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目的与意义:抗体介导的排斥反应是移植肾失功的关键因素,目前对于其免疫分子机制认识尚不充分,临床上对于ABMR的治疗仍停留在非特异性抑制或清除产生抗体的细胞或阻断已产生的抗体作用层面,靶向性差。滤泡辅助T细胞是一类促进B细胞成熟、形成抗体的CD4细胞。外泌体是一种小囊泡,由细胞装配和释放,参与譬如细胞迁移、抗原提呈、免疫应答、肿瘤侵袭等许多生物学过程。Tfh来源外泌体与B细胞分化以及与ABMR相关性尚无报道。肾移植术后,供者肾小球内皮细胞最先接触到受者免疫细胞,研究两者之间外泌体的传递对于研究移植排斥至关重要。移植肾进入体内后将立即激活受体的先天性免疫,大量的单核/巨噬细胞归巢和并浸润到移植物中。单核/巨噬细胞表面配体能作用于内皮细胞上受体,发挥粘附、促炎功能,因此其可作为一个有效模型,研究肾移植后免疫细胞同供体组织细胞之间外泌体传递。本课题在前期对Tfh细胞在ABMR中的作用机制研究的基础上,进一步研究其分泌的外泌体在ABMR的作用,检测CRAD患者循环CD4+CXCR5+外泌体,分析其与ABMR的相关性。并进一步分离Tfh细胞体外培养后获取Tfh细胞来源的外泌体,将其在SEB刺激下与B细胞共培养,分析其对B细胞增殖与分化的影响。不仅为阐明Tfh细胞辅助B细胞增殖和分化的机制提供了新的视角,而且为ABMR的预防和监测提供了新的途径。并且以Netrin-1作为一种分子模型来讨论神经分子对单核/巨噬细胞和肾小球内皮细胞信息交流的影响,为理解器官同种异体移植后神经、免疫和血管之间的相互作用和联系外泌体的传递提供新的见解。CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究方法:1、研究对象选择:选取在解放军总医院第八医学中心就诊的肾移植术后慢性移植肾失功(CRAD)患者作为研究对象,并选择同时期术后肾功正常患者做为对照组。2、标本的采集:入组的研究对象于清晨空腹收集液标本,ABMR组患者标本均为临床确诊ABMR针对治疗前及时收集血清标本。3、研究对象分组:依据2013年ABMR的Banff标准分两组,包括ABMR及非ABMR组。4、外泌体分离方法:利用聚合物沉淀法提取。5、鉴定外泌体:TEM鉴定外泌体形状和大小;NTA技术鉴定粒径和浓度;Western鉴定分子标志。6、流式检测:使用包被抗CD63抗体磁珠结合外泌体,应用流式细胞术检测CD4、CXCR5等表面标志:使用Invitrogen公司的Exosome-Human CD63分离/检测试剂,使外泌体和磁珠结合,应用流式检测CD4、CXCR5、CTLA-4、HLA-G,比较ABMR组患者与非ABMR组患者之间CD4+CXCR5+外泌体的差异,分析其与ABMR的相关性。7、收集临床资料:性别、年龄、肾移植术后的时间等和化验指标。8、数值数据记录为平均值土标准差(x±s)。应用SPSS 19.0对数据进行分析计算。使用双侧Wilcoxon秩和检验来比较临床资料。Spearman等级测试相关性和配对t检验比较实验数据。P<0.05设定为具备统计学差异。结果:1、外泌体的基本特点:TEM显示,分离的外泌体呈茶盘型/半球形,具有凹面,粒径50-100nm;NTA结果显示囊泡粒径约100nm;Western Blot检测外泌体蛋白表达;CD9、CD81及TSG101这三种标志蛋白在血清分离出的囊泡中均有表达。2、流式细胞仪比较各组受者血清分离的外泌体及其亚型的差异:CRAD组病例血清和移植肾功能正常病例血清CD4+CXCR5+外泌体比例无明显差异。在CRAD组中,CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体的比例高于对照组。CRAD患者进一步分为ABMR组和非ABMR组,组间CD4+CXCR5+外泌体比例无显著差异,而ABMR组CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体比例显著高于非ABMR组。3、流式检测Tfh细胞来源外泌体上HLA-G和CTLA-4水平:与对照组相比,CRAD组中HLA-G和CTLA-4的CD4+CXCR5+外泌体表达没有明显变化。CRAD患者中,ABMR组中CD4+CXCR5+外泌体上CTLA-4水平显著低于非ABMR组,但HLA-G水平差异不明显。结论:肾移植术后ABMR患者血清中CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体增加,提示其和ABMR有关。ABMR患者血CD4+CXCR5+外泌体表面CTLA-4水平明显降低。ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响方法:1、研究对象及分组:同第一部分。2、标本的采集:获取外周血,保存抗凝管中。3、分离PBMC:淋巴细胞分离液获取PBMC。4、分选滤泡辅助T细胞:磁珠法先阴性分选标本CD4细胞;再阳性分选CD4+CXCR5+Tfh。5、培养滤泡辅助T细胞:将Tfh加入含10%去除外泌体胎牛血清RPMI1640培养基48h。6、分离Tfh细胞来源的外泌体:利用聚合物沉淀法提取。7、流式细胞术检測外泌体中HLA-G和CTLA-4的表达。8、外泌体示踪实验:使用PKH67进行染色,然后加至B细胞培养,验证其是否被吞噬。9、将外泌体加入耗尽Tfh细胞的淋巴细胞培养基共培养48h,流式细胞术测量其中B细胞(CD3-CD19+细胞)和浆细胞(CD3-CD19-CD38+细胞)的比例。并用ELISA检测Ig浓度。结果:1、在ABMR组患者中,Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G与非ABMR组无差异;2、Tfh细胞来源的外泌体可以被B细胞吞噬;3、ABMR患者Tfh来源外泌体刺激B细胞分化、扩增,相对于非ABMR组,B细胞和浆细胞的比例分别增加87.52%和110.2%;4、ABMR患者中Tfh来源外泌体刺激IgG和IgA产生,但对IgM产生没有显著影响。结论:1、Tfh来源外泌体可以被B细胞吞噬;2、ABMR患者Tfh来源外泌体促进B细胞分化、增殖,并且能够增加IgG、IgA抗体生成;3、ABMR组患者Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G的表达与非ABMR组无差异,推测外泌体可能是CTLA-4发挥免疫抑制效应的重要载体。单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞方法:1、获取志愿者PBMC,分选单核/巨噬细胞;2、与丝裂霉素C处理过的肾小球内皮细胞以及来自相同志愿者的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养(MLC);3、更换培养基继续培养单核/巨噬细胞,分组加入Netrin-1及外泌体抑制剂GW4869,流式细胞术检测单核/巨噬细胞的表型及HLA-G蛋白的表达;4、MLC48小时后,从单核/巨噬细胞中除去刺激因子,然后将细胞加入到室的上部,并且预先在室的下部放进肾小球内皮细胞。培养48h后获取下部内皮细胞;5、流式检测内皮细胞表面HLA-G及其受体、黏附分子水平;6、聚合物沉淀法试剂盒分离单核/巨噬细胞来源的外泌体,示踪实验检测是否被内皮细胞吞噬;7、外泌体同内皮细胞共培养,流式检测HLA-G蛋白水平。结果:Netrin-1促进了单核/巨噬细胞的表型转化和HLA-G的表达,神经突起导向因子Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞通过外泌体的递送促进内皮细胞中HLA-G及其受体的表达,单核/巨噬细胞在Netrin-1刺激后外泌体HLA-G表达的显著增强;使用抗体密封外泌体上的HLA-G,可以显著抑制Netrin-1组中内皮细胞的HLA-G的表达。神经突起导向因子Netrin-1促进单核/巨噬细胞来源外泌体HLA-G靶向递送至内皮细胞。Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞抑制内皮细胞中促炎分子表达。结论:1、MLC诱导单核/巨噬细胞向M1极化,增强其HLA-G表达,神经突起导向因子Netrin-1能部分逆转这种极化,进一步促进单核/巨噬细胞的HLA-G表达;2、单核/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至进内皮细胞,神经突起导向因子Netrin-1能促进这种传递方式。