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摘要 本文测定了茶多酚处理对马铃薯干腐病菌硫色镰刀菌的抑制效果。结果表明，茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发影响不大；0.1%茶多酚处理对硫色镰刀菌的菌落直径与对照相比无显著性差异，0.5%、1.0%茶多酚处理硫色镰刀菌菌落直径较对照组分别降低了32.8%和51.4%；0.5%、1.0%茶多酚处理可完全抑制马铃薯接种硫色镰刀菌病斑直径的扩展；0.5%茶多酚处理对抑制硫色镰刀菌产毒能力最好。由此表明，茶多酚可通过直接抑菌抑制马铃薯的干腐病。
关键词 马铃薯；茶多酚；硫色镰刀菌
中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）12-0108-03
Abstract This study investigated the effects of tea-polyphenols at different concentrations against Fusarium sulphureum of dry rot pathogen in potato tubers.Results indicated that tea-polyphenols at different concentrations treatment had a little influence on the spore germination of F.sulphureum.The colony diameter had no significant differences between 0.1% tea-polyphenols treatment and the control.The colony diameter of F.sulphureum treated by 0.5% and 1.0% of the tea-polyphenols reduced by 32.8% and 51.4% respectively than that of control. 0.5% and 1.0% of tea-polyphenols treatment could completely inhibit the development of colony diameter inoculated with F.sulphureum.Tea-polyphenols could also effectively inhibit toxin-producing of F.sulphureum，the optimum treatment concentration was 0.5%. It is proposed that tea-polyphenols treatment could directly inhibit pathogen growth and decrease dry rot of potato tubers by induced resistance.
Key words potatoes；tea-polyphenols；F.sulphureum
干腐病是我國西北地区马铃薯块茎贮藏期的真菌性病害，其发生与多种镰刀菌有关，其中硫色镰刀菌是最重要的病原物，其产生的真菌毒素不仅引起人畜急性中毒，还可致癌、致畸、致突变等[1]。随着我国病虫害绿色防控技术的推行，干腐病防治由以化学杀菌剂为主转向了植物源农药筛选。
茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称，具有较强的抗氧化和抑菌作用，对土壤脲酶和土壤真菌[2]、黄曲霉[3]等有较强的抑制作用。目前的研究以茶多酚的药理、病理、毒理学以及茶多酚的保颜、保鲜及除臭作用为主，其中对细菌的作用研究较多，但关于茶多酚对硫色镰刀菌生长及产毒能力的影响尚未见报道。因此，本文研究茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发、菌落生长、损伤接种马铃薯块茎切片病斑直径以及产毒能力的影响，以期为干腐病的防治提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试马铃薯品种为陇薯3号，2016年10月采于甘肃省农业科学院渭源县会川实验基地；供试病原菌硫色镰刀菌，由甘肃省农业科学院植物保护所提供；茶多酚，由北京索莱宝生物科技有限公司生产；绿豆种子，购自华联连锁超市兰州安宁店。马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每1 L培养基含土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL，自然pH；琼脂，由北京康倍斯科技有限公司生产。
试验仪器有SW-CJ-2FD洁净工作台、LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅、DHP-9272B型恒温培养箱、TH2-312台式恒温振荡器。
1.2 试验方法
1.2.1 孢子悬浮液的配制。参照文献[4]，将带菌PDA平皿在26 ℃下培养7 d，取出后加入含0.05% Tween-80的无菌水约10 mL，用涂布器刮下平板上的病原菌孢子，然后转入50 mL三角瓶中，在VXH-3微型旋涡混合器上振荡15 s，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度（1 × 106孢子/mL）。
1.2.2 茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发的影响。参照文献[5]，用镊子夹取直径为8 mm的2%琼脂培养基圆饼置于灭菌的载玻片上，然后分别加10 μL 0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%和1.000 0%的茶多酚于培养基上，茶多酚溶液用无菌蒸馏水配制，以无菌水作为对照，再在其上加入10 μL 孢子悬浮液置于28 ℃下培养，每隔1 h镜检孢子萌发率，直到对照组基本完全萌发。每次镜检100个孢子，3次重复。
1.2.3 茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落直径的影响。参照文献[6]及1.2.2结果，分别取200 μL 0.100%、0.500%和1.000%的茶多酚溶液，均匀涂布于装有20 mL PDA、直径为90 mm的培养皿中，将直径为8 mm的菌饼倒置接于培养皿中央，于28 ℃下避光培养5 d，以无菌水作为对照测定菌落直径，每个处理做3个平行，3次重复。 1.2.4 茶多酚处理对硫色镰刀菌损伤接种马铃薯块茎切片病斑直径的影响。参照文献[7]的方法并改进，选取外观平整、无病虫害、无损伤的马铃薯置于2%次氯酸钠溶液中浸泡2 min，取出后用清水洗净切成1 cm厚的切片，然后用直径为35 mm的打孔器打成圆片，切片先用无菌水清洗，再用75%酒精擦洗并在酒精灯上灼烧以去除多余的酒精，后置于灭菌的湿滤纸上，室温下黑暗放置4 h，取200 μL 0.100%、0.500%、1.000%的茶多酚溶液用涂布器均匀涂布在马铃薯切片上，以无菌水作为对照，室温下黑暗放置24 h，分别取PDA上培养7 d、直径为8 mm的硫色镰刀菌菌饼倒置接在马铃薯切片中央，3 d后用十字交叉法测量病斑直径，记录数据。每个处理8个切片，3次重复。
1.2.5 茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响。参照魏晋梅等[8]方法并改进，第1组用不同浓度茶多酚处理的F. sul-pureum培养滤液对绿豆种子胚根长度的影响表示F.sulpur-eum产毒情况。将饱满均匀的绿豆种子用2%次氯酸钠溶液表面消毒5 min，用无菌水冲洗3次，放入铺有灭菌滤纸、加入2 mL培养滤液和3 mL无菌水（稀释度为1∶1.5）的培养皿内，在26～28 ℃恒温、黑暗条件下培养3 d后，测量胚根长度，计算平均值。第2组茶多酚对绿豆种子胚根长度的影响，试验方法同第1组。每处理用种子20粒，3次重复。
2 结果与分析
2.1 茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发的影响
由图1可知，不同浓度茶多酚溶液对硫色镰刀菌孢子萌发的影响差异不大，对照组基本完全萌发时，茶多酚处理组也基本萌发，随茶多酚浓度增大萌发率下降。不同的是茶多酚处理组与对照相比菌丝较短。此外，1.000 0%茶多酚溶液因颜色较深不易观察孢子萌发，数据误差大，未列出结果。
2.2 茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落直径的影响
由图2可以看出，不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落生长的抑制效果存在差异，表现为浓度越高抑制效果越明显，其中1.000%茶多酚抑制效果最好。0.100%和0.500%的茶多酚对硫色镰刀菌的菌落生长具有一定的抑制作用，相对于对照组而言分别降低了21.4%和32.8%。
2.3 茶多酚处理对损伤接种块茎切片病斑直径的影响
由图3可知，茶多酚处理可有效抑制损伤接种块茎切片病斑直径的扩展，但抑制效果存在差异。其中，以0.500%处理效果最好，0.100%处理效果与对照差异不显著，0.500%和1.000%处理可完全抑制损伤接种病斑直径的扩展。
2.4 茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响
由图4可知，茶多酚对绿豆胚根生长有一定影响，尤其是浓度为1.0%时，促进胚根生长，这可能是由于较高浓度茶多酚刺激分生组织，或者提供了营养物质。
由图5可知，茶多酚处理过的病原菌培养基滤液对绿豆胚根长度影响存在差异，其中0.5%的抑制产毒能力最好，0.1%次之，产毒能力分别较对照下降73.3%和50.0%。然而，1.0%茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒有一定刺激作用。
3 结论与讨论
3.1 讨论
本研究表明，不同浓度的茶多酚溶液对硫色镰刀菌孢子萌发影响差异不大，不同的是用茶多酚处理后菌丝较对照组变短。由于抑菌剂可破坏真菌细胞，使菌丝扭曲、变形甚至折断，使胞内外物质交换受阻，导致细胞对营养物质吸收降低、生物大分子合成受阻，严重时导致细胞死亡[9]。
不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落生长的抑制效果存在差异，表现为浓度越高抑制效果越明显。研究表明，茶多酚可破坏菌体细胞壁、细胞膜，使膜系统通透性骤然加大，有的甚至完全破裂，菌体内大量细胞质外溢，最终导致菌体细胞死亡[10]。
不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响存在差异，其中茶多酚浓度为0.5%时的抑制产毒能力最好。研究证明，丝状真菌的次级代谢产物，例如黄曲霉素的产生与氧化应激有密切关系，当细胞内活性氧增多时，氧化应激能引发并加强黄曲霉素的生物合成[11]。因此，具有抗氧化活性的物质能抑制黄曲霉素的合成[12]。茶多酚极有可能扰乱产毒真菌的氧化状态，改变真菌体内的信号传導，抑制或延滞产毒基因的表达，最终导致硫色镰刀菌的毒素生物合成量下降。
3.2 结论
茶多酚处理可在一定程度上抑制硫色镰刀菌的菌落扩展、损伤接种块茎切片的病斑直径扩展以及产毒能力，其中0.5%茶多酚对马铃薯干腐病抑制效果最好。由此表明，茶多酚除了直接的抑菌作用外，还具有诱导马铃薯块茎抗病性的功能。
4 参考文献
[1] 孙小娟，李永才，毕阳，等. 西北地区马铃薯贮藏期病害调查分析[J].中国马铃薯，2009，2（6）：364-365.
[2] QIU Y X，WANG J L.A study on soilure-ase inhibition by tea-polyphenol[J].Chin Sci Abstracts，2000，6：1286-1288.
[3] 徐丹，石伟力，宋宏新，等.茶多酚对黄曲霉生长及产毒能力的影响[J].陕西科技大学学报，2014，19（5）：550-552.
[4] 周德庆.微生物学实验教程[M].2版.北京：高等教育出版社，2006.
[5] 杨玲玉，孟祥红，刘成圣，等.壳聚糖的抗菌性及其对果实病害的防治研究进展[J].中国农业科学，2009，42（2）：626-635.
[6] 盛占武，毕阳，鄯晋晓，等. 采后硅酸钠处理对马铃薯干腐病的抑制[J].食品工业科技，2007，28（9）：190-192.
[7] RAY H，HAMMERSCHMIDT R.Responses of potato tuber toin fection by Fusarium sambucinum[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1998，53（2）：81-92.
[8] 魏晋梅，周围，毕阳. 粉红单端孢体外产毒条件的探讨及粗毒素活性测定[J].食品工业科技，2007，28（5）：110-112.
[9] 谢小梅，方建茹，许杨. 肉桂醛抗黄曲霉作用的研究[J].食品科学，2004，25（9）：32-34.
[10] 汪金莲，邱业先，陈宏伟，等.茶多酚对几种植物病原真菌的抑制作用及机理研究[D].苏州：苏州科技学院，2008.
[11] SUNG-YONG HONG，ROZE L V，LINZ J E.Oxidative stress-related transcription factors in the regulation of secondary metabolism[J].Toxins，2013，5（4）：683-702.
[12] ROBERT A H，REBECCA S B，GARY A P.Diverse inhibitors of aflato-xin biosynthesis[J].Applied Microbiology and Bio-technology，2008，78（4）：559-572.
关键词 马铃薯；茶多酚；硫色镰刀菌
中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）12-0108-03
Abstract This study investigated the effects of tea-polyphenols at different concentrations against Fusarium sulphureum of dry rot pathogen in potato tubers.Results indicated that tea-polyphenols at different concentrations treatment had a little influence on the spore germination of F.sulphureum.The colony diameter had no significant differences between 0.1% tea-polyphenols treatment and the control.The colony diameter of F.sulphureum treated by 0.5% and 1.0% of the tea-polyphenols reduced by 32.8% and 51.4% respectively than that of control. 0.5% and 1.0% of tea-polyphenols treatment could completely inhibit the development of colony diameter inoculated with F.sulphureum.Tea-polyphenols could also effectively inhibit toxin-producing of F.sulphureum，the optimum treatment concentration was 0.5%. It is proposed that tea-polyphenols treatment could directly inhibit pathogen growth and decrease dry rot of potato tubers by induced resistance.
Key words potatoes；tea-polyphenols；F.sulphureum
干腐病是我國西北地区马铃薯块茎贮藏期的真菌性病害，其发生与多种镰刀菌有关，其中硫色镰刀菌是最重要的病原物，其产生的真菌毒素不仅引起人畜急性中毒，还可致癌、致畸、致突变等[1]。随着我国病虫害绿色防控技术的推行，干腐病防治由以化学杀菌剂为主转向了植物源农药筛选。
茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称，具有较强的抗氧化和抑菌作用，对土壤脲酶和土壤真菌[2]、黄曲霉[3]等有较强的抑制作用。目前的研究以茶多酚的药理、病理、毒理学以及茶多酚的保颜、保鲜及除臭作用为主，其中对细菌的作用研究较多，但关于茶多酚对硫色镰刀菌生长及产毒能力的影响尚未见报道。因此，本文研究茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发、菌落生长、损伤接种马铃薯块茎切片病斑直径以及产毒能力的影响，以期为干腐病的防治提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试马铃薯品种为陇薯3号，2016年10月采于甘肃省农业科学院渭源县会川实验基地；供试病原菌硫色镰刀菌，由甘肃省农业科学院植物保护所提供；茶多酚，由北京索莱宝生物科技有限公司生产；绿豆种子，购自华联连锁超市兰州安宁店。马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每1 L培养基含土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL，自然pH；琼脂，由北京康倍斯科技有限公司生产。
试验仪器有SW-CJ-2FD洁净工作台、LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅、DHP-9272B型恒温培养箱、TH2-312台式恒温振荡器。
1.2 试验方法
1.2.1 孢子悬浮液的配制。参照文献[4]，将带菌PDA平皿在26 ℃下培养7 d，取出后加入含0.05% Tween-80的无菌水约10 mL，用涂布器刮下平板上的病原菌孢子，然后转入50 mL三角瓶中，在VXH-3微型旋涡混合器上振荡15 s，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度（1 × 106孢子/mL）。
1.2.2 茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发的影响。参照文献[5]，用镊子夹取直径为8 mm的2%琼脂培养基圆饼置于灭菌的载玻片上，然后分别加10 μL 0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%和1.000 0%的茶多酚于培养基上，茶多酚溶液用无菌蒸馏水配制，以无菌水作为对照，再在其上加入10 μL 孢子悬浮液置于28 ℃下培养，每隔1 h镜检孢子萌发率，直到对照组基本完全萌发。每次镜检100个孢子，3次重复。
1.2.3 茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落直径的影响。参照文献[6]及1.2.2结果，分别取200 μL 0.100%、0.500%和1.000%的茶多酚溶液，均匀涂布于装有20 mL PDA、直径为90 mm的培养皿中，将直径为8 mm的菌饼倒置接于培养皿中央，于28 ℃下避光培养5 d，以无菌水作为对照测定菌落直径，每个处理做3个平行，3次重复。 1.2.4 茶多酚处理对硫色镰刀菌损伤接种马铃薯块茎切片病斑直径的影响。参照文献[7]的方法并改进，选取外观平整、无病虫害、无损伤的马铃薯置于2%次氯酸钠溶液中浸泡2 min，取出后用清水洗净切成1 cm厚的切片，然后用直径为35 mm的打孔器打成圆片，切片先用无菌水清洗，再用75%酒精擦洗并在酒精灯上灼烧以去除多余的酒精，后置于灭菌的湿滤纸上，室温下黑暗放置4 h，取200 μL 0.100%、0.500%、1.000%的茶多酚溶液用涂布器均匀涂布在马铃薯切片上，以无菌水作为对照，室温下黑暗放置24 h，分别取PDA上培养7 d、直径为8 mm的硫色镰刀菌菌饼倒置接在马铃薯切片中央，3 d后用十字交叉法测量病斑直径，记录数据。每个处理8个切片，3次重复。
1.2.5 茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响。参照魏晋梅等[8]方法并改进，第1组用不同浓度茶多酚处理的F. sul-pureum培养滤液对绿豆种子胚根长度的影响表示F.sulpur-eum产毒情况。将饱满均匀的绿豆种子用2%次氯酸钠溶液表面消毒5 min，用无菌水冲洗3次，放入铺有灭菌滤纸、加入2 mL培养滤液和3 mL无菌水（稀释度为1∶1.5）的培养皿内，在26～28 ℃恒温、黑暗条件下培养3 d后，测量胚根长度，计算平均值。第2组茶多酚对绿豆种子胚根长度的影响，试验方法同第1组。每处理用种子20粒，3次重复。
2 结果与分析
2.1 茶多酚处理对硫色镰刀菌孢子萌发的影响
由图1可知，不同浓度茶多酚溶液对硫色镰刀菌孢子萌发的影响差异不大，对照组基本完全萌发时，茶多酚处理组也基本萌发，随茶多酚浓度增大萌发率下降。不同的是茶多酚处理组与对照相比菌丝较短。此外，1.000 0%茶多酚溶液因颜色较深不易观察孢子萌发，数据误差大，未列出结果。
2.2 茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落直径的影响
由图2可以看出，不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落生长的抑制效果存在差异，表现为浓度越高抑制效果越明显，其中1.000%茶多酚抑制效果最好。0.100%和0.500%的茶多酚对硫色镰刀菌的菌落生长具有一定的抑制作用，相对于对照组而言分别降低了21.4%和32.8%。
2.3 茶多酚处理对损伤接种块茎切片病斑直径的影响
由图3可知，茶多酚处理可有效抑制损伤接种块茎切片病斑直径的扩展，但抑制效果存在差异。其中，以0.500%处理效果最好，0.100%处理效果与对照差异不显著，0.500%和1.000%处理可完全抑制损伤接种病斑直径的扩展。
2.4 茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响
由图4可知，茶多酚对绿豆胚根生长有一定影响，尤其是浓度为1.0%时，促进胚根生长，这可能是由于较高浓度茶多酚刺激分生组织，或者提供了营养物质。
由图5可知，茶多酚处理过的病原菌培养基滤液对绿豆胚根长度影响存在差异，其中0.5%的抑制产毒能力最好，0.1%次之，产毒能力分别较对照下降73.3%和50.0%。然而，1.0%茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒有一定刺激作用。
3 结论与讨论
3.1 讨论
本研究表明，不同浓度的茶多酚溶液对硫色镰刀菌孢子萌发影响差异不大，不同的是用茶多酚处理后菌丝较对照组变短。由于抑菌剂可破坏真菌细胞，使菌丝扭曲、变形甚至折断，使胞内外物质交换受阻，导致细胞对营养物质吸收降低、生物大分子合成受阻，严重时导致细胞死亡[9]。
不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌菌落生长的抑制效果存在差异，表现为浓度越高抑制效果越明显。研究表明，茶多酚可破坏菌体细胞壁、细胞膜，使膜系统通透性骤然加大，有的甚至完全破裂，菌体内大量细胞质外溢，最终导致菌体细胞死亡[10]。
不同浓度茶多酚处理对硫色镰刀菌产毒能力的影响存在差异，其中茶多酚浓度为0.5%时的抑制产毒能力最好。研究证明，丝状真菌的次级代谢产物，例如黄曲霉素的产生与氧化应激有密切关系，当细胞内活性氧增多时，氧化应激能引发并加强黄曲霉素的生物合成[11]。因此，具有抗氧化活性的物质能抑制黄曲霉素的合成[12]。茶多酚极有可能扰乱产毒真菌的氧化状态，改变真菌体内的信号传導，抑制或延滞产毒基因的表达，最终导致硫色镰刀菌的毒素生物合成量下降。
3.2 结论
茶多酚处理可在一定程度上抑制硫色镰刀菌的菌落扩展、损伤接种块茎切片的病斑直径扩展以及产毒能力，其中0.5%茶多酚对马铃薯干腐病抑制效果最好。由此表明，茶多酚除了直接的抑菌作用外，还具有诱导马铃薯块茎抗病性的功能。
4 参考文献
[1] 孙小娟，李永才，毕阳，等. 西北地区马铃薯贮藏期病害调查分析[J].中国马铃薯，2009，2（6）：364-365.
[2] QIU Y X，WANG J L.A study on soilure-ase inhibition by tea-polyphenol[J].Chin Sci Abstracts，2000，6：1286-1288.
[3] 徐丹，石伟力，宋宏新，等.茶多酚对黄曲霉生长及产毒能力的影响[J].陕西科技大学学报，2014，19（5）：550-552.
[4] 周德庆.微生物学实验教程[M].2版.北京：高等教育出版社，2006.
[5] 杨玲玉，孟祥红，刘成圣，等.壳聚糖的抗菌性及其对果实病害的防治研究进展[J].中国农业科学，2009，42（2）：626-635.
[6] 盛占武，毕阳，鄯晋晓，等. 采后硅酸钠处理对马铃薯干腐病的抑制[J].食品工业科技，2007，28（9）：190-192.
[7] RAY H，HAMMERSCHMIDT R.Responses of potato tuber toin fection by Fusarium sambucinum[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1998，53（2）：81-92.
[8] 魏晋梅，周围，毕阳. 粉红单端孢体外产毒条件的探讨及粗毒素活性测定[J].食品工业科技，2007，28（5）：110-112.
[9] 谢小梅，方建茹，许杨. 肉桂醛抗黄曲霉作用的研究[J].食品科学，2004，25（9）：32-34.
[10] 汪金莲，邱业先，陈宏伟，等.茶多酚对几种植物病原真菌的抑制作用及机理研究[D].苏州：苏州科技学院，2008.
[11] SUNG-YONG HONG，ROZE L V，LINZ J E.Oxidative stress-related transcription factors in the regulation of secondary metabolism[J].Toxins，2013，5（4）：683-702.
[12] ROBERT A H，REBECCA S B，GARY A P.Diverse inhibitors of aflato-xin biosynthesis[J].Applied Microbiology and Bio-technology，2008，78（4）：559-572.