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摘要[目的] 研究水龟虫多糖的提取条件。[方法] 分别采用3种方法对水龟虫多糖进行了提取，采用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定，对比不同提取方法中多糖的含量差异。[结果] 热水浸提、碱提法和酶解法3种方法对水龟虫多糖提取所得多糖的含量分别为153%、2.61%、2.66%。[结论] 通过试验确定了酶解法为水龟虫多糖的提取最佳方法。
关键词水龟虫多糖；提取方法；含量测定；条件因素
中图分类号S186；X174文献标识码A文章编号0517-6611（2016）01-178-02
Abstract[Objective] To study conditions for extracting polysaccharide from Hydrophilus acuminatus. [Method] Three methods were adopted to extract polysaccharide from Hydrophilus acuminatus， polysaccharide content was determined by phenol sulfuric acid method， and polysaccharide contents extracted by different methods were compared. [Result] The polysaccharide content in Hydrophilus acuminatus extracted by hot water extraction， alkali extraction and enzymatic hydrolysis was 1.53%， 2.61%， 2.66%， respectively. [Conclusion] Enzymatic hydrolysis is the best method for extracting polysaccharide from Hydrophilus acuminatus.
Key wordsHydrophilus acuminatus polysaccharide； Extraction method； Determination of content； Condition factors
水龜虫科Hydrophilidae是昆虫纲Insecta有翅亚纲Pterygota鞘翅目Coleoptera多食亚目Polyphaga昆虫的总称，也称牙甲科。我国已记载的水龟虫昆虫在80种以上，其中大型种类包括尖突水龟虫Hydrophilus acuminatus，又名尖突巨牙甲，它广泛分布在湖泊、池塘、鱼塘及有水草的小溪或水沟中[1]。水龟虫地理分布范围广，国内主要分布于东北三省、北京、天津等地，南到海南、西到西藏也有少量分布的记录，国外在日本、朝鲜、缅甸等国有其分布的记载。水龟虫的食物螺蛳是人畜吸虫宿主，因此将水龟虫划为有益昆虫。生活在鱼池中水龟虫幼虫也有捕食鱼苗的情况，因此它也是危害塘鱼的一种常见害虫。
水龟虫可作为药材应用于我国中药领域，主治儿童遗尿。有关国内的水龟虫文献资料记载，学者的研究多集中在对水龟虫的生态学、行为习性、发生规律及保护技术等领域，且以分类学和生态学研究为主[2-4]，而对水龟虫药用成分研究开展较少。人类对于水龟虫应用多在食用方面，其体内含有丰富的蛋白质、粗脂肪及矿物质，可作为人类的补钙食品，而对于其保护和开发利用更是没有深入研究[5]。
参考国内昆虫多糖研究的相关文献[6-9]，该试验分别采用热水浸提、稀碱液提取、酶解提取3种提取方法对水龟虫多糖进行提取，采用苯酚-硫酸法测定水龟虫多糖的含量，通过比较各种方法对水龟虫多糖含量的影响，确定了适合水龟虫多糖的提取方法，为建立高效、实用的水龟虫多糖提取途径提供技术参考，也为后续水龟虫的药用价值开发提供可靠的科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
水龟虫药材邮购于安徽省中药材同仁堂品质店，经佳木斯大学生命科学学院罗志文副教授鉴定为尖突水龟虫Hydrophilus acuminatus，原药材及样品现保存于佳木斯大学应用昆虫研究所。
1.2样品预处理
采用精细中药粉碎机对干燥后的水龟虫原药材进行粉碎，粉碎后过50目筛，放于室温下干燥后保存备用。
预处理采用石油醚去除药材中的脂溶性杂质成分，采用95%乙醇去除单糖、低聚糖等干扰性成分。试验按照料液比为1∶3（W/V）的量加入石油醚，25 ℃常温下浸泡12 h后，抽滤，采用旋转蒸发仪浓缩回收石油醚，重复3次，并于50 ℃恒温箱干燥后保存备用。
1.3试验方案
1.3.1多糖的提取工艺流程。
原料→粉碎→预处理→过滤→滤渣→室温晾干→提取→纱布过滤→离心→上清液浓缩→乙醇沉淀→离心→溶剂洗涤→低温干燥→多糖样品。
1.3.2多糖提取试验。
1.3.2.1水提法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末25 g，加入5倍量的蒸馏水，煮沸1 h，过滤，滤渣重复水提1次，合并滤液，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，加入3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。
1.3.2.2碱提法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末9份，各25 g，以料液比1∶10的量加入稀碱液，设计碱液浓度为0150、0.020、0.025 mol/L；恒温水浴温度分别为60、70、80 ℃；提取时间为1、2、3 h；重复1次，合并提取液，4层纱布过滤，滤液用盐酸调pH 7.0，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。 1.3.2.3酶解法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末9份，各25 g，加入10倍量的蒸馏水，设计木瓜蛋白酶用量为100、150、200 μg/g，恒温水浴温度分别为45、50、60 ℃；提取时间为1、2、3 h；试验完成后，迅速升温至100 ℃下酶灭活5 min，4层纱布过滤，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。
1.3.3多糖含量测定。
1.3.3.1原理。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖作为标准品制作标准曲线，原理是苯酚试剂可与游离单糖或寡糖、己糖、糖醛酸以及糖的甲基衍生物发生显色反应，己糖在490 nm波长（戊糖及糖醛酸在480 nm）处有最大吸收峰，且吸收值与含糖量呈线性关系。
1.3.3.2标准曲线制作。
称取105 ℃干燥的葡萄糖粉末92.9 mg，在100 mL容量瓶中定容。吸取標准葡萄糖溶液5、10、15、20、25 μL，分别置于比色管中，加蒸馏水使体积达1.0 mL，再加入5%苯酚溶液，摇匀，快速加入3.25 mL浓硫酸，室温显色25 min。另取蒸馏水1.0 mL，加入苯酚和浓硫酸，作为空白对照。在波长490 nm处测定样品中的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制出葡萄糖标准曲线（图1），得回归方程y=0.009 2x-0.006 2（R2=0.997 7）。
1.3.3.3样品多糖含量测定。
吸取待测样品溶液0.5 mL，加入蒸馏水至1.0 mL，按“1.3.3.2”操作步骤测定吸光度，并从标准曲线上查得样品溶液的多糖含量。
2结果与分析
2.1热水浸提法
试验采用热水浸提法，得到的水龟虫多糖经苯酚-硫酸法测定，得出多糖含量为1.53%。
2.2碱液提取
样品分为9组，每组按料液比1∶10加入稀碱液提取水龟虫多糖，苯酚-硫酸法测定多糖的含量。从表1可以看出，与热水浸提法比较，使用稀碱液提取的水龟虫多糖含量有了不同程度的提高，各因素对试验指标多糖含量的影响依次为碱液浓度>提取温度>提取时间，稀碱液提取水龟虫多糖的最佳浓度为0.020 mol/L，试验提取温度60 ℃，提取时间为2 h。
按这个最佳试验条件对水龟虫重复试验3次，测定多糖含量，结果发现稀碱液提取的粗多糖含量平均为2.61%。
2.3酶解法
由表2可见，与热水浸提法相比，酶解法提取水龟虫多糖含量也高于水提法，各因素对多糖含量的影响依次为酶用量>提取温度>提取时间，试验的最佳条件为温度50 ℃、酶用量100 μg/g、提取时间2 h。
按这个最佳试验条件对水龟虫重复试验3次，测定多糖含量，得出酶解法提取的粗多糖含量平均为2.66%。
3结论与讨论
采用水提法、碱液提取法和酶解法3种方法对水龟虫多糖的提取进行了研究，所得多糖的含量分别为1.53%、261%、2.66%。从提取的多糖含量来看，水提法的含量最低，酶解法的最高，碱液提取法提取的多糖含量介于两者之间，以糖含量来区分碱液提取和酶提取的优劣不明显；而从环保节约成本方面考虑，碱液法易污染环境，废液必须经过处理才能排出，酶解法的溶剂和能源消耗较少，且温度过高酶失活。所以酶解法综合性好，建议水龟虫多糖采用酶解的方法进行提取。
通过酶解法来提取水龟虫多糖，可以获得非常理想的优质水龟虫多糖，具有成本低、无污染、效率高等优点，可为笔者后期开展水龟虫多糖的分离纯化、多糖成分分析及对荷瘤小鼠抗肿瘤活性等试验积累试验数据，也为将来开发优良的昆虫多糖药物及功能性食品服务。
参考文献
[1] 王晓玲.尖突水龟虫形态结构的观察[J].东北林业大学学报，2011，39（11）：141-142.
[2] 聂传朋，李焰焰，郑哲民.酯酶同工酶在鞘翅目昆虫分类中的应用简介[J].昆虫知识，2005，42（5）：599-601.
[3] 李晓明，纪 磊，邓道贵.淮北煤矿区塌陷湖水生昆虫群落结构的季节性变化[J].生物学杂志，2015，34（5）：1359-1366.
[4] 李晓光，董本春，张立.吉林省稻田昆虫群落多样性调查[J].农业与技术，1999，19（5）：7-9.
[5] 郭良珍，王润莲，梁爱萍，等.长须水龟虫的营养成分分析与评价[J].昆虫知识，2003，40（4）：366-368.
[6] 罗志文，刘娟，张聪颖，等.地鳖虫多糖提取工艺的优化研究[J].安徽农业科学，2012，40（28）：13978-13979.
[7] 方耀敏，李晓庆，赵也，等.光肩星天牛多糖最佳提取工艺试验研究[J].黑龙江医药科学，2013，36（5）：2-4.
[8] 罗志文，刘娟，赵永勋.酶解法提取地鳖虫多糖工艺的优化[J].黑龙江农业科学，2018（8）：102-104.
[9] 赖泰君，刘旭辉，孙建华，等.蚕蛹多糖提取工艺的研究[J].中药材，2009，32（7）：1137-1139.
关键词水龟虫多糖；提取方法；含量测定；条件因素
中图分类号S186；X174文献标识码A文章编号0517-6611（2016）01-178-02
Abstract[Objective] To study conditions for extracting polysaccharide from Hydrophilus acuminatus. [Method] Three methods were adopted to extract polysaccharide from Hydrophilus acuminatus， polysaccharide content was determined by phenol sulfuric acid method， and polysaccharide contents extracted by different methods were compared. [Result] The polysaccharide content in Hydrophilus acuminatus extracted by hot water extraction， alkali extraction and enzymatic hydrolysis was 1.53%， 2.61%， 2.66%， respectively. [Conclusion] Enzymatic hydrolysis is the best method for extracting polysaccharide from Hydrophilus acuminatus.
Key wordsHydrophilus acuminatus polysaccharide； Extraction method； Determination of content； Condition factors
水龜虫科Hydrophilidae是昆虫纲Insecta有翅亚纲Pterygota鞘翅目Coleoptera多食亚目Polyphaga昆虫的总称，也称牙甲科。我国已记载的水龟虫昆虫在80种以上，其中大型种类包括尖突水龟虫Hydrophilus acuminatus，又名尖突巨牙甲，它广泛分布在湖泊、池塘、鱼塘及有水草的小溪或水沟中[1]。水龟虫地理分布范围广，国内主要分布于东北三省、北京、天津等地，南到海南、西到西藏也有少量分布的记录，国外在日本、朝鲜、缅甸等国有其分布的记载。水龟虫的食物螺蛳是人畜吸虫宿主，因此将水龟虫划为有益昆虫。生活在鱼池中水龟虫幼虫也有捕食鱼苗的情况，因此它也是危害塘鱼的一种常见害虫。
水龟虫可作为药材应用于我国中药领域，主治儿童遗尿。有关国内的水龟虫文献资料记载，学者的研究多集中在对水龟虫的生态学、行为习性、发生规律及保护技术等领域，且以分类学和生态学研究为主[2-4]，而对水龟虫药用成分研究开展较少。人类对于水龟虫应用多在食用方面，其体内含有丰富的蛋白质、粗脂肪及矿物质，可作为人类的补钙食品，而对于其保护和开发利用更是没有深入研究[5]。
参考国内昆虫多糖研究的相关文献[6-9]，该试验分别采用热水浸提、稀碱液提取、酶解提取3种提取方法对水龟虫多糖进行提取，采用苯酚-硫酸法测定水龟虫多糖的含量，通过比较各种方法对水龟虫多糖含量的影响，确定了适合水龟虫多糖的提取方法，为建立高效、实用的水龟虫多糖提取途径提供技术参考，也为后续水龟虫的药用价值开发提供可靠的科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
水龟虫药材邮购于安徽省中药材同仁堂品质店，经佳木斯大学生命科学学院罗志文副教授鉴定为尖突水龟虫Hydrophilus acuminatus，原药材及样品现保存于佳木斯大学应用昆虫研究所。
1.2样品预处理
采用精细中药粉碎机对干燥后的水龟虫原药材进行粉碎，粉碎后过50目筛，放于室温下干燥后保存备用。
预处理采用石油醚去除药材中的脂溶性杂质成分，采用95%乙醇去除单糖、低聚糖等干扰性成分。试验按照料液比为1∶3（W/V）的量加入石油醚，25 ℃常温下浸泡12 h后，抽滤，采用旋转蒸发仪浓缩回收石油醚，重复3次，并于50 ℃恒温箱干燥后保存备用。
1.3试验方案
1.3.1多糖的提取工艺流程。
原料→粉碎→预处理→过滤→滤渣→室温晾干→提取→纱布过滤→离心→上清液浓缩→乙醇沉淀→离心→溶剂洗涤→低温干燥→多糖样品。
1.3.2多糖提取试验。
1.3.2.1水提法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末25 g，加入5倍量的蒸馏水，煮沸1 h，过滤，滤渣重复水提1次，合并滤液，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，加入3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。
1.3.2.2碱提法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末9份，各25 g，以料液比1∶10的量加入稀碱液，设计碱液浓度为0150、0.020、0.025 mol/L；恒温水浴温度分别为60、70、80 ℃；提取时间为1、2、3 h；重复1次，合并提取液，4层纱布过滤，滤液用盐酸调pH 7.0，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。 1.3.2.3酶解法。
称取经过预处理的水龟虫干燥粉末9份，各25 g，加入10倍量的蒸馏水，设计木瓜蛋白酶用量为100、150、200 μg/g，恒温水浴温度分别为45、50、60 ℃；提取时间为1、2、3 h；试验完成后，迅速升温至100 ℃下酶灭活5 min，4层纱布过滤，在50 ℃下旋转蒸发将滤液浓缩至适当的体积，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏过夜，离心后沉淀用无水乙醇洗涤脱水2次，低温干燥得粗多糖，测定水龟虫多糖含量。
1.3.3多糖含量测定。
1.3.3.1原理。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖作为标准品制作标准曲线，原理是苯酚试剂可与游离单糖或寡糖、己糖、糖醛酸以及糖的甲基衍生物发生显色反应，己糖在490 nm波长（戊糖及糖醛酸在480 nm）处有最大吸收峰，且吸收值与含糖量呈线性关系。
1.3.3.2标准曲线制作。
称取105 ℃干燥的葡萄糖粉末92.9 mg，在100 mL容量瓶中定容。吸取標准葡萄糖溶液5、10、15、20、25 μL，分别置于比色管中，加蒸馏水使体积达1.0 mL，再加入5%苯酚溶液，摇匀，快速加入3.25 mL浓硫酸，室温显色25 min。另取蒸馏水1.0 mL，加入苯酚和浓硫酸，作为空白对照。在波长490 nm处测定样品中的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制出葡萄糖标准曲线（图1），得回归方程y=0.009 2x-0.006 2（R2=0.997 7）。
1.3.3.3样品多糖含量测定。
吸取待测样品溶液0.5 mL，加入蒸馏水至1.0 mL，按“1.3.3.2”操作步骤测定吸光度，并从标准曲线上查得样品溶液的多糖含量。
2结果与分析
2.1热水浸提法
试验采用热水浸提法，得到的水龟虫多糖经苯酚-硫酸法测定，得出多糖含量为1.53%。
2.2碱液提取
样品分为9组，每组按料液比1∶10加入稀碱液提取水龟虫多糖，苯酚-硫酸法测定多糖的含量。从表1可以看出，与热水浸提法比较，使用稀碱液提取的水龟虫多糖含量有了不同程度的提高，各因素对试验指标多糖含量的影响依次为碱液浓度>提取温度>提取时间，稀碱液提取水龟虫多糖的最佳浓度为0.020 mol/L，试验提取温度60 ℃，提取时间为2 h。
按这个最佳试验条件对水龟虫重复试验3次，测定多糖含量，结果发现稀碱液提取的粗多糖含量平均为2.61%。
2.3酶解法
由表2可见，与热水浸提法相比，酶解法提取水龟虫多糖含量也高于水提法，各因素对多糖含量的影响依次为酶用量>提取温度>提取时间，试验的最佳条件为温度50 ℃、酶用量100 μg/g、提取时间2 h。
按这个最佳试验条件对水龟虫重复试验3次，测定多糖含量，得出酶解法提取的粗多糖含量平均为2.66%。
3结论与讨论
采用水提法、碱液提取法和酶解法3种方法对水龟虫多糖的提取进行了研究，所得多糖的含量分别为1.53%、261%、2.66%。从提取的多糖含量来看，水提法的含量最低，酶解法的最高，碱液提取法提取的多糖含量介于两者之间，以糖含量来区分碱液提取和酶提取的优劣不明显；而从环保节约成本方面考虑，碱液法易污染环境，废液必须经过处理才能排出，酶解法的溶剂和能源消耗较少，且温度过高酶失活。所以酶解法综合性好，建议水龟虫多糖采用酶解的方法进行提取。
通过酶解法来提取水龟虫多糖，可以获得非常理想的优质水龟虫多糖，具有成本低、无污染、效率高等优点，可为笔者后期开展水龟虫多糖的分离纯化、多糖成分分析及对荷瘤小鼠抗肿瘤活性等试验积累试验数据，也为将来开发优良的昆虫多糖药物及功能性食品服务。
参考文献
[1] 王晓玲.尖突水龟虫形态结构的观察[J].东北林业大学学报，2011，39（11）：141-142.
[2] 聂传朋，李焰焰，郑哲民.酯酶同工酶在鞘翅目昆虫分类中的应用简介[J].昆虫知识，2005，42（5）：599-601.
[3] 李晓明，纪 磊，邓道贵.淮北煤矿区塌陷湖水生昆虫群落结构的季节性变化[J].生物学杂志，2015，34（5）：1359-1366.
[4] 李晓光，董本春，张立.吉林省稻田昆虫群落多样性调查[J].农业与技术，1999，19（5）：7-9.
[5] 郭良珍，王润莲，梁爱萍，等.长须水龟虫的营养成分分析与评价[J].昆虫知识，2003，40（4）：366-368.
[6] 罗志文，刘娟，张聪颖，等.地鳖虫多糖提取工艺的优化研究[J].安徽农业科学，2012，40（28）：13978-13979.
[7] 方耀敏，李晓庆，赵也，等.光肩星天牛多糖最佳提取工艺试验研究[J].黑龙江医药科学，2013，36（5）：2-4.
[8] 罗志文，刘娟，赵永勋.酶解法提取地鳖虫多糖工艺的优化[J].黑龙江农业科学，2018（8）：102-104.
[9] 赖泰君，刘旭辉，孙建华，等.蚕蛹多糖提取工艺的研究[J].中药材，2009，32（7）：1137-1139.