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【摘要】 通过将荧光标记的骨髓间充质干细胞移植入治疗组大白鼠机体内，通过观察，确定植物源性生肌因子对于心肌梗塞的治疗效果。在本研究中，首先对于心肌梗塞基本情况进行了描述，并针对当前存在的治疗方法及弊端进行了探讨；其次对植物性生肌因子治疗有效性给出了总结，其中包括有效成分的制备、实验假设与期望；最后，从形态学评估、心肌梗死体积有效评估和荧光标记追踪来分析植物源性生肌分子的诱导分化机理。
【关键词】 植物源性生肌因子；心肌梗塞
心肌梗塞为缺血性心脏病的主要种类之一，在当前医学界，尚无任何治疗手段和药物能够有效治疗心肌梗塞，多种先进的治疗方法，如冠状动脉支架及旁路移植等只是对心肌梗塞起到缓解作用而不能根治。根据相关研究可知，通过引入外源干细胞或内源性祖细胞库的方法，再生细胞便能够取代死亡心肌细胞，使心肌梗塞得以根本性治疗，然而这一方案的效率很低难以具体实施[1]。在之前研究的基础上，我们在柔毛水杨梅中获取了甲醇提取物，此种物质对于心肌细胞的再生具有促进作用，为心肌梗塞的治疗指明方向。
1 心肌梗塞基本概况
心肌梗塞指的是当心脏中某一部分血流供应中断所造成的心肌组织缺血坏死。通常，冠状动脉的粥样硬化斑块被损伤而破裂是导致血液供应中断的主要诱因[2]。尽管大多数的心肌梗塞都表现出如胸骨后部疼痛并辐射至背部和颈部、呼吸困难、焦虑出汗、突发性胸闷等，然而相当一部分的患者在无明显病症的情况下便发生突发性心肌梗塞[3]。一般来说，上述症状在数分钟内会呈现出逐渐发作的特点。其中，急性心肌梗塞常表现为胸闷，多被发作者描述成紧张感；其他症状如恶心、出汗、心悸等主要由机体内交感神经的过分紧张而导致，此时身体中血流动力学突然改变、身体疼痛等都会带来儿茶酚的激增，发生心肌梗塞的重症病例患者会突然死亡或丧失意识。
2 目前治疗心肌梗塞方法及疗效
为了能够达到对心肌梗塞修复的目的，众多医学专家试图寻找能够促使心肌细胞发生再生的干细胞，如ESC、HSC、成肌细胞[4]等，但用这些祖细胞诱导心肌细胞分化效果不太理想。另有通过诱导多功能干细胞的方法来达到细胞治疗目的等方法，但由于亟待解决的问题尚多（如，如何进行外源基因表达控制及维持细胞治疗稳定性），因此还不能应用。
3 植物提取物有效成分对于心肌梗塞治疗的有效性判断
3.1 植物提取物的制备 最近我们发现，利用有机溶剂对柔毛水扬梅进行提取能够获得EGJ，这种物质对于促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化具有重要意义[5]，同时能够显著治疗心肌梗塞，另外，相关研究已经明确给出了EGJ对于促进心肌细胞再生的机理和证据[6]。在本课题中，我们通过将离心法和活性导向法有机结合，将EGJ活性化合物提取出来，经过分离的EGJ仍能够对于心肌细胞的分化起到促进作用。
在本研究中，离心法和活性导向法对于药物促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化程度具有评价作用，同时能够对药物的活性起到检测作用，并未下步分离作指导。在反复分离之后，治疗心肌梗塞有效成分（植物源性生肌分子）便能够从柔毛水杨酸甲醇提取物当中得到分离。经HPLC分析可知，分离纯度在96%之上，且经核磁共振能够明确所提取升生肌因子的化学结构。
3.2 利用植物源性生肌分子进行心肌梗塞治疗的假设及期望
首先，我们试图研制出一种易于在临床应用中推广，安全系数高的口服治疗心肌梗塞的方法，此种方法能够取代过去极具危险性和侵入性的局部注射方法。
其次，在植物源性因子诱导心肌再生的过程中，我们将骨髓间充质干细胞认为是来源，并在接下来的研究中试图证明这一点。
最后，我们假设，在机体发生心肌梗塞之后，骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，并在植物源性因子的诱导下，将特定的基因激活、表达，引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。
4 植物源性生肌分子对于心肌梗塞治疗作用
4.1 形态学评估 可以对心脏断面图进行评估、检查。利用福尔马林对实验心脏标本固定好，采用平面评估计算法对心脏的大体状况进行评价。首先，通过肉眼对所选对比组大白鼠心脏进行观察，能够观察到远端约有3-5mm直径的凹陷不平、灰白色梗死区域。而与之形成对比的是，治疗组大白鼠的心肌梗死区域出现瘢痕范围比对比组小1/2左右，治疗效果存在显著性差异。其次，将心脏依其短轴并经梗死区纵切，可以看到对照组的大白鼠心脏梗死区心室壁比治疗组薄，治疗效果差异性显著。将切片置于低倍显微镜下观察可发现，对比组的心肌梗死区域存在相当多的纤维瘢痕，由于这些纤维瘢痕的存在，而导致当对切片进行Masson染色后，表面呈现蓝色；相比之下，治疗组的心肌梗死区域则存在很多嗜伊红细胞的集落，且经Masson染色后，蓝色明显减少，表明治疗效果显著。
4.2 对心肌梗死体积有效评估 对大白鼠梗死心肌区域进行形态学度量，进而定量分析其心肌梗死的体积，将平均梗死的体积用与左心室体积相比的百分数进行表示。实验结果表明，经植物源性生肌分子治疗三周后的大白鼠机体内心肌梗死的体积百分数明显降低（n=10，18.5±3.6%），而对比组的大白鼠机体内心肌梗死的体积百分数则高于治疗组（n=10，32.2±4.3%），表明治疗效果存在统计学差异。通过显微镜可以观察到，对比组中心肌细胞梗死区呈现出显著的蓝色瘢痕纤维。而经植物源性生肌分子治疗组则存在较多心肌细胞团。另外，经对比发现，梗死区心肌细胞体积较小（约小1/3）。这些观察结果表明，存在的心肌细胞属于再生的心肌细胞，且经过攒聚而形成心肌组织，对于梗死区域来说起到了修复和更新的作用。
为进一步判断存在的心肌细胞是否经再生得出，实验小组利用肌球蛋白重链抗体与心肌细胞的抗原免疫来实行染色操作，在所得结果中，我们能够找到经特异性阳性染色（Ki67）的心肌细胞细胞核，此项实验结果证实了所得细胞为再生细胞，这些细胞的细胞浆经肌球蛋白重链阳性染色，这说明再生细胞为心肌细胞。 综上所述，分布于大白鼠梗塞区心肌细胞为再生性心肌细胞，而植物源性生肌分子治疗对于修复、治疗被损伤的心肌细胞效果显著。
4.3 利用荧光标记对植物源性生肌分子诱导分化机理进行追踪 由于在之前我们提到了实验假设，即在机体发生心肌梗塞之后，骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，进而引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。为了证明这一假设，实验小组通过对骨髓间充质干细胞进行荧光DiI标记，并将经过处理的细胞向治疗组大白鼠机体的骨髓中移植，以此形成对荧光标记细胞的追踪。紧接着，实验小组将移植了荧光标记细胞的骨髓造成心肌细胞模型，并对其进行植物源性生肌分子治疗。经为期3周的治疗，将治疗组大白鼠心脏活体取出，并固定，以石蜡进行包埋，然后切片，借助于荧光显微镜对特异性荧光染色进行观察。通过观察可以发现，治疗时间达1周或3周，在整个心肌梗塞区可以观测到DiI荧光标记阳性细胞及新生成的血管。在对照组大白鼠心脏梗塞区内，只有叫少量阳性DiI细胞稀疏分布在梗塞区边缘。另外，经植物源性生肌分子治疗的心脏梗塞区中，能够观察到很多阳性染色细胞核，且其中，有很多为细胞浆阳性DiI心肌细胞核。这些都是骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，进而引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的有力证据。对治疗组大白鼠进行3周植物源性生肌分子治疗后，心肌细胞体积明显较前1周、2周有所增大，这表明，再生心肌细胞能够伴随时间增长而逐步发育成熟。
5 结束语
本实验通过对柔毛水扬梅中EGJ成分进行提取，证实了植物性生肌分子对于心肌细胞分化的促进作用，能够有效引导心肌细胞再生，对于心肌梗塞的治疗具有重要意义。由于口服植物性生肌分子的降低心肌梗塞药物风险、提高治疗有效度、取代心肌注射操作等尚在设想、研发阶段，因此本研究为相关工作指明了前进方向。可以肯定的是，植物源性生肌因子的方法对于心肌梗塞治疗相关研究来说，是一个巨大进步，但目前需要做的是通过更多改进将其推广到临床应用上。在下一步的工作当中，我们将对植物性生肌因子在机体内的药代动力学、药效学和详细代谢影响做系统性研究，并且在其优越修复机制的特点上，试图将其进一步应用于慢性缺血性心脏病及陈旧性心肌梗塞上。
参考文献
[1] 孙燕燕，杨树标，路巍.治疗急性心肌梗塞泵衰竭40例疗效观察[J].齐鲁医学杂志，2010，（04）.
[2] 张承宗，郑成环，赵文鼎，傅文栋，李广平，金晓静，蔡金荣，李立丰，刘洪梅.心肌梗塞患者长期应用美多心安随访结果[J].中国康复医学杂志，2011，（06）.
[3] 杨回珍，刘家娴，李佛庭.心肌梗塞和心肌缺血特征对比分析[A].第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C].2010.
【关键词】 植物源性生肌因子；心肌梗塞
心肌梗塞为缺血性心脏病的主要种类之一，在当前医学界，尚无任何治疗手段和药物能够有效治疗心肌梗塞，多种先进的治疗方法，如冠状动脉支架及旁路移植等只是对心肌梗塞起到缓解作用而不能根治。根据相关研究可知，通过引入外源干细胞或内源性祖细胞库的方法，再生细胞便能够取代死亡心肌细胞，使心肌梗塞得以根本性治疗，然而这一方案的效率很低难以具体实施[1]。在之前研究的基础上，我们在柔毛水杨梅中获取了甲醇提取物，此种物质对于心肌细胞的再生具有促进作用，为心肌梗塞的治疗指明方向。
1 心肌梗塞基本概况
心肌梗塞指的是当心脏中某一部分血流供应中断所造成的心肌组织缺血坏死。通常，冠状动脉的粥样硬化斑块被损伤而破裂是导致血液供应中断的主要诱因[2]。尽管大多数的心肌梗塞都表现出如胸骨后部疼痛并辐射至背部和颈部、呼吸困难、焦虑出汗、突发性胸闷等，然而相当一部分的患者在无明显病症的情况下便发生突发性心肌梗塞[3]。一般来说，上述症状在数分钟内会呈现出逐渐发作的特点。其中，急性心肌梗塞常表现为胸闷，多被发作者描述成紧张感；其他症状如恶心、出汗、心悸等主要由机体内交感神经的过分紧张而导致，此时身体中血流动力学突然改变、身体疼痛等都会带来儿茶酚的激增，发生心肌梗塞的重症病例患者会突然死亡或丧失意识。
2 目前治疗心肌梗塞方法及疗效
为了能够达到对心肌梗塞修复的目的，众多医学专家试图寻找能够促使心肌细胞发生再生的干细胞，如ESC、HSC、成肌细胞[4]等，但用这些祖细胞诱导心肌细胞分化效果不太理想。另有通过诱导多功能干细胞的方法来达到细胞治疗目的等方法，但由于亟待解决的问题尚多（如，如何进行外源基因表达控制及维持细胞治疗稳定性），因此还不能应用。
3 植物提取物有效成分对于心肌梗塞治疗的有效性判断
3.1 植物提取物的制备 最近我们发现，利用有机溶剂对柔毛水扬梅进行提取能够获得EGJ，这种物质对于促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化具有重要意义[5]，同时能够显著治疗心肌梗塞，另外，相关研究已经明确给出了EGJ对于促进心肌细胞再生的机理和证据[6]。在本课题中，我们通过将离心法和活性导向法有机结合，将EGJ活性化合物提取出来，经过分离的EGJ仍能够对于心肌细胞的分化起到促进作用。
在本研究中，离心法和活性导向法对于药物促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化程度具有评价作用，同时能够对药物的活性起到检测作用，并未下步分离作指导。在反复分离之后，治疗心肌梗塞有效成分（植物源性生肌分子）便能够从柔毛水杨酸甲醇提取物当中得到分离。经HPLC分析可知，分离纯度在96%之上，且经核磁共振能够明确所提取升生肌因子的化学结构。
3.2 利用植物源性生肌分子进行心肌梗塞治疗的假设及期望
首先，我们试图研制出一种易于在临床应用中推广，安全系数高的口服治疗心肌梗塞的方法，此种方法能够取代过去极具危险性和侵入性的局部注射方法。
其次，在植物源性因子诱导心肌再生的过程中，我们将骨髓间充质干细胞认为是来源，并在接下来的研究中试图证明这一点。
最后，我们假设，在机体发生心肌梗塞之后，骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，并在植物源性因子的诱导下，将特定的基因激活、表达，引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。
4 植物源性生肌分子对于心肌梗塞治疗作用
4.1 形态学评估 可以对心脏断面图进行评估、检查。利用福尔马林对实验心脏标本固定好，采用平面评估计算法对心脏的大体状况进行评价。首先，通过肉眼对所选对比组大白鼠心脏进行观察，能够观察到远端约有3-5mm直径的凹陷不平、灰白色梗死区域。而与之形成对比的是，治疗组大白鼠的心肌梗死区域出现瘢痕范围比对比组小1/2左右，治疗效果存在显著性差异。其次，将心脏依其短轴并经梗死区纵切，可以看到对照组的大白鼠心脏梗死区心室壁比治疗组薄，治疗效果差异性显著。将切片置于低倍显微镜下观察可发现，对比组的心肌梗死区域存在相当多的纤维瘢痕，由于这些纤维瘢痕的存在，而导致当对切片进行Masson染色后，表面呈现蓝色；相比之下，治疗组的心肌梗死区域则存在很多嗜伊红细胞的集落，且经Masson染色后，蓝色明显减少，表明治疗效果显著。
4.2 对心肌梗死体积有效评估 对大白鼠梗死心肌区域进行形态学度量，进而定量分析其心肌梗死的体积，将平均梗死的体积用与左心室体积相比的百分数进行表示。实验结果表明，经植物源性生肌分子治疗三周后的大白鼠机体内心肌梗死的体积百分数明显降低（n=10，18.5±3.6%），而对比组的大白鼠机体内心肌梗死的体积百分数则高于治疗组（n=10，32.2±4.3%），表明治疗效果存在统计学差异。通过显微镜可以观察到，对比组中心肌细胞梗死区呈现出显著的蓝色瘢痕纤维。而经植物源性生肌分子治疗组则存在较多心肌细胞团。另外，经对比发现，梗死区心肌细胞体积较小（约小1/3）。这些观察结果表明，存在的心肌细胞属于再生的心肌细胞，且经过攒聚而形成心肌组织，对于梗死区域来说起到了修复和更新的作用。
为进一步判断存在的心肌细胞是否经再生得出，实验小组利用肌球蛋白重链抗体与心肌细胞的抗原免疫来实行染色操作，在所得结果中，我们能够找到经特异性阳性染色（Ki67）的心肌细胞细胞核，此项实验结果证实了所得细胞为再生细胞，这些细胞的细胞浆经肌球蛋白重链阳性染色，这说明再生细胞为心肌细胞。 综上所述，分布于大白鼠梗塞区心肌细胞为再生性心肌细胞，而植物源性生肌分子治疗对于修复、治疗被损伤的心肌细胞效果显著。
4.3 利用荧光标记对植物源性生肌分子诱导分化机理进行追踪 由于在之前我们提到了实验假设，即在机体发生心肌梗塞之后，骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，进而引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。为了证明这一假设，实验小组通过对骨髓间充质干细胞进行荧光DiI标记，并将经过处理的细胞向治疗组大白鼠机体的骨髓中移植，以此形成对荧光标记细胞的追踪。紧接着，实验小组将移植了荧光标记细胞的骨髓造成心肌细胞模型，并对其进行植物源性生肌分子治疗。经为期3周的治疗，将治疗组大白鼠心脏活体取出，并固定，以石蜡进行包埋，然后切片，借助于荧光显微镜对特异性荧光染色进行观察。通过观察可以发现，治疗时间达1周或3周，在整个心肌梗塞区可以观测到DiI荧光标记阳性细胞及新生成的血管。在对照组大白鼠心脏梗塞区内，只有叫少量阳性DiI细胞稀疏分布在梗塞区边缘。另外，经植物源性生肌分子治疗的心脏梗塞区中，能够观察到很多阳性染色细胞核，且其中，有很多为细胞浆阳性DiI心肌细胞核。这些都是骨髓间充质干细胞移动到了梗塞部位，进而引导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的有力证据。对治疗组大白鼠进行3周植物源性生肌分子治疗后，心肌细胞体积明显较前1周、2周有所增大，这表明，再生心肌细胞能够伴随时间增长而逐步发育成熟。
5 结束语
本实验通过对柔毛水扬梅中EGJ成分进行提取，证实了植物性生肌分子对于心肌细胞分化的促进作用，能够有效引导心肌细胞再生，对于心肌梗塞的治疗具有重要意义。由于口服植物性生肌分子的降低心肌梗塞药物风险、提高治疗有效度、取代心肌注射操作等尚在设想、研发阶段，因此本研究为相关工作指明了前进方向。可以肯定的是，植物源性生肌因子的方法对于心肌梗塞治疗相关研究来说，是一个巨大进步，但目前需要做的是通过更多改进将其推广到临床应用上。在下一步的工作当中，我们将对植物性生肌因子在机体内的药代动力学、药效学和详细代谢影响做系统性研究，并且在其优越修复机制的特点上，试图将其进一步应用于慢性缺血性心脏病及陈旧性心肌梗塞上。
参考文献
[1] 孙燕燕，杨树标，路巍.治疗急性心肌梗塞泵衰竭40例疗效观察[J].齐鲁医学杂志，2010，（04）.
[2] 张承宗，郑成环，赵文鼎，傅文栋，李广平，金晓静，蔡金荣，李立丰，刘洪梅.心肌梗塞患者长期应用美多心安随访结果[J].中国康复医学杂志，2011，（06）.
[3] 杨回珍，刘家娴，李佛庭.心肌梗塞和心肌缺血特征对比分析[A].第二届全国心功能学术研讨会论文摘要汇编[C].2010.