【摘 要】
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目的 构建pET30a-EgG1Y162原核表达质粒,对重组蛋白HIS-EgG1Y162进行诱导表达、纯化及活性鉴定.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA中克隆出EgG1Y162基因,构建pMD19-T-EgG1Y162
【机 构】
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新疆医科大学基础医学院免疫学教研室,新疆乌鲁木齐830011;新疆医科大学第一附属医院检验科
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目的 构建pET30a-EgG1Y162原核表达质粒,对重组蛋白HIS-EgG1Y162进行诱导表达、纯化及活性鉴定.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA中克隆出EgG1Y162基因,构建pMD19-T-EgG1Y162克隆载体.通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将EgG1Y162基因片段连接入原核表达载体pET30a中,构建pET30a-EgG1Y162重组质粒,经双酶切及PCR鉴定并测序.将测序正确的重组质粒转化入BL21(DE3)大肠埃希菌的感受态细胞中,利用IPTG诱导表达蛋白,诱导后的菌液经超声破碎,采用12％SDS-PAGE分析蛋白表达情况.使用His Trap纯化柱纯化蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 PCR扩增出的EgG1Y162基因,片段大小为360 bp,与预期相符.经双酶切及PCR鉴定并测序,成功构建出pET30a-EgG1Y162原核表达载体.重组质粒转化菌经IPTG诱导,HIS-EgG1Y162重组蛋白在菌液上清中的表达量高于沉淀,且在IPTG(0.2 mmol/L)在28℃诱导6 h时在上清中表达量较高.当咪唑浓度为20 mmol/L时重组蛋白的洗脱效果良好.Western blot显示纯化的重组蛋白HIS-EgG1Y162能被相应抗体识别.结论 成功构建了 pET30a-EgG1Y162重组质粒,并诱导纯化出具有反应原性的重组蛋白HIS-EgG1Y162,为细粒棘球蚴EgG1Y162疫苗的研发奠定了实验基础.
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