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摘要：[目的]获得一种简单高效的纤维素酶产生菌的筛选方法。[方法]基于扩散原理，采用滤纸条扩散试验筛选纤维素酶产生菌。[结果]获得2株纤维素酶产生菌菌株X1和X2。经DNS法检验，菌株X1的FPA酶和CMC酶活力分别为12.3和8.3 U，菌株X2的FPA酶和CMC酶活力分别为8.8和7.8 U。[结论]滤纸条扩散试验可作为一种便捷高效的筛选高质量纤维素酶产生菌的方法。
关键词：扩散；纤维素酶；筛选
中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-122-02
Abstract：[Objective] To obtain a screening method for celluloseproducing strains， which was simple and effective. [Method] Based on the diffusion principle， filter paper diffusion experiment was used to screen the celluloseproducing strains. [Result] Two celluloseproducing strains （X1， X2） were obtained. DNS test showed that the activities of FPAase and CMCase of two strains were 12.3， 8.3；7.8， 8.8 U， respectively. [Conclusion] Results indicated that filter paper diffusion experiment could be used as a new efficient method to screen celluloseproducing strains.
Key words：Diffusion； Celluloseproducing strains； Screening
纤维素是葡萄糖分子通过β1，4糖苷键连接而成的直链多糖类物质，是自然界含量最丰富的可再生资源[1-2]。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，目前广泛应用于畜牧业、食品工业、纺织工业以及能源工业，已成为酶工程研究的热点[3-6]。
纤维素酶产生菌的筛选是纤维素酶工业应用的基础。研究表明，纤维素酶工业生产的菌株一般是从环境中筛选，经基因工程改造后的重组菌株[6-10]。传统的纤维素酶产生菌筛选一般需经过富集、初筛、复筛、纯化等过程，筛选时间长，程序繁琐，且工作量大。为此，笔者设计了一种滤纸条扩散试验，可在富集、初筛的基础上，初步得到单菌落，该方法简单易行，极大地缩减了筛选工作量。
1：材料與方法
1.1：材料
1.1.1：土壤。供试土壤来源于
广东省河源市笔架山周边山地腐殖土。
1.1.2：培养基。
①改良牛肉膏蛋白胨培养基：CMCNa 5.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。
②改良高氏培养基：CMCNa 5.0 g/L，可溶性淀粉 10.0 g/L，KNO3 1.0 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，NaCl 05 g/L，FeSO4· 7H2O 0.01 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.6。
③滤纸条培养基：（NH4）2SO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MnSO4·H2O 25 mg/L，FeSO4·7H2O 7.5 mg/L，蒸馏水1 000 mL，pH自然。
④羧甲基纤维素培养基：CMCNa 5.0 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，琼脂 15.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。
⑤纤维素刚果红培养基：CMCNa 2.0 g/L，（NH4）2SO4 20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，刚果红 0.4 g/L，琼脂 15.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。
1.1.3：试剂。
蛋白胨（Oxoid），羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4：溶液的配制。
葡萄糖标准溶液：葡萄糖经110 ℃烘干至恒重，准确称量，配制0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。
1%CMCNa底物溶液：取0.51 g CMCNa，加入2 mL pH 4.8，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，混合定容至100 mL。
1.2：方法
1.2.1：滤纸条扩散分离。
称取0.5 g土样加入100 mL生理盐水中，充分振荡10～20 min。取0.5 mL悬浮液接种于滤纸条培养基中，滤纸条1/3露出培养基液面以上。在30 ℃生化培养箱中培养，观察滤纸上菌落生长和滤纸崩解情况。挑取滤纸条上带有降解空洞的菌落进行刚果红鉴定平板复筛，选择透明圈较大者进行菌株保存，并进行后续试验。
1.2.2：滤纸酶（FPA）活力测定。
取0.5 mL上清酶液，加入1 mL pH 4.8，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入约50 mg滤纸（1 cm×5 cm）1条，于50 ℃水浴酶解10 min，然后加入3，5二硝基水杨酸（DNS） 2 mL，沸水浴5 min，流水冷却后于540 nm下测定吸光度。同时设置空白对照组（在试管中加入0.5 mL灭活上清酶液，计算时扣除本底）。酶活根据国际通用的酶活单位来表示，即1 mL粗酶液1 min产生1 mg/L还原糖定义为一个酶活单位（U）。 1.2.3：羧甲基纤维素酶（CMC）活力测定。
取0.5 mL上清酶液，加入1% CMCNa底物溶液2 mL，50 ℃水浴酶解反应10 min，然后加入DNS 2 mL，沸水浴5 min，流水冷却后于540 nm下测定吸光度，同时设置空白组（在试管中加入0.5 mL灭活上清酶液，计算时扣除本底）。
酶活根据国际通用的酶活单位来表示，即1 mL粗酶液1 min产生1 mg/L还原糖定义为一个酶活单位（U）。
2：结果与分析
2.1：纤维素降解菌株的筛选：
土壤悬浮液接种于滤纸条培养基中，培养第2天，试管底部出现滤纸屑（图1A）；5 d后，滤纸条出现断裂降解现象（图1B），并开始在上端出现降解菌落（图1C），降解菌落周围滤纸出现圆形降解空洞（图1D）。挑取这些菌落进行刚果红鉴定平板复筛，可得到有透明圈的菌落，选择透明圈
最大的菌株X1和X2为后续研究菌株（图2）。
2.2：FPA酶和CMC酶活力：
采用DNS法测定不同pH下的酶活力，结果显示，菌株X1的FPA酶活力最高达12.3 U，CMC酶活力最高达8.3 U。菌株X2的FPA酶活力最高达8.8 U，CMC酶活力最高达7.8 U（图3）。
3：结论与讨论
该试验依据自由扩散原理，设计滤纸条扩散试验筛选纤维素降解菌株。由于細菌个体可随培养液扩散至未浸没的滤纸条，且在扩散时，培养液中的菌体因滤纸条中纤维素的阻碍作用而被分开，经培养可在滤纸条上生长形成能降解纤维素的单菌落，达到初筛分离的效果。该研究采用该方法一次性获得2株降解能力较强的纤维素酶产生菌X1和X2，挑取单菌落进行刚果红鉴定平板复筛培养，可得到有透明圈的菌落，经DNS法检测酶活，显示酶活力较强。
虽然纤维素酶的发现距今已有上百年的历史，纤维素酶的研究与应用取得了很大进展，但纤维素酶是一种组成十分复杂的酶，其作用机理至今尚未明确。目前菌株所产的纤维素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、酶活不高、酶作用条件苛刻等问题。因此，选育优良的产纤维素酶菌株，提高降解天然纤维素的能力仍是当前和今后纤维素酶研究的：
主要方向。
该研究通过建立操作简单的滤纸条扩散分离筛选方法，成功地从土壤环境中筛选出具有较高酶活力的纤维素酶产生菌，这有利于更便捷地选育优良产纤维素酶菌株，为纤维素酶的进一步研究奠定基础。
参考文献
[1] 李世霞，徐爱秋，颜怀宇.纤维素酶的研究与应用[J].中国饲料添加剂，2008（8）：37-39.
[2] 陈路劼，刘斌，林白雪，等.降解纤维素嗜热菌的分离及纤维素酶性质分析[J].福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（1）：67-72.
[3] 罗颖，欧阳嘉，许婧，等.耐热纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及产酶条件优化[J].食品与生物技术学报，2007，26（1）：84-89.
[4] 刘韫滔，禤淑霞，龙传南，等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报，2008，24（6）：1112-1116.
[5] 陈伟钊，刘森林，邢苗.耐热碱性纤维素酶分离纯化及酶学特性研究[J].深圳大学学报（理工版），2007，24（2）：212-216.
[6] 李争明，张娟.纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化[J].生物技术通报，2015，31（5）：146-152.
[7] 郑豪盈，樊永欣.书虱伴生菌中纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及最佳产酶发酵条件的优化[J].环境工程学报，2015（8）：4081-4094.
[8] ZHANG Y H P，LYND L R.Toward an aggregated understanding of en-zymatic hydrolysis of cellulase：Noncomplexed cellulase systems[J].Bio-technol Bioeng，2004，88（7）：797-824.
[9] 程仕伟，李坦坦.响应面优化金橙黄微杆菌YT9 的发酵条件生产纤维素酶[J].中国酿造，2013，32（4）：48-51.
[10] MA L，ZHANG J，ZOU G，et al.Improvement of cellulase activity in Tri-choderma reesei by heterologous expression of a beta-glucosidase genefrom Penicillium decumbens[J].Enzyme Microb Tech，2011，49（4）：366-371.
关键词：扩散；纤维素酶；筛选
中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-122-02
Abstract：[Objective] To obtain a screening method for celluloseproducing strains， which was simple and effective. [Method] Based on the diffusion principle， filter paper diffusion experiment was used to screen the celluloseproducing strains. [Result] Two celluloseproducing strains （X1， X2） were obtained. DNS test showed that the activities of FPAase and CMCase of two strains were 12.3， 8.3；7.8， 8.8 U， respectively. [Conclusion] Results indicated that filter paper diffusion experiment could be used as a new efficient method to screen celluloseproducing strains.
Key words：Diffusion； Celluloseproducing strains； Screening
纤维素是葡萄糖分子通过β1，4糖苷键连接而成的直链多糖类物质，是自然界含量最丰富的可再生资源[1-2]。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，目前广泛应用于畜牧业、食品工业、纺织工业以及能源工业，已成为酶工程研究的热点[3-6]。
纤维素酶产生菌的筛选是纤维素酶工业应用的基础。研究表明，纤维素酶工业生产的菌株一般是从环境中筛选，经基因工程改造后的重组菌株[6-10]。传统的纤维素酶产生菌筛选一般需经过富集、初筛、复筛、纯化等过程，筛选时间长，程序繁琐，且工作量大。为此，笔者设计了一种滤纸条扩散试验，可在富集、初筛的基础上，初步得到单菌落，该方法简单易行，极大地缩减了筛选工作量。
1：材料與方法
1.1：材料
1.1.1：土壤。供试土壤来源于
广东省河源市笔架山周边山地腐殖土。
1.1.2：培养基。
①改良牛肉膏蛋白胨培养基：CMCNa 5.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。
②改良高氏培养基：CMCNa 5.0 g/L，可溶性淀粉 10.0 g/L，KNO3 1.0 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，NaCl 05 g/L，FeSO4· 7H2O 0.01 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.6。
③滤纸条培养基：（NH4）2SO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MnSO4·H2O 25 mg/L，FeSO4·7H2O 7.5 mg/L，蒸馏水1 000 mL，pH自然。
④羧甲基纤维素培养基：CMCNa 5.0 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，琼脂 15.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。
⑤纤维素刚果红培养基：CMCNa 2.0 g/L，（NH4）2SO4 20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，刚果红 0.4 g/L，琼脂 15.0 g/L，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。
1.1.3：试剂。
蛋白胨（Oxoid），羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4：溶液的配制。
葡萄糖标准溶液：葡萄糖经110 ℃烘干至恒重，准确称量，配制0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。
1%CMCNa底物溶液：取0.51 g CMCNa，加入2 mL pH 4.8，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，混合定容至100 mL。
1.2：方法
1.2.1：滤纸条扩散分离。
称取0.5 g土样加入100 mL生理盐水中，充分振荡10～20 min。取0.5 mL悬浮液接种于滤纸条培养基中，滤纸条1/3露出培养基液面以上。在30 ℃生化培养箱中培养，观察滤纸上菌落生长和滤纸崩解情况。挑取滤纸条上带有降解空洞的菌落进行刚果红鉴定平板复筛，选择透明圈较大者进行菌株保存，并进行后续试验。
1.2.2：滤纸酶（FPA）活力测定。
取0.5 mL上清酶液，加入1 mL pH 4.8，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入约50 mg滤纸（1 cm×5 cm）1条，于50 ℃水浴酶解10 min，然后加入3，5二硝基水杨酸（DNS） 2 mL，沸水浴5 min，流水冷却后于540 nm下测定吸光度。同时设置空白对照组（在试管中加入0.5 mL灭活上清酶液，计算时扣除本底）。酶活根据国际通用的酶活单位来表示，即1 mL粗酶液1 min产生1 mg/L还原糖定义为一个酶活单位（U）。 1.2.3：羧甲基纤维素酶（CMC）活力测定。
取0.5 mL上清酶液，加入1% CMCNa底物溶液2 mL，50 ℃水浴酶解反应10 min，然后加入DNS 2 mL，沸水浴5 min，流水冷却后于540 nm下测定吸光度，同时设置空白组（在试管中加入0.5 mL灭活上清酶液，计算时扣除本底）。
酶活根据国际通用的酶活单位来表示，即1 mL粗酶液1 min产生1 mg/L还原糖定义为一个酶活单位（U）。
2：结果与分析
2.1：纤维素降解菌株的筛选：
土壤悬浮液接种于滤纸条培养基中，培养第2天，试管底部出现滤纸屑（图1A）；5 d后，滤纸条出现断裂降解现象（图1B），并开始在上端出现降解菌落（图1C），降解菌落周围滤纸出现圆形降解空洞（图1D）。挑取这些菌落进行刚果红鉴定平板复筛，可得到有透明圈的菌落，选择透明圈
最大的菌株X1和X2为后续研究菌株（图2）。
2.2：FPA酶和CMC酶活力：
采用DNS法测定不同pH下的酶活力，结果显示，菌株X1的FPA酶活力最高达12.3 U，CMC酶活力最高达8.3 U。菌株X2的FPA酶活力最高达8.8 U，CMC酶活力最高达7.8 U（图3）。
3：结论与讨论
该试验依据自由扩散原理，设计滤纸条扩散试验筛选纤维素降解菌株。由于細菌个体可随培养液扩散至未浸没的滤纸条，且在扩散时，培养液中的菌体因滤纸条中纤维素的阻碍作用而被分开，经培养可在滤纸条上生长形成能降解纤维素的单菌落，达到初筛分离的效果。该研究采用该方法一次性获得2株降解能力较强的纤维素酶产生菌X1和X2，挑取单菌落进行刚果红鉴定平板复筛培养，可得到有透明圈的菌落，经DNS法检测酶活，显示酶活力较强。
虽然纤维素酶的发现距今已有上百年的历史，纤维素酶的研究与应用取得了很大进展，但纤维素酶是一种组成十分复杂的酶，其作用机理至今尚未明确。目前菌株所产的纤维素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、酶活不高、酶作用条件苛刻等问题。因此，选育优良的产纤维素酶菌株，提高降解天然纤维素的能力仍是当前和今后纤维素酶研究的：
主要方向。
该研究通过建立操作简单的滤纸条扩散分离筛选方法，成功地从土壤环境中筛选出具有较高酶活力的纤维素酶产生菌，这有利于更便捷地选育优良产纤维素酶菌株，为纤维素酶的进一步研究奠定基础。
参考文献
[1] 李世霞，徐爱秋，颜怀宇.纤维素酶的研究与应用[J].中国饲料添加剂，2008（8）：37-39.
[2] 陈路劼，刘斌，林白雪，等.降解纤维素嗜热菌的分离及纤维素酶性质分析[J].福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（1）：67-72.
[3] 罗颖，欧阳嘉，许婧，等.耐热纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及产酶条件优化[J].食品与生物技术学报，2007，26（1）：84-89.
[4] 刘韫滔，禤淑霞，龙传南，等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报，2008，24（6）：1112-1116.
[5] 陈伟钊，刘森林，邢苗.耐热碱性纤维素酶分离纯化及酶学特性研究[J].深圳大学学报（理工版），2007，24（2）：212-216.
[6] 李争明，张娟.纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化[J].生物技术通报，2015，31（5）：146-152.
[7] 郑豪盈，樊永欣.书虱伴生菌中纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及最佳产酶发酵条件的优化[J].环境工程学报，2015（8）：4081-4094.
[8] ZHANG Y H P，LYND L R.Toward an aggregated understanding of en-zymatic hydrolysis of cellulase：Noncomplexed cellulase systems[J].Bio-technol Bioeng，2004，88（7）：797-824.
[9] 程仕伟，李坦坦.响应面优化金橙黄微杆菌YT9 的发酵条件生产纤维素酶[J].中国酿造，2013，32（4）：48-51.
[10] MA L，ZHANG J，ZOU G，et al.Improvement of cellulase activity in Tri-choderma reesei by heterologous expression of a beta-glucosidase genefrom Penicillium decumbens[J].Enzyme Microb Tech，2011，49（4）：366-371.