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摘要：目的： 构建及原核表达肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人热休克蛋白70（HSP70）的融合基因。方法： 采用加端PCR方法， 将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端； 将融合基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中， 构建重组质粒pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70。经限制性内切酶BamH I、 Xho I双酶切鉴定及序列测定后， 转化E.coli BL21（DE3）， 经IPTG诱导表达融合蛋白， SDSPAGE检测表达结果。结果： 应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段， 序列测定结果证实， EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端。经BamH I、 Xho I酶切鉴定证实， 融合基因成功地克隆到原核表达载体pET28a（+）上； 转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导后， SDSPAGE分析发现在相对分子质量（Mr）约72000处有表达量明显增多的蛋白条带。结论： 成功地构建并表达了肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70的融合基因。
关键字：肝肿瘤/免疫学抗原肿瘤/遗传学表位热休克蛋白类70/遗传学基因表达
原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一。近几十年来， 尽管诊疗手段有了很大的进步， 但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一， 尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了MAGE1编码的由HLAB7提呈的肝癌抗原肽EPVTKAEML， 将其负载DC细胞， 在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应[1， 2]。为加强EPVTKAEML的免疫原性， 选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的HSP70为载体， 制备了EPVTKAEML与HSP70的融合蛋白， 为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性CTL， 寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 菌种E.coli BL21（DE3）由本室保存。原核表达载体pET28a（+）、 含HSP70基因全长片段的质粒 pCDNA3.1（+）/HSP70 （本校病理学教研室惠赠）， B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒（北京博大泰克公司）， Pyrobest DNA聚合酶、 T4连接酶、 限制性内切酶（TaKaRa公司）。
1.2 方法
1.2.1 用加端PCR方法构建EPVTKAEML与HSP70的融合基因 根据HSP70基因的核苷酸序列， 结合引物设计的原则， 设计引物， 在下游引物的5′端加入EPVTKAEML的核苷酸序列（共27个碱基）， 并在引物两端分别加入BamH I及Xho I酶切位点， 引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物： 5′CGG GAT CCA TGG CCA AAG CCG CGG CG3′， 下游引物： 5′CGA CTC GAG TTA CAG CAT TTC AGC TTT GGT AAC CGG TTC ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG3′。此序列中2处下划线部分分别为BamH I和Xho I， 黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽EPVTKAEML。反应条件为： 94℃预变性5 min， 94℃ 变性1 min， 58℃退火50 s， 72℃延伸3 min， 循环1次； 94℃变性1 min， 68℃退火及延伸3 min， 循环28次， 另加72℃延伸7 min， PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收。
1.2.2 重组质粒pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70的构建 用BamH I和EcoR I双酶切PCR扩增的融合基因EPVTKAEMLHSP70和表达载体pET28a（+）， 进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体， 以T4 DNA连接酶于16℃连接16 h， 转化感受态E.coli BL21（DE3）。卡那平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒， 以BamH I和EcoR I酶切和DNA序列分析鉴定阳性克隆。
1.2.3 融合基因EPVTKAEMLHSP70的诱导表达 将含pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70质粒的E.coli BL21（DE3）接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培养液中， 37℃震荡培养至A≈0.5， 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L， 继续培养3 h取出， 离心收菌， 加入SDSPAGE上样缓冲液， 混匀， 煮沸5 min， 12000 r/min离心10 min， 取上清做SDSPAGE， 考马斯亮蓝R250染色。
2 结果
2.1 肝癌抗原肽与HSP70融合基因的构建 以pCDNA3.1（+）/HSP70质粒为模板， 在下游引物的5′末端引入27个碱基的模拟表位基因， 经加端PCR使EPVTKAEML与HSP70的序列连接起来， 获得了2.0 kb的融合基因， 与预期片段的大小一致（图1）
图1 EPVTKAEMLHSP70融合基因PCR结果的琼脂糖凝胶电泳（略）
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of EPVTKAEMLHSP70 fusion gene PCR product
M： DNA marker； 1： EPVTKAEMLHSP70 （2.0 kb）.
2.2 融合基因的序列分析 PCR构建的融合基因克隆到pET28a（+）载体上， 选取1株酶切鉴定正确的克隆， 用双脱氧终止法测定序列。序列分析的结果表明， 肝癌抗原肽基因序列已连接于HSP70的3′末端， HSP70序列与基因库中的一致。在HSP70的5′端有起始码， 抗原肽基因序列的3′端有终止码。 2.3 原核表达载体pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70的鉴定 用BamHI、 XhoI从pET28a（+）载体上消化释放出2.0kb大小的片段（图2）。
图2 pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70重组质粒的酶切鉴定（略）
Fig 2 Identification of recombinant pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70
M： DNA marker； 1： pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 digested by BamH I and Xho I.
2.4 融合基因在大肠杆菌中的表达 重组的表达载体pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70在BL21（DE3）菌中经IPTG诱导表达， SDSPAGE（图3）显示经IPTG诱导的重组载体在Mr 72000有表达明显增多的蛋白条带， 与预期大小一致， 未经诱导的重组载体未见此现象。
图3 原核表达EPVTKAEMLHSP70融合蛋白SDSPAGE电泳分析（略）
Fig 3 Analysis of prokaryotic expression EPVTKAEMLHSP70 by SDSPAGE
M： Protein marker； 1： The split supernatant of pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 bacterial before IPTG induction； 2： The split supernatant of pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 bacterial after IPTG induction.
3 讨论
随着对抗原加工和提呈过程的了解， 人们发现T细胞识别抗原实际上只是识别一段能与MHC分子相结合的多肽[3]。因而如果用相应多肽作为肿瘤疫苗就能够直接引起机体T细胞的反应。目前许多能被T细胞识别的肿瘤抗原多肽已确定， 这也使得用多肽作为肿瘤疫苗成为可能。最早进入临床试验的多肽疫苗是用于黑色素瘤的多肽疫苗， 在接受治疗的患者中大约10%～30%会有一定的效果[4]。Rosenberg等[5]在一项研究中证实， 用黑色素瘤分化抗原gpl00的多肽疫苗和白细胞介素2（IL2）免疫16名黑色素瘤患者， 其中6名（38%）出现了肿瘤的缩小。陈红松等[6]研究发现， 肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗能够成功诱导部分中国肝癌患者特异的、 显著的抗肝癌免疫应答， 有效杀伤手术后残留的癌细胞， 降低手术后肝癌的转移和复发， 可能是一种有效的肝癌辅助治疗手段。肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗已经获得国家食品药品监督管理局批准进行Ⅰ期临床试验。
肿瘤肽疫苗的明显缺点是免疫原性太弱， 研究发现， HSP70可以在体外以非共价键的形式与多肽表位结合， 形成HSP70肽复合物， 也可以采用基因定点克隆的方法， 使多肽通过共价键结合于HSP70， 可更有效地激活T细胞， 极大地增强辅助性T细胞的功能， 从而提高表位疫苗的免疫效能。这两种方法均可激活CD8+T细胞， 产生多肽特异性的CTL反应， 而后者因不受肿瘤标本量的限制， 实用性更强[7]。本研究我们采用加端PCR方法将肝癌抗原肽EPVTKAEML的cDNA序列简便、 快捷的融合到HSP70的3′末端， 经酶切鉴定及测序证实， 融合基因构建成功， 抗原肽EPVTKAEML与HSP70基因的开放读框正确， 并在大肠杆菌中表达出与预期Mr大小一致的蛋白， 该表达产物可用于抗肝癌多肽疫苗的研究。
【参考文献】
[1] 郭爱林， 隋延仿， 叶 菁， 等. 一个新的MAGE1表位为肝癌细胞表面HLAB7分子递呈[J]. 中国免疫学杂志， 2001， 17（5）： 252-255.
[2] 曲 萍， 曹云新， 隋延仿， 等. human负载肝癌排斥抗原肽的树突状细胞瘤苗活化T细胞的应用[J]. 中国药理学通报， 2004， 20（4）： 389-392.
[3] Parmiani G， Castelli C， Dalerba P， et al. Cancer immunotherapy with peptidebased vaccines： what have we achieved？ Where are we going？[J]. J Natl Cancer Inst， 2002， 94（11）： 805-818.
[4] Talebi T， Weber JS. Peptide vaccine trials for melanoma： preclinical background and clinical results[J]. Sem Cancer Biol， 2003， 13： 431-438.
[5] Roenberg SA. Progress in tumor immunology and immunotherapy[J]. Nature， 2001， 411（17）： 380-384.
[6] 陈红松， 张华刚， 梅铭惠， 等. NYESO1和MAGEA3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究[J]. 免疫学杂志， 2006， 22（6）： 659-663.
[7] 孙培明， 王志亮. 热应激蛋白70肽疫苗研究进展[J]. 中国兽医杂志， 2006， 42（12）： 43-44
关键字：肝肿瘤/免疫学抗原肿瘤/遗传学表位热休克蛋白类70/遗传学基因表达
原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一。近几十年来， 尽管诊疗手段有了很大的进步， 但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一， 尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了MAGE1编码的由HLAB7提呈的肝癌抗原肽EPVTKAEML， 将其负载DC细胞， 在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应[1， 2]。为加强EPVTKAEML的免疫原性， 选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的HSP70为载体， 制备了EPVTKAEML与HSP70的融合蛋白， 为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性CTL， 寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 菌种E.coli BL21（DE3）由本室保存。原核表达载体pET28a（+）、 含HSP70基因全长片段的质粒 pCDNA3.1（+）/HSP70 （本校病理学教研室惠赠）， B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒（北京博大泰克公司）， Pyrobest DNA聚合酶、 T4连接酶、 限制性内切酶（TaKaRa公司）。
1.2 方法
1.2.1 用加端PCR方法构建EPVTKAEML与HSP70的融合基因 根据HSP70基因的核苷酸序列， 结合引物设计的原则， 设计引物， 在下游引物的5′端加入EPVTKAEML的核苷酸序列（共27个碱基）， 并在引物两端分别加入BamH I及Xho I酶切位点， 引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物： 5′CGG GAT CCA TGG CCA AAG CCG CGG CG3′， 下游引物： 5′CGA CTC GAG TTA CAG CAT TTC AGC TTT GGT AAC CGG TTC ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG3′。此序列中2处下划线部分分别为BamH I和Xho I， 黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽EPVTKAEML。反应条件为： 94℃预变性5 min， 94℃ 变性1 min， 58℃退火50 s， 72℃延伸3 min， 循环1次； 94℃变性1 min， 68℃退火及延伸3 min， 循环28次， 另加72℃延伸7 min， PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收。
1.2.2 重组质粒pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70的构建 用BamH I和EcoR I双酶切PCR扩增的融合基因EPVTKAEMLHSP70和表达载体pET28a（+）， 进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体， 以T4 DNA连接酶于16℃连接16 h， 转化感受态E.coli BL21（DE3）。卡那平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒， 以BamH I和EcoR I酶切和DNA序列分析鉴定阳性克隆。
1.2.3 融合基因EPVTKAEMLHSP70的诱导表达 将含pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70质粒的E.coli BL21（DE3）接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培养液中， 37℃震荡培养至A≈0.5， 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L， 继续培养3 h取出， 离心收菌， 加入SDSPAGE上样缓冲液， 混匀， 煮沸5 min， 12000 r/min离心10 min， 取上清做SDSPAGE， 考马斯亮蓝R250染色。
2 结果
2.1 肝癌抗原肽与HSP70融合基因的构建 以pCDNA3.1（+）/HSP70质粒为模板， 在下游引物的5′末端引入27个碱基的模拟表位基因， 经加端PCR使EPVTKAEML与HSP70的序列连接起来， 获得了2.0 kb的融合基因， 与预期片段的大小一致（图1）
图1 EPVTKAEMLHSP70融合基因PCR结果的琼脂糖凝胶电泳（略）
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of EPVTKAEMLHSP70 fusion gene PCR product
M： DNA marker； 1： EPVTKAEMLHSP70 （2.0 kb）.
2.2 融合基因的序列分析 PCR构建的融合基因克隆到pET28a（+）载体上， 选取1株酶切鉴定正确的克隆， 用双脱氧终止法测定序列。序列分析的结果表明， 肝癌抗原肽基因序列已连接于HSP70的3′末端， HSP70序列与基因库中的一致。在HSP70的5′端有起始码， 抗原肽基因序列的3′端有终止码。 2.3 原核表达载体pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70的鉴定 用BamHI、 XhoI从pET28a（+）载体上消化释放出2.0kb大小的片段（图2）。
图2 pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70重组质粒的酶切鉴定（略）
Fig 2 Identification of recombinant pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70
M： DNA marker； 1： pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 digested by BamH I and Xho I.
2.4 融合基因在大肠杆菌中的表达 重组的表达载体pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70在BL21（DE3）菌中经IPTG诱导表达， SDSPAGE（图3）显示经IPTG诱导的重组载体在Mr 72000有表达明显增多的蛋白条带， 与预期大小一致， 未经诱导的重组载体未见此现象。
图3 原核表达EPVTKAEMLHSP70融合蛋白SDSPAGE电泳分析（略）
Fig 3 Analysis of prokaryotic expression EPVTKAEMLHSP70 by SDSPAGE
M： Protein marker； 1： The split supernatant of pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 bacterial before IPTG induction； 2： The split supernatant of pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70 bacterial after IPTG induction.
3 讨论
随着对抗原加工和提呈过程的了解， 人们发现T细胞识别抗原实际上只是识别一段能与MHC分子相结合的多肽[3]。因而如果用相应多肽作为肿瘤疫苗就能够直接引起机体T细胞的反应。目前许多能被T细胞识别的肿瘤抗原多肽已确定， 这也使得用多肽作为肿瘤疫苗成为可能。最早进入临床试验的多肽疫苗是用于黑色素瘤的多肽疫苗， 在接受治疗的患者中大约10%～30%会有一定的效果[4]。Rosenberg等[5]在一项研究中证实， 用黑色素瘤分化抗原gpl00的多肽疫苗和白细胞介素2（IL2）免疫16名黑色素瘤患者， 其中6名（38%）出现了肿瘤的缩小。陈红松等[6]研究发现， 肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗能够成功诱导部分中国肝癌患者特异的、 显著的抗肝癌免疫应答， 有效杀伤手术后残留的癌细胞， 降低手术后肝癌的转移和复发， 可能是一种有效的肝癌辅助治疗手段。肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗已经获得国家食品药品监督管理局批准进行Ⅰ期临床试验。
肿瘤肽疫苗的明显缺点是免疫原性太弱， 研究发现， HSP70可以在体外以非共价键的形式与多肽表位结合， 形成HSP70肽复合物， 也可以采用基因定点克隆的方法， 使多肽通过共价键结合于HSP70， 可更有效地激活T细胞， 极大地增强辅助性T细胞的功能， 从而提高表位疫苗的免疫效能。这两种方法均可激活CD8+T细胞， 产生多肽特异性的CTL反应， 而后者因不受肿瘤标本量的限制， 实用性更强[7]。本研究我们采用加端PCR方法将肝癌抗原肽EPVTKAEML的cDNA序列简便、 快捷的融合到HSP70的3′末端， 经酶切鉴定及测序证实， 融合基因构建成功， 抗原肽EPVTKAEML与HSP70基因的开放读框正确， 并在大肠杆菌中表达出与预期Mr大小一致的蛋白， 该表达产物可用于抗肝癌多肽疫苗的研究。
【参考文献】
[1] 郭爱林， 隋延仿， 叶 菁， 等. 一个新的MAGE1表位为肝癌细胞表面HLAB7分子递呈[J]. 中国免疫学杂志， 2001， 17（5）： 252-255.
[2] 曲 萍， 曹云新， 隋延仿， 等. human负载肝癌排斥抗原肽的树突状细胞瘤苗活化T细胞的应用[J]. 中国药理学通报， 2004， 20（4）： 389-392.
[3] Parmiani G， Castelli C， Dalerba P， et al. Cancer immunotherapy with peptidebased vaccines： what have we achieved？ Where are we going？[J]. J Natl Cancer Inst， 2002， 94（11）： 805-818.
[4] Talebi T， Weber JS. Peptide vaccine trials for melanoma： preclinical background and clinical results[J]. Sem Cancer Biol， 2003， 13： 431-438.
[5] Roenberg SA. Progress in tumor immunology and immunotherapy[J]. Nature， 2001， 411（17）： 380-384.
[6] 陈红松， 张华刚， 梅铭惠， 等. NYESO1和MAGEA3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究[J]. 免疫学杂志， 2006， 22（6）： 659-663.
[7] 孙培明， 王志亮. 热应激蛋白70肽疫苗研究进展[J]. 中国兽医杂志， 2006， 42（12）： 43-44