H， Hetmanski J B，et al.A case-control study of nonsyndromic oral clefts in Maryland[J].Ann Epidemiol，2001，11（6）：434-442.
[5]陈伟良，陈光晔，任材年，等.1524例先天性唇腭裂的临床分类和发病因素分析[J].口腔医学纵横，1996，12（1）：20-22. [6] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E.'Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.
[7] Fiehn O， Kopka J， Dormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics[J].Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.
[8]许国旺，路鑫，杨胜利.代谢组学研究进展[J].中国医学科学院学报，2007，29（6）：701-711.
[9]周京琳.采用基于～1H-NMR的代谢组学方法对口腔鳞癌患者血浆的初步分析[D].成都：四川大学，2006.
[10]于加友，孙健.唇腭裂发病相关因素研究进展[J].中国实用口腔科杂志，2008，1（3）：172-174.
[11]王丽君，黄金龙，万伟东.非综合征性唇腭裂的遗传因素和环境因素研究进展[J].国外医学：遗传学分册，2005，28（2）：102-104.
[12]杨为进，王亚韡，周群芳，等.人体尿液代谢组NMR分析[J].中国科学（B辑：化学），2008，38（1）：85-92.
[13] Brindle J T， Antti H， Holmes E，et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J].Nat Med，2002，8（12）：1439-1444.
[14] Keun H C， Ebbels T M， Antti H，et al. Analytical reproducibility in （1）H NMR-based metabonomic urinalysis[J]. Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1380-1386.
[15]蒋怀周，刘磊，危阳洋，等.基于NMR技术对Wilson病模型大鼠尿液的代谢组学研究[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（1）：70-73.
（收稿日期：2014-08-20） （本文编辑：王宇）
【关键词】 非综合征性唇腭裂； 基于核磁共振的代谢组学； 主成分分析
唇腭裂是一种常见的口腔颌面部先天性发育畸形，我国是唇腭裂高发国家[1-2]。有研究表明近年来非综合征性唇腭裂总体发病率在我国呈上升趋势[3]。其影响因素不是单一的，患儿父母的家族遗传病史、饮酒、吸烟等，母孕早期感染、使用药物等都有可能造成发病[4-5]。
代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的新学科，它是通过观察生物体系受生理病理刺激前后代谢产物图谱的动态变化，来研究生命体系代谢网络的一种技术[6-7]。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的不同应答，也可以区分同种不同个体之间的表型差异[8]。利用NMR对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测，可得到相应的生物体代谢物信息，研究这些组分的NMR图谱，可以了解生物体代谢规律[9]。本文旨在运用代谢组学技术研究比较先天性唇腭裂患者和正常人的尿液代谢情况，找出两者间的差异代谢物，从而可能为未来唇腭裂患者的早期诊断提供潜在的检测代谢物。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机采集2013年7月-2014年7月在本院诊断为非综合征性唇腭裂患者的尿液12例，其中女8例，男4例，年龄5～20岁，平均（9±4.2）岁。同时随机选择2013年在本院健康体检科查体的健康人的尿液12例作为对照组，女7例，男5例，年龄12～20岁，平均（15.0±4.1）岁。
1.2 实验仪器 本实验主要仪器有：Bruker Avance DRX 600核磁共振仪（Bruker公司，德国）；XYJ80-2低速离心机（江苏金坛实验仪器有限公司）；MR1812高速离心机（jouan公司，法国）。
1.3 试验方法
1.3.1 样本的采集 研究对象晨起第一次尿液的中段尿，后做好标记保存于-80 ℃冰箱中。
1.3.2 NMR数据的采集
1.3.2.1 预处理样本 将冻干处理过的样本在室温下解冻，向编号后的Ep管中分别依次加入600 ?L样本液及300 ?L重水，快速涡旋混匀器上震荡混匀后，静置10 min，在4 ℃下以14000 r/min的转速离心5 min，取其上清液500 ?L加入直径为5 mm核磁共振管中，待NMR分析。
1.3.2.2 获取1H-NMR核磁共振氢谱图 获取不同实验组1H-NMR核磁共振氢谱图，使用MestReNova软件（V7.0）对谱图进行了傅立叶变换，相位调整，基线校正，及定标等处理。
1.3.2.3 差异代谢物的筛选及鉴定 通过分析各代谢物相应的系数，在相关系数图中，将每一个变量的载荷值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢物。
1.4 统计学处理 使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
3 讨论
先天性唇腭裂是人类最常见的先天性畸形之一[10]。唇腭裂畸形的发生与许多因素有关，是多种因素在同一或不同时期综合作用的结果。胚胎早期的外环境，包括病毒感染、化学药物、毒物、妊娠反应、营养不良、生育年龄、胎次、胎儿出生季节等都可能与之相关[11]。
本研究运用代谢组学对比分析了12例非综合征性唇腭裂患者和12例正常人的尿液样本，结果发现，两者在尿液代谢产物上的确存在差异，这些引起差异的特征性代谢产物可能是非综合征性唇腭裂的生物标记物，为以后对本病的研究及治疗提供一个思路[12]。
综合起来，笔者的研究表明，基于核磁共振的代谢组学技术可以较好地用于获得具有特征性的代谢物，是寻找非综合征性唇腭裂标志物的有效方法，在未来的临床应用中具有广阔的前景[13-15]。
参考文献
[1]张艳萍，李逸松，梁娜，等.1253例唇腭裂患者的临床资料分析[J].现代口腔医学杂志，2005，19（6）：642-643.
[2]代礼，缪蕾，周光萱，等.1996～2000年中国围产儿腭裂畸形发生状况分析[J].华西口腔医学杂志，2004，22（1）：35-37.
[3]赵瑞红.先天性唇腭裂的流行病学分析[J].中国实用医药，2011，6（16）：223-224.
[4] Beaty T H， Wang H， Hetmanski J B，et al.A case-control study of nonsyndromic oral clefts in Maryland[J].Ann Epidemiol，2001，11（6）：434-442.
[5]陈伟良，陈光晔，任材年，等.1524例先天性唇腭裂的临床分类和发病因素分析[J].口腔医学纵横，1996，12（1）：20-22. [6] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E.'Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.
[7] Fiehn O， Kopka J， Dormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics[J].Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.
[8]许国旺，路鑫，杨胜利.代谢组学研究进展[J].中国医学科学院学报，2007，29（6）：701-711.
[9]周京琳.采用基于～1H-NMR的代谢组学方法对口腔鳞癌患者血浆的初步分析[D].成都：四川大学，2006.
[10]于加友，孙健.唇腭裂发病相关因素研究进展[J].中国实用口腔科杂志，2008，1（3）：172-174.
[11]王丽君，黄金龙，万伟东.非综合征性唇腭裂的遗传因素和环境因素研究进展[J].国外医学：遗传学分册，2005，28（2）：102-104.
[12]杨为进，王亚韡，周群芳，等.人体尿液代谢组NMR分析[J].中国科学（B辑：化学），2008，38（1）：85-92.
[13] Brindle J T， Antti H， Holmes E，et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J].Nat Med，2002，8（12）：1439-1444.
[14] Keun H C， Ebbels T M， Antti H，et al. Analytical reproducibility in （1）H NMR-based metabonomic urinalysis[J]. Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1380-1386.
[15]蒋怀周，刘磊，危阳洋，等.基于NMR技术对Wilson病模型大鼠尿液的代谢组学研究[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（1）：70-73.
（收稿日期：2014-08-20） （本文编辑：王宇）