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摘要 [目的] 探讨离子液体对斑马鱼急性毒性及保护酶活性的影响。[方法] 采用半静态水体染毒法测定1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的急性毒性，并对1，2-二甲基咪唑进行了安全性评价。同时测定了不同作用时间后斑马鱼体内不同组织（鳃、肝脏和肌肉）抗氧化酶的活性。[结果] 处理96 h后，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的LC50和 LC20值分别为120.815 和111.401 mg/L。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼鳃、肝脏和肌肉的CAT活性均呈现出先诱导后抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼的鳃、肝脏和肌肉的SOD活性均呈现出始终抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼鳃的POD活性的影响呈现出先诱导后抑制的趋势，肝脏POD活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈现出先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈现出抑制——诱导——抑制的趋势，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼肌肉POD活性呈现出始终抑制的趋势。[结论] 1，2-二甲基咪唑在斑马鱼体内积累显著影響斑马鱼体内CAT、SOD和POD的活性，降低斑马鱼体内自由基的清除能力，从而对其产生毒害作用。
关键词 1，2-二甲基咪唑；斑马鱼；急性毒性；保护酶
中图分类号 S965.819 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）03-00786-04
Abstract [Objective] The research aimed to acute toxicity of ionic liquid to Brachydanio rerio and its effects on the activity of protective enzymes.[Method] The acute toxicity of 1，2-dimethylimidazole to .rerio was determined by semi-static toxicity test.And the safety of 1，2-dimethylimidazole was assessed.Finally the activities of antioxidant enzymes in different tissues（gill，liver and muscle） of B.rerio after different treatment time were determined.[Result] After treatment 96 h，LC50 and LC20 of 1，2-dimethylimidazole to B.rerio were 120.815 and 111.401 mg/L respectively.CAT activity in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first inducement and then inhibition.SOD activity in in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.The effects of LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole on POD activity in the gill of B.rerio showed the trend of first induction and then inhibition.Its effects on POD activity in the liver of B.rerio treated by LC20 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first induction and then inhibition and that treated by LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition—induction—inhibition.POD activity in the muscle of B.rerio treated by 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.[Conclusion] The accumulation of 1，2-dimethylimidazole in B.rerio significantly affected the activities of CAT， SOD and POD in B.rerio and decreased scavenging capability of free radicals，which produced the toxic effects on B.rerio.
Key words 1，2-dimethylimidazole；Brachydanio rerio；Acute toxicity；Protective enzymes
斑马鱼（Brachydanio rerio），又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，原产于印度、孟加拉国[1]，早期是用来研究胚胎发育生物学和遗传学的实验动物模型[2]。由于斑马鱼拥有其他模式生物所不具备的优点，已被广泛应用于生物学各领域[3]。近年来，人们对斑马鱼的发育生物学[4-7]、遗传学[8-9]、肿瘤学[10]、毒理学[11-13]与环保[14-15]等方面都有研究。 离子液体（Ionic liquids）是在室温下为液体的离子化合物，近几年来已被开发成一种新型的绿色化学反应介质[16-17]。目前，国内外对于离子液体的研究主要集中在合成、物化性质等领域[18-19]。由于离子液体的研究还处于起步阶段，关于其毒性方面的报道还是很少[20-21]。因此，笔者选取离子液体1，2-二甲基咪唑（1，2-dimethylimidazole）对斑马鱼进行毒性试验，并对环境做出了安全性评价，首次探讨了1，2-二甲基咪唑对斑马鱼体内不同的组织（鳃、肝脏和肌肉）的CAT、SOD和POD抗氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 供试生物
斑马鱼，体长（2.3±0.2）㎝，体重（0.27±0.04）g，采购于哈尔滨市大发市场。稀释水为经曝气处理24 h以上的去氯自来水，pH为6.5～7.5。试验前，先将斑马鱼在稀释水中驯养7 d，自然死亡率<10%，温度在23～27 ℃，试验前1 d停止喂食，试验期间不喂食，试验用水与驯养稀释水保持一致，整个过程每天给予12 h光照。
1.2 主要试剂 1，2-二甲基咪唑，购于上海江莱生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、核黄素（VB2）均购于Amresco 公司；考马斯亮蓝 G-250、甲硫氨酸（Met）、硝基氮蓝四唑（NBT）、过氧化氢（Hydrogen peroxide） 、丙酮（Acetone）均购于益世达公司；愈创木酚（o-methoxy phenol）购于天津市光复精细化工研究所。
1.3 主要仪器 移液枪（上海大龙医疗设备有限公司）；玻璃匀浆器（黑龙江省益世达实验器材有限公司）；电子天平（美国奥豪斯）；电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），高速冷冻离心机（美国 Kendro 实验室产品公司）；紫外可见分光光度计（美国瓦里安中国有限公司）；光照培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；制冰机（日本三洋电机株式会社） 。
1.4 1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的急性毒性测定 依照国家环保局化学农药环境安全评价试验准则方法[22-23]，在试验24、48、72和96 h记录斑马鱼个体死亡数，同时统计出致死中浓度（LC50）和亚致死浓度（LC20）及95%置信区间。
1.4.1 预试验。
在正式试验前，先用1，2-二甲基咪唑对斑马鱼进行预试验，即在5 L玻璃缸中装入经曝气处理的稀释水0.5 L，并根据所设浓度分别加入一定体积的农药储备液，配制成5个浓度梯度，不设立平行组，用稀释水作为空白对照。各试验容器中投放健康且大小一致的5尾鱼，试验暴露周期为48 h，采用静态方式进行预试验，试验期间不换水，每日观察记录受试鱼死亡数，并及时捞出死亡的斑马鱼。试验温度为（25±2）℃，光暗周期为12 h∶12 h，试验期间不喂食。
1.4.2 正式试验。
根据1，2-二甲基咪唑在预试验时的结果，在正式试验时将1，2-二甲基咪唑按照几何级数设置浓度梯度。在5 L的玻璃缸中装入1 L的稀释水，并根据所设置的浓度分别加入一定体积的农药储备液，配置成5个浓度梯度。每个浓度设置3个平行，以稀释水作为空白对照。各容器中投放健康且大小一致的10尾鱼，试验暴露周期为96 h，采用半静态水体染毒法进行试验，试验期间每24 h更换一半染毒溶液，以确保离子液体暴露浓度恒定不变。试验温度为（25±2）℃，光暗周期为12 h∶12 h，试验期间不喂食。观察记录24、48、72和96 h鱼的死亡数与中毒症状，及时捞出死鱼。
1.5 用于测定酶活性的斑马鱼的处理
处理方法同上。根据1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的毒力测定结果，以96 h的LC50为基准，选取丙酮液（丙酮∶蒸馏水=2∶1，V/V） 配制成母液，然后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度 LC20，以相同溶剂作为对照组。将健康且大小一致的斑马鱼投放至5 L玻璃缸中，每个处理15尾，每个浓度2个重复，分别暴露1、7、14和21 d后取样，储存于-20 ℃冰箱中用于制备酶液。
1.6 酶液的制备 从每个处理组中均选取2条斑马鱼，将其鳃、肝脏、肌肉分别添加1 ml经预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，在4 ℃、8 000 r/min條件下离心15 min，上清液即为酶液。
1.7 酶活性的测定 ①蛋白质含量参照 Bradford（1976） 的考马斯亮蓝 G-250法进行测定。
②CAT活性的测定参照Cohen 等（1970） 方法，略有改进。取30% H2O2溶液0.5 ～0.6 ml，加水至50 ml，从中取出4 ml，加入26 ml 0.05 mol/L PBS缓冲液（pH 7.0），测定其在波长240 nm处的OD值。若OD值介于0.50 ～0.55，即作为过氧化氢酶的底物溶液。取3 ml配制的底物溶液，在25 ℃条件下加入粗酶液10 μl，立即用紫外分光光度计在波长240 nm处每隔1 min读数1次，每个处理重复3次。
③SOD活性的测定参照Beauchamp和Fridovich（1971）方法，略有改进。3 ml 反应液（含50 mmol/L pH 7.8的PBS缓冲液、13 mmol/L Met、0.1 mmol/L EDTA、75 μmol/L NBT），加入10 μl粗酶液，最后加入0.6 ml 0.5 mmol/L 核黄素，以不加酶液管作为最大光还原管，光照培养箱中温度 25 ℃，三级光照下（4 000 lx） 处理20 min 后，立即避光迅速测定OD560值，每个处理重复3次。
④POD活性的测定参照陈尚文（2001） 方法，略有改进。3 ml 反应体系中含100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0） 、30 mmol/L 愈创木酚、26 mmol/L H2O2和50 μl 酶液，反应5 min，在波长470 nm 处测定OD值。
1.8 数据处理
运用 POLO软件计算1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的致死中浓度（LC50）和亚致死浓度（LC20） 以及95%置信区间。采用 SPSS16.0 软件统计同一时间处理下不同浓度1，2-二甲基咪唑对酶活性影响，采用 Duncan方法进行显著性分析。
3 小结
1，2-二甲基咪唑对斑马鱼低毒，正常使用时对水生生物不会造成危害。
1，2-二甲基咪唑在对斑马鱼进行处理时，供试斑马鱼投入到5 L玻璃缸内初期均表现出不同程度的兴奋症状，随着处理时间的延长，处理组中有些斑马鱼身体侧翻，游行动作变得缓慢，反应迟钝，腹部变白，最后甚至出现死亡。随着1，2-二甲基咪唑作用时间的延长， LC50值均逐渐降低，表明随着处理时间的延长，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的毒性逐渐增加。
在正常情况下生物体内CAT、SOD和POD三者协调一致，处于一种动态平衡状态，使自由基维持在一个低水平，而经1，2-二甲基咪唑处理的斑马鱼，其体内的这种平衡受到了破坏，从而使斑马鱼体内组织产生了氧化损伤，最终对斑马鱼机体产生了毒害作用。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼的鳃、肝脏和肌肉的CAT活性均呈现出先诱导后抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼的鳃、肝脏和肌肉的SOD活性均呈现出始终抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼鳃POD活性的影响呈现出先诱导后抑制的趋势，对肝脏POD活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈现出先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈现出抑制——诱导——抑制的趋势，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼肌肉POD活性呈现出始终抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑对于斑马鱼体内的影响和作用机理是非常复杂的，仅限于对斑马鱼体内的抗氧化酶系统的变化和影响的研究是远远不够的，对1，2-二甲基咪唑还需要结合其他系统进行深入研究。
关键词 1，2-二甲基咪唑；斑马鱼；急性毒性；保护酶
中图分类号 S965.819 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）03-00786-04
Abstract [Objective] The research aimed to acute toxicity of ionic liquid to Brachydanio rerio and its effects on the activity of protective enzymes.[Method] The acute toxicity of 1，2-dimethylimidazole to .rerio was determined by semi-static toxicity test.And the safety of 1，2-dimethylimidazole was assessed.Finally the activities of antioxidant enzymes in different tissues（gill，liver and muscle） of B.rerio after different treatment time were determined.[Result] After treatment 96 h，LC50 and LC20 of 1，2-dimethylimidazole to B.rerio were 120.815 and 111.401 mg/L respectively.CAT activity in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first inducement and then inhibition.SOD activity in in the gill，liver and muscle of B.rerio treated by LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.The effects of LC20 and LC50 of 1，2-dimethylimidazole on POD activity in the gill of B.rerio showed the trend of first induction and then inhibition.Its effects on POD activity in the liver of B.rerio treated by LC20 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of first induction and then inhibition and that treated by LC50 of 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition—induction—inhibition.POD activity in the muscle of B.rerio treated by 1，2-dimethylimidazole showed the trend of inhibition.[Conclusion] The accumulation of 1，2-dimethylimidazole in B.rerio significantly affected the activities of CAT， SOD and POD in B.rerio and decreased scavenging capability of free radicals，which produced the toxic effects on B.rerio.
Key words 1，2-dimethylimidazole；Brachydanio rerio；Acute toxicity；Protective enzymes
斑马鱼（Brachydanio rerio），又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，原产于印度、孟加拉国[1]，早期是用来研究胚胎发育生物学和遗传学的实验动物模型[2]。由于斑马鱼拥有其他模式生物所不具备的优点，已被广泛应用于生物学各领域[3]。近年来，人们对斑马鱼的发育生物学[4-7]、遗传学[8-9]、肿瘤学[10]、毒理学[11-13]与环保[14-15]等方面都有研究。 离子液体（Ionic liquids）是在室温下为液体的离子化合物，近几年来已被开发成一种新型的绿色化学反应介质[16-17]。目前，国内外对于离子液体的研究主要集中在合成、物化性质等领域[18-19]。由于离子液体的研究还处于起步阶段，关于其毒性方面的报道还是很少[20-21]。因此，笔者选取离子液体1，2-二甲基咪唑（1，2-dimethylimidazole）对斑马鱼进行毒性试验，并对环境做出了安全性评价，首次探讨了1，2-二甲基咪唑对斑马鱼体内不同的组织（鳃、肝脏和肌肉）的CAT、SOD和POD抗氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 供试生物
斑马鱼，体长（2.3±0.2）㎝，体重（0.27±0.04）g，采购于哈尔滨市大发市场。稀释水为经曝气处理24 h以上的去氯自来水，pH为6.5～7.5。试验前，先将斑马鱼在稀释水中驯养7 d，自然死亡率<10%，温度在23～27 ℃，试验前1 d停止喂食，试验期间不喂食，试验用水与驯养稀释水保持一致，整个过程每天给予12 h光照。
1.2 主要试剂 1，2-二甲基咪唑，购于上海江莱生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、核黄素（VB2）均购于Amresco 公司；考马斯亮蓝 G-250、甲硫氨酸（Met）、硝基氮蓝四唑（NBT）、过氧化氢（Hydrogen peroxide） 、丙酮（Acetone）均购于益世达公司；愈创木酚（o-methoxy phenol）购于天津市光复精细化工研究所。
1.3 主要仪器 移液枪（上海大龙医疗设备有限公司）；玻璃匀浆器（黑龙江省益世达实验器材有限公司）；电子天平（美国奥豪斯）；电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），高速冷冻离心机（美国 Kendro 实验室产品公司）；紫外可见分光光度计（美国瓦里安中国有限公司）；光照培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；制冰机（日本三洋电机株式会社） 。
1.4 1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的急性毒性测定 依照国家环保局化学农药环境安全评价试验准则方法[22-23]，在试验24、48、72和96 h记录斑马鱼个体死亡数，同时统计出致死中浓度（LC50）和亚致死浓度（LC20）及95%置信区间。
1.4.1 预试验。
在正式试验前，先用1，2-二甲基咪唑对斑马鱼进行预试验，即在5 L玻璃缸中装入经曝气处理的稀释水0.5 L，并根据所设浓度分别加入一定体积的农药储备液，配制成5个浓度梯度，不设立平行组，用稀释水作为空白对照。各试验容器中投放健康且大小一致的5尾鱼，试验暴露周期为48 h，采用静态方式进行预试验，试验期间不换水，每日观察记录受试鱼死亡数，并及时捞出死亡的斑马鱼。试验温度为（25±2）℃，光暗周期为12 h∶12 h，试验期间不喂食。
1.4.2 正式试验。
根据1，2-二甲基咪唑在预试验时的结果，在正式试验时将1，2-二甲基咪唑按照几何级数设置浓度梯度。在5 L的玻璃缸中装入1 L的稀释水，并根据所设置的浓度分别加入一定体积的农药储备液，配置成5个浓度梯度。每个浓度设置3个平行，以稀释水作为空白对照。各容器中投放健康且大小一致的10尾鱼，试验暴露周期为96 h，采用半静态水体染毒法进行试验，试验期间每24 h更换一半染毒溶液，以确保离子液体暴露浓度恒定不变。试验温度为（25±2）℃，光暗周期为12 h∶12 h，试验期间不喂食。观察记录24、48、72和96 h鱼的死亡数与中毒症状，及时捞出死鱼。
1.5 用于测定酶活性的斑马鱼的处理
处理方法同上。根据1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的毒力测定结果，以96 h的LC50为基准，选取丙酮液（丙酮∶蒸馏水=2∶1，V/V） 配制成母液，然后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度 LC20，以相同溶剂作为对照组。将健康且大小一致的斑马鱼投放至5 L玻璃缸中，每个处理15尾，每个浓度2个重复，分别暴露1、7、14和21 d后取样，储存于-20 ℃冰箱中用于制备酶液。
1.6 酶液的制备 从每个处理组中均选取2条斑马鱼，将其鳃、肝脏、肌肉分别添加1 ml经预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，在4 ℃、8 000 r/min條件下离心15 min，上清液即为酶液。
1.7 酶活性的测定 ①蛋白质含量参照 Bradford（1976） 的考马斯亮蓝 G-250法进行测定。
②CAT活性的测定参照Cohen 等（1970） 方法，略有改进。取30% H2O2溶液0.5 ～0.6 ml，加水至50 ml，从中取出4 ml，加入26 ml 0.05 mol/L PBS缓冲液（pH 7.0），测定其在波长240 nm处的OD值。若OD值介于0.50 ～0.55，即作为过氧化氢酶的底物溶液。取3 ml配制的底物溶液，在25 ℃条件下加入粗酶液10 μl，立即用紫外分光光度计在波长240 nm处每隔1 min读数1次，每个处理重复3次。
③SOD活性的测定参照Beauchamp和Fridovich（1971）方法，略有改进。3 ml 反应液（含50 mmol/L pH 7.8的PBS缓冲液、13 mmol/L Met、0.1 mmol/L EDTA、75 μmol/L NBT），加入10 μl粗酶液，最后加入0.6 ml 0.5 mmol/L 核黄素，以不加酶液管作为最大光还原管，光照培养箱中温度 25 ℃，三级光照下（4 000 lx） 处理20 min 后，立即避光迅速测定OD560值，每个处理重复3次。
④POD活性的测定参照陈尚文（2001） 方法，略有改进。3 ml 反应体系中含100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0） 、30 mmol/L 愈创木酚、26 mmol/L H2O2和50 μl 酶液，反应5 min，在波长470 nm 处测定OD值。
1.8 数据处理
运用 POLO软件计算1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的致死中浓度（LC50）和亚致死浓度（LC20） 以及95%置信区间。采用 SPSS16.0 软件统计同一时间处理下不同浓度1，2-二甲基咪唑对酶活性影响，采用 Duncan方法进行显著性分析。
3 小结
1，2-二甲基咪唑对斑马鱼低毒，正常使用时对水生生物不会造成危害。
1，2-二甲基咪唑在对斑马鱼进行处理时，供试斑马鱼投入到5 L玻璃缸内初期均表现出不同程度的兴奋症状，随着处理时间的延长，处理组中有些斑马鱼身体侧翻，游行动作变得缓慢，反应迟钝，腹部变白，最后甚至出现死亡。随着1，2-二甲基咪唑作用时间的延长， LC50值均逐渐降低，表明随着处理时间的延长，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼的毒性逐渐增加。
在正常情况下生物体内CAT、SOD和POD三者协调一致，处于一种动态平衡状态，使自由基维持在一个低水平，而经1，2-二甲基咪唑处理的斑马鱼，其体内的这种平衡受到了破坏，从而使斑马鱼体内组织产生了氧化损伤，最终对斑马鱼机体产生了毒害作用。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼的鳃、肝脏和肌肉的CAT活性均呈现出先诱导后抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼的鳃、肝脏和肌肉的SOD活性均呈现出始终抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斑马鱼鳃POD活性的影响呈现出先诱导后抑制的趋势，对肝脏POD活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈现出先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈现出抑制——诱导——抑制的趋势，1，2-二甲基咪唑对斑马鱼肌肉POD活性呈现出始终抑制的趋势。1，2-二甲基咪唑对于斑马鱼体内的影响和作用机理是非常复杂的，仅限于对斑马鱼体内的抗氧化酶系统的变化和影响的研究是远远不够的，对1，2-二甲基咪唑还需要结合其他系统进行深入研究。